健脾補腎方對再生障礙性貧血大鼠骨髓造血功能的影響及機制研究

呂麗麗 張琳琳 曹宇峰 王磊 邊月平

Email:1035429145@qq.com

【摘要】 目的觀察健脾補腎方對再生障礙性貧血(AA)大鼠骨髓造血功能的影響，并從自噬角度探討其治療機制。方法40只SPF級 Wistar大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組和健脾補腎方組，每組10只。除空白組外，其余3組采用腹腔注射氟尿嘧啶和灌胃馬利蘭溶解液的方法制作AA大鼠模型。造模成功后，健脾補腎方組灌胃給予健脾補腎方，陽性對照組灌胃給予司坦唑醇混懸液，空白組和模型組灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)給藥2周。計數(shù)2組外周血細胞和骨髓有核細胞數(shù)，并檢測2組外周血T淋巴細胞亞群、血清細胞因子、骨髓細胞周期、增殖指數(shù)(PI)及自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達。結(jié)果陽性對照組和健脾補腎方組外周血Hb、Ret、WBC、PLT、CD3+、CD4+、Treg細胞比例、CD4+/CD8+、血清IL-11水平、骨髓紅系比例、粒系比例、巨核細胞數(shù)、骨髓細胞S期和G2/M期細胞比例、PI及LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表達均明顯高于模型組，外周血CD8+細胞比例、血清IL-2、TNF-α水平、骨髓淋巴細胞比例、骨髓細胞G0/G1期細胞比例及caspase-3、PARP蛋白表達均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論健脾補腎方能夠促進AA大鼠骨髓造血功能恢復，改善外周血象，并增強機體免疫功能，其機制可能與促進骨髓細胞自噬有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】健脾補腎方；再生障礙性貧血；造血功能

【中圖分類號】R 556.5【文獻標識碼】A【文章編號】1002-7386(2020)05-0714-04

EffectsofJianshenbupiprescriptiononhematopoieticfunctioninratswithaplasticanemiaandrelatedactionmechanisms

LVLili,ZHANGLinlin,CAOYufeng,etal.DepartmentofHematology,TheFirstHospitalofZhangjiakouCity,Hebei,Zhangjiakou075041,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of Jianshenbupi prescription on hematopoietic function in rats with aplastic anemia (AA),and to explore its action mechanisms.MethodsA total of 40 Wistar rats (SPF) were randomly divided into four groups:blank control group,model group, positive control group and Jianshenbupi prescription group (observation group),with 10 rats in each group. Except for the rats in blank control group, The rats models with AA were established by giving 5-fluorouracil combined with Maryland by gavage.After successful modeling, the rats in observation group were given Jianshenbupi prescription by gavage,and the rats in positive control group were given stanozolol suspension by gavage, and the rats in blank control group and model group were given the same volume of normal saline,for two weeks. And the peripheral blood cells and bone marrow monouclear cells were counted,and the T cell subsets in peripheral blood, serum cytokines, bone marrow cell cycle, PI and the expression levels of autophagy and apoptosis related proteins were detected.ResultsThe levels of Hb, Ret, WBC, PLT, CD3+, CD4+, Treg, CD4+/CD8+, and the serum levels of IL-11, red cells and megakaryocytes, the proportion of S and G2/M phase cells, PI and the expression levels of LC3-Ⅱ and Bcl-2 proteins in positive control group and observation group were significantly higher than those in model group, however,the levels of CD8+, serum level of IL-2 and TNF-α, the proportion of lymphocytes, the proportion of G0/G1 phase cells and the expression levels of caspase-3 and PARP proteins in positive control group and observation group were significantly lower than those in model group (P<0.05).ConclusionJianshenbupi prescription can improve the hematopoietic function and immune function of rats with AA , and its action mechanism may be related to the promotion of bone marrow autophagy.

【Keywords】 Jianshenbupi prescription; aplastic anemia; hematopoietic function

再生障礙性貧血(AA)是一種臨床常見的骨髓造血衰竭性疾病，患者由于造血干細胞質(zhì)的缺陷或數(shù)量減少導致骨髓增生極度減低和外周血全血細胞減少[1-3]。目前，AA的發(fā)病機制尚未闡明，但研究發(fā)現(xiàn)AA發(fā)生發(fā)展與免疫失調(diào)和細胞因子分泌異常密切相關(guān)[4-6]。近年來，自噬在AA、骨髓增生異常綜合征(MDS)等血液系統(tǒng)疾病中的作用越來越受到重視。本課題組通過建立AA大鼠模型，觀察健脾補腎方對AA大鼠造血功能的影響，并從自噬角度探討其發(fā)揮治療作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性Wistar大鼠40只，體重(272.78±30.66)g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[合格證號：SCXK(京)2012-0001]。

1.2 藥品 健脾補腎方組成：黃芪24 g，女貞子15 g，太子參24 g，白術(shù)芍15 g，炒丹皮15 g，制半夏10 g，小薊草15 g，菟絲子24 g，炒枳殼10 g，炙甘草6 g。上述藥物加水浸泡1 h，水量加至藥材的8倍，煎煮1 h，共2次，合并2次煎煮后水煎液，過濾，濃縮至2 g/ml。陽性對照藥物司坦唑醇片購自廣西南寧百會藥業(yè)集團有限公司。

1.3 試劑與儀器 ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。兔抗LC3-Ⅱ、Bcl-2、caspase-3、PARP、β-actin多克隆抗體購自美國Cell Signaling公司。辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司。2000I型全自動動物血液分析儀購自日本希思美康。EPICS XL型流式細胞儀購自美國Beckman公司。Chemi DocTM XRS+化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Biorad公司。Multiskan FC型酶標儀購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及模型建立：40只大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組和健脾補腎方組，每組10只。除空白組外，其余3組采用腹腔注射氟尿嘧啶(0.15 g/kg)和灌胃馬利蘭溶解液(0.015 g/kg)的方法制作AA大鼠模型[7]。造模成功后，健脾補腎方組每天按劑量19.2 ml/kg灌胃給予健脾補腎方，陽性對照組每天按劑量4 mg/kg灌胃給予司坦唑醇混懸液，空白組和模型組灌胃給予等體積0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)給藥2周。

1.4.2 檢測指標及方法

1.4.2.1 外周血細胞計數(shù)：10%水合氯醛麻醉大鼠后，股動脈取血，采用全自動動物血液分析儀檢測外周血血紅蛋白(Hb)、紅細胞(RBC)、白細胞(WBC)、血小板(PLT)。

1.4.2.2 外周血T淋巴細胞亞群：流式細胞儀檢測外周血CD3+、CD4+、CD8+、Treg細胞比例，計算CD4+/CD8+。

1.4.2.3 血清細胞因子：采用ELISA實驗測定血清白介素2(IL-2)、白介素11(IL-11)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。

1.4.2.4 骨髓有核細胞數(shù)：100倍顯微鏡下計數(shù)骨髓紅系、粒系、淋巴細胞比例及巨核細胞數(shù)。

1.4.2.5 骨髓有核細胞周期：末次給藥后24 h，斷頸處死大鼠，取出股骨，PBS沖出骨髓細胞，200目濾網(wǎng)過濾后加入1 ml 4%冰乙酸，2 500 r/min離心30 min，棄上清，1640液沖洗2次，制成單個骨髓細胞懸液，流式細胞儀檢測細胞周期，計算細胞增殖指數(shù)(PI)。

1.4.2.6 骨髓細胞自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達：采用Western blot檢測骨髓細胞LC3-Ⅱ、Bcl-2、caspase-3、PARP蛋白表達。提取骨髓細胞總蛋白，BCA法定量蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入特異性一抗(1∶5 000稀釋)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的抗兔 IgG(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，PBS洗膜3次，以GAPDH為內(nèi)參照基因，ECL反應(yīng)，采用Image-Pro Plus軟件分析目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 4組外周血Hb、RBC、WBC、PLT比較 與空白組比較，模型組外周血Hb、Ret、WBC、PLT水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和健脾補腎方組外周血Hb、RBC、WBC、PLT水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 4組外周血Hb、RBC、WBC、PLT比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 4組外周血T淋巴細胞亞群比較 與空白組比較，模型組外周血CD3+、CD4+、Treg細胞比例及CD4+/CD8+均明顯降低，CD8+細胞比例均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和健脾補腎方組外周血CD3+、CD4+、Treg細胞比例及CD4+/CD8+均明顯升高，CD8+細胞比例均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.3 4組血清細胞因子比較 與空白組比較，模型組血清IL-11水平均明顯降低，IL-2、TNF-α水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和健脾補腎方組血清IL-11水平均明顯升高，IL-2、TNF-α水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 4組外周血T淋巴細胞亞群比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表3 4組血清細胞因子比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.4 4組骨髓有核細胞數(shù)比較 與空白組比較，模型組骨髓紅系比例、粒系比例、巨核細胞數(shù)均降低，淋巴細胞比例均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和健脾補腎方組骨髓紅系比例、粒系比例、巨核細胞數(shù)均升高，淋巴細胞比例均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 4組骨髓有核細胞數(shù)比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.5 4組骨髓有核細胞周期、PI比較 與空白組比較，模型組骨髓細胞G0/G1期細胞比例均明顯升高，S期和G2/M期細胞比例、PI均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和健脾補腎方組G0/G1期細胞比例均明顯降低，S期和G2/M期細胞比例、PI均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表5 4組骨髓有核細胞周期、PI比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.6 4組骨髓細胞自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達比較 與空白組比較，模型組骨髓細胞LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表達均明顯降低，caspase-3、PARP蛋白表達均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組和健脾補腎方組LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表達均明顯升高，caspase-3、PARP蛋白表達均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 4組骨髓細胞自噬、凋亡相關(guān)蛋白表達比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3 討論

AA是由理化因素、病毒感染等多種因素引起的造血干細胞缺陷、造血微環(huán)境損傷和免疫失調(diào)，從而導致骨髓造血功能障礙，同時造血調(diào)控因子分泌異常，骨髓造血干細胞過度凋亡等[8]。中醫(yī)藥治療AA具有獨特優(yōu)勢，能夠明顯促進骨髓造血功能恢復，并改善機體免疫功能。本研究基于AA“腎虛、血瘀”的病理機制，采用健脾補腎方治療AA大鼠，觀察其對骨髓造血功能的影響，并進一步探討其治療機制。

AA主要由于骨髓紅系造血干細胞或造血微環(huán)境損傷引起，表現(xiàn)為外周全血細胞數(shù)量減少和骨髓造血細胞功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組外周血Hb、Ret、WBC、PLT水平、骨髓紅系比例、粒系比例、巨核細胞數(shù)均明顯低于空白組，淋巴細胞比例均明顯高于空白組，說明氟尿嘧啶和灌胃馬利蘭溶解液聯(lián)合給藥能夠顯著破壞外周血細胞，抑制骨髓造血功能。而健脾補腎方組和陽性對照組外周血Hb、Ret、WBC、PLT水平、骨髓紅系比例、粒系比例、巨核細胞數(shù)均明顯高于模型組，淋巴細胞比例均明顯低于模型組，提示健脾補腎方對AA大鼠外周血象和骨髓造血功能有顯著改善作用。此外，骨髓細胞在周期不同時相的比例是反映細胞增殖和造血功能狀況的重要指標之一。本研究中，模型組骨髓細胞G0/G1期細胞比例均明顯高于空白組，S期和G2/M期細胞比例、PI均明顯低于空白組，表明模型組大鼠骨髓細胞阻滯于G0/G1期，細胞凋亡明顯增加，因而骨髓造血功能顯著被抑制。而陽性對照組和健脾補腎方組G0/G1期細胞比例均明顯低于空白組，S期和G2/M期細胞比例、PI均明顯高于空白組，說明健脾補腎方能夠解除AA大鼠細胞周期阻滯，促進骨髓細胞增殖，改善骨髓造血功能。

研究表明，免疫異常引起骨髓造血干細胞損傷是AA發(fā)生發(fā)展的重要病理機制，主要表現(xiàn)為外周血淋巴細胞亞群失調(diào)與造血負調(diào)控因子分泌增加[9-11]。Treg細胞是一類具有免疫抑制作用的T淋巴細胞亞群，能夠抑制T淋巴細胞的活化和增殖及細胞因子的分泌，并對NK細胞和單核巨噬細胞功能發(fā)揮調(diào)控作用[12]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，AA患者外周血和骨髓中Treg細胞數(shù)量減少和功能損傷，導致其免疫耐受作用降低，從而引起T淋巴細胞過度活化和骨髓造血抑制[13-15]。本研究結(jié)果顯示，模型組外周血CD3+、CD4+、Treg細胞比例、CD4+/CD8+及血清IL-11水平均明顯低于空白組，外周血CD8+及血清IL-2、TNF-α水平均明顯高于空白組，提示AA大鼠存在免疫功能紊亂。而陽性對照組和健脾補腎方組外周血CD3+、CD4+、Treg細胞比例、CD4+/CD8+及血清IL-11水平均明顯高于模型組，外周血CD8+及血清IL-2、TNF-α水平均明顯低于模型組，說明健脾補腎方能夠改善AA大鼠免疫功能紊亂，從而減輕其對骨髓造血功能的抑制。

動物實驗表明，自噬基因Atg7缺陷的小鼠存在胚胎發(fā)育和造血功能障礙[16]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，AA患者造血干/祖細胞自噬水平較健康人顯著降低，且經(jīng)治療后隨著病情緩解自噬水平逐漸升高[17]。目前認為，自噬缺陷可能引起造血干細胞增殖和分化異常、造血微環(huán)境損傷及免疫環(huán)境紊亂，進而導致AA發(fā)生發(fā)展。本研究模型組骨髓細胞LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表達均明顯低于空白組，caspase-3、PARP蛋白表達均明顯高于空白組，提示AA大鼠存在自噬缺陷。而陽性對照組和健脾補腎方組LC3-Ⅱ、Bcl-2蛋白表達均明顯高于模型組，caspase-3、PARP蛋白表達均明顯低于模型組，說明健脾補腎方可能通過調(diào)控自噬抑制骨髓細胞凋亡，這可能是其發(fā)揮治療作用的機制之一。

綜上所述，健脾補腎方能夠顯著改善AA大鼠外周血象和免疫功能紊亂，促進骨髓造血功能恢復，其機制可能與促進骨髓細胞自噬有關(guān)。但是，自噬在AA發(fā)病中的具體作用機制尚待進一步研究，這對于預防和治療AA具有重要意義。