飲水添加螺旋藻和益生菌對小鼠生長、免疫及糞中菌群的影響

金娉婷，張伶燕，趙紅波，劉 雪，盛清凱,3*，王迎雪

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點試驗室，山東濟南 250100；2.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081；3.山東師范大學生命科學院，山東濟南 250014；4.山東大學第二醫(yī)院，山東濟南 250033）

螺旋藻（Spirulina，SPI）為一種光能自養(yǎng)型微生物，含有豐富的多糖、維生素等營養(yǎng)成分，另含有藍藻蛋白、螺旋藻多糖等多種生理功能物質(zhì)，作為一種功能食品被廣泛食用。最近幾年，人們開始用污水培養(yǎng)螺旋藻[1]，其生產(chǎn)成本不斷降低，螺旋藻作為一種飼料原料或飼料添加劑開始被廣泛關(guān)注。

螺旋藻作為水產(chǎn)飼料可以促進魚、蝦的生長及免疫[2]，但其促進生長和免疫的機理不清楚?？莶菅挎邨U菌、乳酸菌等作為調(diào)節(jié)腸道菌群、促進生長免疫的綠色飼料益生菌制劑（Probiotics，PRO）常用于豬飼料中，但螺旋藻與益生菌兩者之間是否協(xié)同尚不清楚。前期研究表明，飼料中添加0.5%螺旋藻可以促進口蹄疫疫苗免疫仔豬的生長，與益生菌配伍協(xié)同可提高免疫蛋白IgM含量[3]，推測螺旋藻促進生長、免疫的機理可能與疫苗免疫[4]或黏膜免疫[5]有關(guān)。對于正常非免疫動物而言，螺旋藻及與益生菌聯(lián)用對生長、免疫的影響尚不清楚。動物腸道及肝臟上含有芳香烴受體（Aryl Hydrocarbon Receptor，AHR）、Toll 樣受體（Toll-Like Receptor，TLR）等多種與免疫、炎癥有關(guān)的受體，營養(yǎng)物質(zhì)常通過AHR 等受體信號通路發(fā)揮促進生長、免疫的作用[6]，但螺旋藻及益生菌對AHR 等受體的影響未見報道。研究螺旋藻對AHR 等的影響有助于明確益生菌的作用途徑。本試驗旨在研究螺旋藻及其與益生菌聯(lián)用對小鼠生長、免疫球蛋白及AHR 受體等的影響，探討螺旋藻作用機理，為飼料資源開發(fā)及畜禽健康養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 鈍頂螺旋藻純粉由山東博然螺旋藻生物股份有限公司生產(chǎn)，水分含量5.0%，蛋白質(zhì)含量67.86%，色氨酸含量0.14%（實測值）。益生菌由開創(chuàng)陽光環(huán)?？萍及l(fā)展公司生產(chǎn)，枯草芽孢桿菌與乳酸桿菌的量分別為 1.0×109、1.0×108CFU/g。體重（17±0.1）g的雌性無特定病原體（SPF）級昆明雌性小鼠購買于濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。SPF 小鼠顆粒飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司生產(chǎn)，粗蛋白質(zhì)21.46%，賴氨酸1.43%，色氨酸0.04%（實測值）。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理 采用2×2 試驗設(shè)計，將80只小鼠隨機均分為4 組，每組5 個重復，每重復4 只，每單體籠飼養(yǎng)1 個重復。對照組飲用蒸餾水，螺藻組、益菌組、藻菌組分別飲用重量比為30 mg/kg 的螺旋藻蒸餾水溶液、60 mg/kg 的益生菌蒸餾水溶液、30 mg/kg螺旋藻+60 mg/kg 益生菌的蒸餾水溶液。每3 d 換1 次蒸餾水。試驗期28 d。試驗開始前與結(jié)束后一天08:00全部小鼠個體空腹稱重，小鼠自由采食與飲水，環(huán)境溫度控制在（25±1）℃，每周換2 次墊料，小鼠飼養(yǎng)試驗過程按照國家《實驗動物管理條例》執(zhí)行。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 生長性能 于試驗第 7、14、21、28 天 08:00 全部小鼠進行個體空腹稱重，以重復為單位記錄采食量、飲水量，分別計算每只小鼠的始重（IW）、末重（FW）、平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、耗料增重比（F/G）及日均飲水量（ADWI）。

1.2.2 糞便菌群 第 24 天 08:00 每組每重復隨機選2 只小鼠采集新鮮糞便，待糞便排出后迅速裝入已經(jīng)滅菌的塑料管中，立即分析，分別采用MRS 培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基進行平板計數(shù)法測定乳酸菌與大腸桿菌的數(shù)量。

1.2.3 血清免疫指標 第28 天空腹稱重后當天小鼠全部脫頸致死，眼緣靜脈采血，3 000 r/min 離心10 min，將血清于0～4℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫吸附試驗法（ELISA）測定血清中IgE、IgM、IgG 含量，酶標儀測定波長為450 nm。ELISA 試劑盒為武漢基因美科技有限公司提供。

1.2.4 AHR、TLR3 和 TLR4 含量 小鼠采血后，立即取回盲接口處至下端4 cm 的結(jié)腸腸段和肝臟組織，用生理鹽水沖洗結(jié)腸內(nèi)容物和肝臟表面，然后用濾紙吸干表面水分，-20℃保存?zhèn)溆?。ELISA 測定結(jié)腸和肝臟中AHR、TLR3 和TLR4 含量，酶標儀測定波長為450 nm。ELISA試劑盒同上。

1.2.5 統(tǒng)計分析 先用Excel 2010 對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理，再用SAS 9.1 軟件GLM 程序?qū)λ袛?shù)據(jù)按雙因素模型進行處理，計算平均值與標準誤，分析螺旋藻添加效應(yīng)、益生菌添加效應(yīng)及二者互作效應(yīng)，采用Duncan's 方法對平均值進行多重比較。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻和益生菌對小鼠生長性能的影響 由表1 看出，添加螺旋藻對FW 和ADG 皆有增高趨勢（P＜0.05），降低ADFI 和F/G（P＜0.01）；添加益生菌增加ADFI（P＜0.01），降低了 F/G（P＜0.05）。SPI 和 PRO 二者對于F/G 交互顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，添加螺旋藻可以促進小鼠的生長。

2.2 螺旋藻和益生菌對小鼠免疫蛋白的影響 由表2看出，螺旋藻和益生菌皆可以提高IgE 和IgM 的含量（P＜0.05），但二者互作皆不顯著（P＞0.05）。二者對IgG 皆無影響。

2.3 螺旋藻和益生菌對小鼠結(jié)腸和肝臟受體的影響 由表3 可知，添加螺旋藻和益生菌皆提高了結(jié)腸中AHR含量（P＜0.05），但二者交互作用不顯著（P＞0.05）；二者對TLR3 皆無顯著影響；益生菌對結(jié)腸中TLR4 含量有顯著影響。螺旋藻和益生菌二者皆極顯著提高了肝臟AHR 含量，二者對肝臟TLR3 和TLR4 皆無影響。結(jié)果表明，飲水螺旋藻和益生菌可以提高結(jié)腸和肝臟AHR 受體含量。

2.4 螺旋藻和益生菌對小鼠糞便菌群的影響 由表4 可知，螺旋藻對糞便中的乳酸菌和大腸桿菌皆無影響，益生菌降低了糞便中大腸桿菌含量（P＜0.01），表明二者對糞便菌群的影響存在差異。

3 討 論

3.1 螺旋藻和益生菌對小鼠生長與免疫的影響 本試驗中飲水螺旋藻可以降低小鼠F/G，與粉狀飼料添加螺旋藻可以促進豬生長的結(jié)果[3]相似，與螺旋藻顆粒飼料對斷奶仔豬生長無影響的結(jié)果[7]相反，原因可能是顆粒飼料高溫制粒破壞了螺旋藻中的功能物質(zhì)。螺旋藻中的藻藍蛋白、葉綠素a 等功能物質(zhì)不耐熱，易受熱破壞。生產(chǎn)中飲水或飼喂螺旋藻時建議保護其功能物質(zhì)的生理活性。本試驗發(fā)現(xiàn)，螺旋藻與益生菌對于小鼠的F/G 互作效果明顯，揭示螺旋藻中的營養(yǎng)物質(zhì)或生理功能物質(zhì)與枯草芽孢桿菌及乳酸菌在飼料轉(zhuǎn)化方面可能存在協(xié)同作用，這與螺旋藻與益生菌協(xié)同促進鯉魚生長[8]的結(jié)果相似。本試驗結(jié)果顯示，螺旋藻與益生菌在生產(chǎn)中協(xié)同使用的促生長效果更好。

IgE、IgM 是參與體液免疫的主要抗體，其含量在一定程度上可以反映機體的體液免疫水平。本試驗中螺旋藻提高小鼠血清IgE、IgM 的含量，表明螺旋藻可以提高機體的體液免疫水平，這與肉雞[9]及仔豬[3]上的結(jié)果相近。IgG 也是一種主要的免疫球蛋白，但本試驗發(fā)現(xiàn)螺旋藻對小鼠IgG 無影響，具體原因有待進一步研究。Hayashi 等[5]報道，螺旋藻對綿羊紅細胞二次免疫小鼠血清的IgG 幾乎無影響；盛清凱等[3]報道，螺旋藻對未口蹄疫疫苗免疫仔豬的IgG 也沒有影響，但可以提高口蹄疫疫苗免疫接種仔豬的IgG，據(jù)此推測螺旋藻對IgG 的影響可能與免疫接種或接種疫苗的類型有關(guān)。3.2 螺旋藻和益生菌對小鼠結(jié)腸和肝臟AHR、TLR3 和TLR4 的影響 AHR、TLR 皆為腸道和肝臟上的受體蛋白。AHR 是一種由飲食、微生物、新陳代謝物和污染物所提供的小分子配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。AHR 被配體激活后，移位到細胞核內(nèi)與芳香烴受體核轉(zhuǎn)運蛋白形成異二聚體復合物，該異二聚體結(jié)合相應(yīng)的 DNA 序列，引發(fā)下游目的基因的轉(zhuǎn)錄及表達。吲哚等為AHR的配體[10]。TLR 是一種重要的免疫細胞表面模式識別受體。細胞通過TLR 等模式識別受體，激活系列的級聯(lián)信號通路，建立宿主的天然免疫反應(yīng)，在機體腸道免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)小鼠有11 種TLR（TLR1～TLR13），TLR 受營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)[11]，脂多糖及病毒雙鏈RNA 等分別是TLR4 和TLR3 的配體。TLR4 信號傳導為Dy88T 依賴性或非依賴性傳導，TLR3 為非依賴性信號傳導。AHR 信號通路與TLR 免疫調(diào)節(jié)通路通過轉(zhuǎn)錄因子（NF-kb）進行交叉。AHR 信號通路將環(huán)境因素、飼糧新陳代謝物與免疫性能相銜接。

表2 螺旋藻和益生菌對小鼠免疫蛋白的影響 μg/mL

表3 螺旋藻和益生菌對小鼠結(jié)腸和肝臟AHR、TLR3 和TLR4 的影響

表4 螺旋藻和益生菌對糞便菌群的影響 lg CFU/g

目前未見螺旋藻對AHR 影響的報道。本試驗中螺旋藻提高腸道AHR 與提高血清IgM、增強機體免疫性能的結(jié)果相對應(yīng)，這與AHR 信號調(diào)節(jié)腸道免疫的結(jié)論[12]一致。這可能與自身色氨酸或脂多糖結(jié)構(gòu)等有關(guān)。其一，螺旋藻作為一種高蛋白飼料原料，富含色氨酸。飲水后結(jié)腸食糜中色氨酸含量增加，導致吲哚等含量升高，促進AHR 產(chǎn)生。其二，螺旋藻含有脂多糖[13]，脂多糖可以促進免疫細胞AHR 的表達[14]。其三，與腸道菌群變化有關(guān)。菌群變化影響色氨酸的代謝[15]。目前發(fā)現(xiàn)擬桿菌、梭菌等多種微生物可以降解色氨酸產(chǎn)生吲哚及其衍生物，螺旋藻對仔兔盲腸擬桿菌等微生物有顯著影響[16]。本試驗對于降解色氨酸產(chǎn)生吲哚的梭菌等微生物沒有檢測。本試驗中螺旋藻對TLR4 無影響的結(jié)果與Okuyama 等[13]不同，差異原因可能在于多糖為螺旋藻其中的一種功能成分。本試驗發(fā)現(xiàn)，螺旋藻增強機體免疫力的機理與AHR 有關(guān)，有助于螺旋藻飼料添加劑及免疫增強劑的開發(fā)。

3.3 螺旋藻和益生菌對小鼠糞便菌群的影響 本試驗中螺旋藻對小鼠乳酸菌、大腸桿菌無影響的結(jié)果與仔豬[3]近似，與體外培養(yǎng)基中螺旋藻促進乳酸菌生長、對大腸桿菌無影響[17]的結(jié)果不同。本試驗螺旋藻對大腸桿菌無影響、益生菌降低大腸桿菌的結(jié)果間接表明螺旋藻與益生菌二者通過調(diào)整腸道菌群促生長增加免疫的機理存在差異。在實際生產(chǎn)中如果螺旋藻與益生菌配伍，二者可能從色氨酸、脂多糖、菌群等多個調(diào)控環(huán)節(jié)協(xié)同促進生長及增加免疫。

3.4 螺旋藻與益生菌聯(lián)用對小鼠生長、免疫和菌群的影響 目前未見螺旋藻與益生菌聯(lián)用對小鼠生長及免疫影響的試驗報道。本試驗中螺旋藻與益生菌對小鼠ADFI、F/G、IgE、IgM 及結(jié)腸AHR 有相同的顯著影響，但益生菌對結(jié)腸TLR4 及糞便大腸桿菌有顯著影響，而螺旋藻對結(jié)腸TLR4 及大腸桿菌皆無影響。螺旋藻與益生菌作用的差異，可能與二者含有的生理功能物質(zhì)或分泌的功能物質(zhì)或本身化學物質(zhì)結(jié)構(gòu)或有關(guān)。本試驗所用的鈍頂螺旋藻屬于藍藻門藍藻綱螺旋藻屬，含有藻藍蛋白、葉綠素a 等生理功能物質(zhì)；枯草芽孢桿菌屬于厚壁菌門芽孢桿菌綱芽孢桿菌屬，可以合成蛋白酶、纖維素酶等酶類；乳酸菌屬于厚壁菌門芽孢桿菌綱乳桿菌屬，可以分泌乳酸等物質(zhì)。目前未見枯草芽孢桿菌或乳酸菌含有螺旋藻藻藍蛋白以及螺旋藻分泌乳酸的報道。螺旋藻多糖和枯草芽孢桿菌多糖二者結(jié)構(gòu)也存在差異。

本試驗中螺旋藻與益生菌對F/G 有協(xié)同效果，對肝臟TLR3 和TLR4 有協(xié)同影響趨勢，說明螺旋藻與益生菌二者強化了促進生長、增強免疫的相關(guān)功能。二者是否通過AHR、NF-kb、TLR 或其他信號通路協(xié)同強化，有待進一步研究。

4 結(jié) 論

飲水螺旋藻可以促進小鼠生長，提高機體免疫力，其機理與AHR 改變有關(guān)。螺旋藻可能通過富含的色氨酸、脂多糖及調(diào)節(jié)菌群等途徑影響AHR。螺旋藻與益生菌二者促進生長、增加免疫的作用機理存在差異，二者配伍后應(yīng)用效果更好。