CAR-T細(xì)胞技術(shù)的研發(fā)及臨床應(yīng)用前景

趙 琳，趙新漢

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，西安 710061)

CAR-T療法全稱(chēng)為chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，即嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。這一概念最早由Gross等[1]于1989年提出，經(jīng)過(guò)近幾年連續(xù)改進(jìn)并發(fā)展后得到了非常快速的進(jìn)步。CAR-T細(xì)胞技術(shù)屬于過(guò)繼T細(xì)胞療法的一種，但其鮮明的特點(diǎn)在于可使T細(xì)胞表面嵌合抗原受體，從而引導(dǎo)T細(xì)胞靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。相對(duì)于傳統(tǒng)過(guò)繼細(xì)胞療法而言，CAR-T細(xì)胞技術(shù)可以繞過(guò)抗原遞呈，進(jìn)入人體后能長(zhǎng)期存活或繼續(xù)繁殖。由于CAR-T細(xì)胞療法展現(xiàn)出極強(qiáng)的技術(shù)屬性和良好的復(fù)制性，并且已經(jīng)在血液系統(tǒng)腫瘤治療中表現(xiàn)出良好的臨床療效，優(yōu)于現(xiàn)有的其他免疫細(xì)胞治療腫瘤的療效，吸引了越來(lái)越多的研發(fā)機(jī)構(gòu)及臨床中心投入其中并開(kāi)展大量臨床試驗(yàn)。本文將著重從結(jié)構(gòu)和功能出發(fā)，對(duì)CAR-T細(xì)胞技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用做出部分闡述，并對(duì)發(fā)展迅猛的CAR-T技術(shù)進(jìn)行展望。

1 CAR-T的整體結(jié)構(gòu)與功能

經(jīng)典的嵌合型抗原受體CAR(chimeric antigen receptor，CAR)可分為5個(gè)部分，即識(shí)別腫瘤抗原的抗體單鏈可變區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)、共刺激區(qū)和T細(xì)胞活化區(qū)。CAR-T細(xì)胞技術(shù)通過(guò)外源基因轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染到患者的T細(xì)胞或者改造的T細(xì)胞，把識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)的單鏈抗體(single-chain variable fragment，scFv)和T細(xì)胞活化序列(通常為CD3ζ或FcεRIγ)的融合蛋白表達(dá)到T細(xì)胞表面。scFv通過(guò)跨膜區(qū)與T細(xì)胞胞內(nèi)的活化增殖信號(hào)域偶聯(lián)。這些改造的T細(xì)胞再經(jīng)過(guò)體外純化和大規(guī)模擴(kuò)增后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，最終以非主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)限制性模式表現(xiàn)強(qiáng)效的抗癌作用。CAR-T細(xì)胞作用過(guò)程不受MHC限制，這在一定程度上使得CAR-T細(xì)胞技術(shù)具有多靶點(diǎn)性，而且對(duì)表達(dá)相同抗原的腫瘤均具有識(shí)別殺傷能力。迄今，CAR-T細(xì)胞技術(shù)主要經(jīng)歷了4代研發(fā)歷程，但有研究提出第Ⅴ代應(yīng)為通用型嵌合抗原受體，具體見(jiàn)表1。

表1 CAR-T細(xì)胞技術(shù)比較

現(xiàn)有研究表明，T細(xì)胞的完全活化有賴(lài)于雙信號(hào)和細(xì)胞因子的作用，例如僅含有CD3ζ序列的CAR，仍需在協(xié)同刺激信號(hào)的作用下，才能激活CAR-T細(xì)胞，這可能是第一代FRa CAR-T細(xì)胞在I期臨床試驗(yàn)對(duì)晚期卵巢癌的抗腫瘤作用無(wú)效的主要原因[2]。為此，第二和第三代CARs在嵌合受體上加了如CD28、CD134和CD137等共刺激分子(costimulatory molecule，CM)，從而使T細(xì)胞激活，T細(xì)胞的殺傷毒性和增殖活性明顯增加，并且延長(zhǎng)了T細(xì)胞的存活時(shí)間。CD28、CD134、CD137等共刺激分子在CAR作用中究竟孰優(yōu)孰劣，研究結(jié)果不盡相同[3-4]。有研究認(rèn)為，CD28的刺激可使CD4 T細(xì)胞保持中心記憶性細(xì)胞狀態(tài)，CD137促使CD8T中心記憶性細(xì)胞增殖[5-6]。第四代CAR-T細(xì)胞技術(shù)，包括自殺基因、整合表達(dá)免疫因子、整合共刺激因子配體等精確調(diào)控方式的加入，可能有含CD28的3個(gè)不同的共同刺激因子加入。整體上，第四代CAR-T細(xì)胞技術(shù)的研究目前更多地集中在基因修飾及免疫微環(huán)境改造層面，基因修飾(如自殺式人工調(diào)控開(kāi)關(guān)的研究)方面取得了可觀的成績(jī)[7]，如，磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制劑的引入、MegaTAL基因編輯技術(shù)敲除TCR、PD-1敲除、CRISPR-Cas技術(shù)的引入等。免疫微環(huán)境改造是第四代CAR調(diào)控T細(xì)胞的主要研究目的之一，例如，讓第四代CAR-T共表達(dá)一個(gè)白介素-12(IL-12)因子，讓IL-12在靶點(diǎn)局部表達(dá)，改善免疫治療微環(huán)境，激活鄰近的自然殺傷(NK)細(xì)胞、浸潤(rùn)的T細(xì)胞等[8]，從而激活內(nèi)源性抗腫瘤反應(yīng)。通用CAR-T細(xì)胞技術(shù)的研究將會(huì)引入更多的基因編輯技術(shù)，最大化地突破移植物抗宿主病(GVHD)這個(gè)瓶頸，最終為CAR-T細(xì)胞技術(shù)的規(guī)?；瘧?yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2 CAR-T的結(jié)構(gòu)組分研究

2.1 scFV研究

嵌合型抗原受體CAR結(jié)構(gòu)的第一個(gè)關(guān)鍵部位是膜外區(qū)上具有特異性識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面抗原的scFv，其形式為VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。目前能獲得的最小的具有特異性識(shí)別又能結(jié)合抗原的分子為scFv[9]，其大小約為28KD。scFv既可以與納米微球結(jié)合，也可以與各種已知的靶向治療藥物結(jié)合。直到CAR開(kāi)發(fā)后，scFv的獨(dú)特作用才再一次引起人們的極大關(guān)注。對(duì)靶標(biāo)分子及修飾性目的分子的親和淘選是目前獲得較特異的scFv片段分子的有效方式。其中，較為常用的篩選方法包括DNA文庫(kù)、噬菌體文庫(kù)、核糖體展示文庫(kù)等篩選文庫(kù)技術(shù)。靶點(diǎn)的選擇還可應(yīng)用人源化抗體和親和力優(yōu)化，主要技術(shù)為噬菌體抗體技術(shù)、嵌合抗體技術(shù)、基因工程抗體技術(shù)等。scFv親和淘選及識(shí)別靶點(diǎn)既可以利用腫瘤蛋白質(zhì)抗原，又可利用糖脂類(lèi)非蛋白質(zhì)、碳水化合物或腫瘤特異性受體的配體等。目前世界范圍內(nèi)多個(gè)中心研究較多的靶點(diǎn)為特定或某一類(lèi)腫瘤相關(guān)抗原，而實(shí)體瘤的靶向選擇主要包括突變的抗原或病毒抗原、組織特異性抗原、組織發(fā)育特異性抗原、過(guò)表達(dá)的抗原等[[10]。綜合來(lái)看，目前常用的研究靶點(diǎn)有：① CD分化抗原系列：CD19(最常見(jiàn))、CD20、CD22、CD30、CD33、CD107a、CD171、CDl23、CD133、CD138、CD317等；② 腫瘤標(biāo)志物系列：CA125、CEA、AFP、PSMA；③ 表皮生長(zhǎng)因子系列：Her-1、Her-2、EGFR等；④ 突變基因、酶類(lèi)及其他：GD2、Mesothelin、MAGE-A3、、MUC-16、ROR-1、GPC3、DR5、TIPE3、MAGE-A3，IL-13Ra2，c-MET、CAIX等。一些改造的靶點(diǎn)研究在實(shí)體瘤中發(fā)展較快，如表皮生長(zhǎng)因子受體Ⅲ型突變體(EGFRvⅢ)治療膠質(zhì)瘤患者的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中；Eureka Therapeutics公司開(kāi)發(fā)了專(zhuān)門(mén)識(shí)別HLA-A02限制的AFP抗原多肽的人源化單克隆抗體進(jìn)行人源化噬菌體文庫(kù)篩選[11]。隨著研究的進(jìn)展，一些新的腫瘤靶點(diǎn)也被提出，成纖維細(xì)胞激活蛋白在眾多腫瘤間質(zhì)中高表達(dá)，靶向該蛋白的CAR-T細(xì)胞能抑制小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，且無(wú)細(xì)胞毒性[12]。Tran等[13]以全基因組測(cè)序的方法，免疫靶向膽管細(xì)胞癌患者體內(nèi)具有個(gè)體特征的腫瘤突變抗原靶點(diǎn)(erbb2基因突變)，患者病情得到控制并在觀察的6個(gè)月內(nèi)持續(xù)緩解。

靶點(diǎn)的選擇及scFv的設(shè)計(jì)目前仍有很多問(wèn)題亟待解決，尤其是在目前實(shí)體瘤無(wú)特異性靶點(diǎn)的現(xiàn)狀下。在親和性方面，增強(qiáng)CAR抗原親和力會(huì)提高腫瘤靶向性并伴隨抗原表達(dá)下調(diào)和T細(xì)胞激活增加，但高親和力的CAR與抗原的結(jié)合過(guò)于緊密，反而導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞結(jié)合多種目標(biāo)分子受限，從而限制殺傷效力。在療效方面，當(dāng)前研究設(shè)計(jì)大都針對(duì)已知的相對(duì)較好的腫瘤相關(guān)抗原，仍缺少腫瘤特異性抗原。優(yōu)化抗原篩選是靶向?qū)嶓w腫瘤領(lǐng)域的重要組成部分，但修飾后的治療可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤抗原呈遞下調(diào)甚至缺失，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。在靶向殺傷的進(jìn)化選擇上，由于實(shí)體腫瘤可能有很多靶點(diǎn)陰性的細(xì)胞，因此殺傷靶點(diǎn)陽(yáng)性的細(xì)胞后，靶點(diǎn)陰性的細(xì)胞可能會(huì)成長(zhǎng)。有研究指出，喚醒浸潤(rùn)的T細(xì)胞才能殺傷靶點(diǎn)陰性的腫瘤細(xì)胞。在鼠源性方面，目前的CAR大多基于鼠源抗體的scFv進(jìn)行設(shè)計(jì)，這種異源模型可能會(huì)誘發(fā)宿主抗CAR反應(yīng)。將scFv片段人源化或利用人源抗體設(shè)計(jì)CAR是阻止這種反應(yīng)的可能策略之一。另外，特異性scFv的設(shè)計(jì)和獲得，也是一個(gè)較為長(zhǎng)期而反復(fù)的篩選過(guò)程。

2.2 載體設(shè)計(jì)研究

目前應(yīng)用最多的CAR-T細(xì)胞技術(shù)仍是以病毒作為載體中介[14]，其中最為常見(jiàn)的仍是反轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。兩者均具有出色的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，而慢病毒的感染效率更高，表達(dá)更持久且能傳遞大片段DNA序列[15]。人們對(duì)其他病毒也有研究，如Pule等[16]報(bào)道了嘗試使用EB病毒轉(zhuǎn)化第一代CAR-T細(xì)胞，取得了一定的療效。溶瘤病毒(oncolytic virus，OV)作為載體的研究目前已取得了可喜的進(jìn)展，這得益于溶瘤病毒能選擇性感染腫瘤細(xì)胞，并在其中復(fù)制且殺傷腫瘤細(xì)胞，但不會(huì)傷及健康組織。改造的T細(xì)胞裝載OV可能是一種能提高療效的新的聯(lián)合療法[17]。就病毒載體的安全性而言，研究表明在小鼠和人T細(xì)胞中，CAR-T細(xì)胞負(fù)載低劑量病毒不會(huì)影響受體的表達(dá)和功能[18-19],但仍需更長(zhǎng)時(shí)間觀察病毒載體是否會(huì)帶來(lái)有害的插入性突變。

與病毒載體相比，質(zhì)粒載體的構(gòu)建花費(fèi)較少，而且不會(huì)整合到宿主的基因組中，安全性有一定保證。但是，質(zhì)粒載體的構(gòu)建需要花費(fèi)更多時(shí)間，如需要一個(gè)長(zhǎng)期的體外培養(yǎng)和抗性篩選過(guò)程，人類(lèi)對(duì)質(zhì)粒載體的抗性基因的免疫反應(yīng)等限制了其臨床應(yīng)用研究。在物理呈遞和化學(xué)誘導(dǎo)方面，電穿孔技術(shù)適用性較廣，安全性較高，但效率較低的缺點(diǎn)較明顯[20]。分子技術(shù)層面轉(zhuǎn)染CAR-T細(xì)胞進(jìn)展很快，如為體外轉(zhuǎn)錄編碼CAR的mRNA、微環(huán)DNA等都作為轉(zhuǎn)導(dǎo)載體進(jìn)行研究，特別在第四代CAR-T細(xì)胞技術(shù)的研究中，基因工具“睡美人”(SB)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)[21-22]及Piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)[23]的進(jìn)展較快。

2.3 效應(yīng)細(xì)胞設(shè)計(jì)研究

一個(gè)典型的CAR-T治療流程包括T細(xì)胞分離、修飾、擴(kuò)增、回輸和監(jiān)控，因此T細(xì)胞的獲得、改造和培養(yǎng)貫穿CAR-T治療的全過(guò)程。T細(xì)胞可來(lái)源于自體或者是健康異體，而自體來(lái)源限制了質(zhì)量的規(guī)?；?、需要一定的患者條件、增加了治療的花費(fèi)和時(shí)間成本。如果采用志愿者的T細(xì)胞，需要克服異體排斥反應(yīng)。因此基因編輯改造在CAR-T細(xì)胞技術(shù)中被逐步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。英國(guó)研究人員運(yùn)用TALEN基因編輯方法，使T細(xì)胞的2個(gè)關(guān)鍵基因失活。一個(gè)是T細(xì)胞上原有的識(shí)別基因，它的失活使得T細(xì)胞不會(huì)攻擊腫瘤細(xì)胞以外的目標(biāo)，大大降低了不必要的異體免疫反應(yīng)。另一個(gè)是T細(xì)胞膜蛋白基因，它的失活可以保護(hù)改造后的T細(xì)胞免遭特定藥物破壞。這種被修改了免疫特性的T細(xì)胞，針對(duì)靶點(diǎn)CD19成功治療了1例晚期急性淋巴白血病患兒[24]。因此，應(yīng)用“基因編程”技術(shù)的異體CAR-T細(xì)胞技術(shù)可能會(huì)解決CAR-T細(xì)胞的大量生產(chǎn)問(wèn)題。隨著對(duì)T細(xì)胞的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，將會(huì)有更多的基因編輯技術(shù)應(yīng)用于T細(xì)胞改造，如TALEN基因編輯技術(shù)應(yīng)用于T細(xì)胞，可敲除TCR-alpha基因(降低GVHD)、CD52基因(使細(xì)胞對(duì)alemtuzumab耐藥)和RQR8(自殺基因，可增加細(xì)胞對(duì)rituximab的敏感性)。已經(jīng)設(shè)計(jì)成功的嚴(yán)格控制T細(xì)胞行為的“分子開(kāi)關(guān)”的突破性成果，有望解決T細(xì)胞治療后出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的問(wèn)題[7,25]。

在T細(xì)胞類(lèi)型及輸注方式上，研究發(fā)現(xiàn)CD8+CAR-T細(xì)胞可以有效溶解腫瘤細(xì)胞，而CD4+CAR-T細(xì)胞會(huì)促進(jìn)細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，其中初始CD4+T細(xì)胞可產(chǎn)生大量IL-2來(lái)刺激CD8+T細(xì)胞[26]。CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞以1∶1的比例構(gòu)成的混合細(xì)胞產(chǎn)物可完全根除Raji淋巴瘤[26]。對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行改造將是近年來(lái)效應(yīng)細(xì)胞的發(fā)展方向之一[27]。另一個(gè)用于CAR免疫治療來(lái)源的T細(xì)胞是γδT細(xì)胞系列。這類(lèi)T細(xì)胞識(shí)別抗原不同于包括通過(guò)αβTCR識(shí)別異基因抗原的蛋白質(zhì)衍生肽，因此，γδT細(xì)胞具有較低的同種異體反應(yīng)性，但是顯示出較好的抗腫瘤作用[28]。一般回輸T細(xì)胞前，需要對(duì)患者進(jìn)行預(yù)處理，主要是通過(guò)調(diào)節(jié)化療延長(zhǎng)過(guò)繼T細(xì)胞的存在時(shí)間?；诎踩钥紤]，凱特琳癌癥研究中心將T細(xì)胞過(guò)繼調(diào)整為化療后2天；而美國(guó)國(guó)家癌癥研究所認(rèn)為低劑量化療聯(lián)合CAR-T療法對(duì)進(jìn)展性B細(xì)胞淋巴瘤效果較好。目前，重組T細(xì)胞的回輸方式主要是靜脈回輸，采用腹膜或瘤體注射的研究大部分還處在試驗(yàn)階段，而采用微創(chuàng)介入或瘤內(nèi)注射的方式可使CAR-T細(xì)胞更多地進(jìn)入實(shí)體瘤內(nèi)部對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行有效殺傷，可能是未來(lái)CAR-T治療實(shí)體瘤的方向之一。

嵌合抗原也不僅僅只是修飾T細(xì)胞，它還可以修飾細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)、NK等效應(yīng)細(xì)胞[28]。Chu等[29]利用針對(duì)CS1靶點(diǎn)的CAR-NK細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究中獲得了突破性療效，而且CAR-NK細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞治療一樣會(huì)產(chǎn)生IFN-γ等效應(yīng)因子。NantKwest公司擁有以NK細(xì)胞治療為核心的三大技術(shù)平臺(tái)aNK、haNK和taNK。NK不表達(dá)殺傷細(xì)胞抑制性受體(killer inhibitory receptor，KIR)，進(jìn)而避免其活性被靶細(xì)胞表面的MHC抑制。有研究開(kāi)始探究將造血干細(xì)胞基因修飾成CAR-T的可行性，在HSCT過(guò)程中采用這種CAR-T可能尤其有利。

3 臨床應(yīng)用研究

CAR-T細(xì)胞技術(shù)在難治復(fù)發(fā)急性淋巴細(xì)胞白血病，慢性淋巴細(xì)胞白血病、淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征(MDS)等血液腫瘤的治療方面已顯示出良好的潛力，已成為目前唯一有希望根治惡性血液病且不依靠allo-HSCT的新型技術(shù)，也是連接移植的重要橋梁或移植后清除殘存腫瘤細(xì)胞的重要武器。Porter等[30]采用CLT019治療晚期慢性淋巴細(xì)胞白血病患者6個(gè)月的無(wú)進(jìn)展生存率達(dá)67%，持續(xù)緩解時(shí)間超過(guò)10個(gè)多月，最長(zhǎng)的完全緩解時(shí)間達(dá)到2年。一項(xiàng)特異性靶向CD19分子的CAR-T細(xì)胞技術(shù)能有效治療急性B細(xì)胞性惡性腫瘤，其治療的16例患者的完全緩解率為88%，大多數(shù)患者接受CAR-T細(xì)胞技術(shù)治療以后可以繼續(xù)HSC移植[31]。CTL019在治療特定類(lèi)型的難治性非霍奇金淋巴瘤方面已顯現(xiàn)特有的潛力。諾華公司公布了可評(píng)估的15例彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)、11例濾泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，F(xiàn)L)成人患者接受CTL019治療3個(gè)月時(shí)的II期臨床研究數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，r/rDLBCL患者組的總緩解率為47%(n=7/15)，F(xiàn)L患者組的總緩解率為73%(n=8/11)[32]。部分已發(fā)表的研究分析顯示，骨髓有明顯腫瘤浸潤(rùn)的惡性血液病患者更易獲得緩解[30]。研究發(fā)現(xiàn)，l例中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病(CNS-L)患者經(jīng)CAR-T治療后，腦脊液中的白血病細(xì)胞得到有效清除[33]。研究顯示[34-35]，輸注的CAR-T細(xì)胞可以在患者外周血和骨髓中大量存活，有效清除功能可維持6個(gè)月以上，且部分CAR-T細(xì)胞以記憶效應(yīng)細(xì)胞的形式存在。CAR-T細(xì)胞有可能為治療CNS-L、原發(fā)性CNS-L以及腦腫瘤提供新的治療方向。

實(shí)體瘤研究也取得了部分令人欣喜的成績(jī)。研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)間皮素(mesothelin)蛋白設(shè)計(jì)的CAR-T細(xì)胞技術(shù)治療胰腺癌動(dòng)物的平均生存期96天，較對(duì)照組平均生存期54天提高了78%[36]。間皮素也在三陰性乳腺癌和肺癌中高表達(dá)，CAR-T細(xì)胞技術(shù)在這2個(gè)領(lǐng)域中的應(yīng)用正在探索中。在2015年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)年會(huì)上，公布了CAR-T細(xì)胞技術(shù)首次在實(shí)體瘤胰腺癌治療上的突破，6例受試者中有1例轉(zhuǎn)移灶部分消失，4例腫瘤代謝趨于穩(wěn)定或降低，并且發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的CAR-T細(xì)胞已經(jīng)轉(zhuǎn)移到患者腫瘤部位[37]。一項(xiàng)針對(duì)19例復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的Her-2陽(yáng)性肉瘤患者采用HER2-CAR T細(xì)胞治療的I/II臨床試驗(yàn)顯示[38]，CAR-T治療實(shí)體肉瘤后細(xì)胞存活超過(guò)6周且無(wú)明顯毒性反應(yīng)，患者的中位生存期達(dá)10.3個(gè)月(5.1～29.1個(gè)月)。檢測(cè)的2例患者腫瘤組織中均檢測(cè)到CAR-T細(xì)胞。17例可評(píng)估的患者中，4例患者有3～14個(gè)月的疾病穩(wěn)定期，3例患者腫瘤切除，其中1例患者觀察到腫瘤超過(guò)90%壞死的臨床病理表現(xiàn)。

4 毒副反應(yīng)及技術(shù)缺點(diǎn)

4.1 細(xì)胞因子釋放綜合征

CAR-T細(xì)胞技術(shù)在臨床應(yīng)用中一個(gè)最主要的不良反應(yīng)是細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome，CRS)，其主要原因是CAR-T細(xì)胞技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)清除很多癌細(xì)胞，產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子，從而引起免疫反應(yīng)。同時(shí)，T細(xì)胞大量增殖引起的細(xì)胞因子釋放，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)發(fā)熱、肌痛、低血壓、呼吸衰竭等癥狀，嚴(yán)重時(shí)危及生命[39]。有研究觀察到CRS與疾病進(jìn)展程度或者腫瘤負(fù)荷相關(guān)，在高疾病負(fù)荷的患者體內(nèi)，往往有較高的細(xì)胞因子釋放?？傮w而言，第二代和第三代CAR較容易觸動(dòng)自身抗原而引起致命的CRS。嚴(yán)格按I期臨床試驗(yàn)遞增方案(爬坡試驗(yàn))，起始劑量選擇較低數(shù)量的T細(xì)胞可防止速發(fā)的、嚴(yán)重的毒性反應(yīng)。此外，利用IL-6受體拮抗藥物托珠單抗(tocilizumab)以及激素預(yù)防能夠緩解該癥狀[31]。應(yīng)注意的是，激素沖擊會(huì)降低CAR-T的療效。

4.2 靶向/脫靶毒性

CAR方法治療相關(guān)毒性多是腫瘤相關(guān)抗原特異性T細(xì)胞“脫靶”識(shí)別了患者正常組織低表達(dá)的自身抗原所致，如B細(xì)胞血液病治療中瞄定CD19分子引起的低丙種球蛋白血癥，這也是CAR-T細(xì)胞過(guò)繼后續(xù)反應(yīng)的一個(gè)間接證據(jù)[31,33]。此外，治療上仍有5%～10%的患者缺失CD19抗原，從而逃避CD19-CAR-T細(xì)胞的識(shí)別和殺傷，導(dǎo)致脫靶。另外，靶向Her-2的CAR-T細(xì)胞治療可導(dǎo)致腫瘤部位以外的其他組織或器官遭受攻擊，例如可能產(chǎn)生的心肺系統(tǒng)毒性[39]。

4.3 神經(jīng)系統(tǒng)毒性及其他細(xì)胞毒性

CAR-T治療白血病會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，這些癥狀具有多樣性，如譫妄、語(yǔ)言障礙、運(yùn)動(dòng)障礙、緘默癥、癲癇發(fā)作、肝性腦病等[31-32]，部分癥狀可自行消退。也有CAR-T引起機(jī)體自身免疫性疾病風(fēng)險(xiǎn)的報(bào)道。在患兒CAR-T治療中，部分研究觀察到巨噬細(xì)胞激活綜合征[39,49]。

4.4 實(shí)體瘤治療效果較差

目前最成功的CD19-CAR-T已經(jīng)在惡性血液疾病中取得了不錯(cuò)的效果，對(duì)于實(shí)體腫瘤的治療效果則較差。實(shí)體瘤治療的主要難點(diǎn)集中在：① 必須尋找實(shí)體瘤特異性抗原，不能侵害正常組織，這樣靜脈回輸CAR-T細(xì)胞后，T細(xì)胞才能歸巢到腫瘤位置。② CAR-T必須侵入實(shí)體瘤內(nèi)部發(fā)揮作用，但即使進(jìn)入腫瘤后，內(nèi)環(huán)境中的浸潤(rùn)性的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、程序性死亡配體PD-L1高表達(dá)、抑制性細(xì)胞因子(比如白介素10、TGFβ)，可能會(huì)抑制對(duì)其進(jìn)行殺傷的各類(lèi)T細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞也會(huì)高表達(dá)程序性死亡受體PD-1。最近的臨床試驗(yàn)在實(shí)體瘤特別是胰腺癌和肉瘤方面取得了不錯(cuò)的進(jìn)展，再次證實(shí)CAR-T細(xì)胞能夠遷移到實(shí)體腫瘤及腫瘤周?chē)鶾36-38]。有研究認(rèn)為改造后的T細(xì)胞還能表達(dá)次生CAR[29]，從而更有效地定位于發(fā)病部位?？朔?shí)體瘤治療效果差的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，針對(duì)晚期以及療效較差的實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)有可能取得較好的進(jìn)展。

4.5 其他

CAR-T需要對(duì)每例患者進(jìn)行個(gè)體化治療，因此存在治療價(jià)格偏高、療效不確定和不穩(wěn)定等問(wèn)題[40-41]。CAR-T臨床試驗(yàn)各個(gè)中心的結(jié)果不一致，標(biāo)準(zhǔn)化治療之路任重而道遠(yuǎn)。CAR-T治療后復(fù)發(fā)也需要關(guān)注，其長(zhǎng)期療效和安全性有待進(jìn)一步研究。

5 總結(jié)及展望

CAR-T細(xì)胞技術(shù)可能是從實(shí)驗(yàn)室到臨床應(yīng)用最快的一項(xiàng)技術(shù)，極大地促進(jìn)了轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展。相較于化療藥物和靶向藥物，CAR-T的靶向性更強(qiáng)，并且可以通過(guò)技術(shù)修飾達(dá)到多靶向。免疫靶向治療的多個(gè)優(yōu)點(diǎn)有助于治療某些預(yù)后極差的罕見(jiàn)腫瘤。我們有理由相信，隨著未來(lái)技術(shù)的成熟、CAR組件的進(jìn)一步改進(jìn)以及治療成本的逐漸下降，CAR-T細(xì)胞技術(shù)很有可能成為醫(yī)院和門(mén)診的常規(guī)治療方式。而且，CAR的研究并不局限于腫瘤，在目前的難治性疾病治療瓶頸中，CAR-T細(xì)胞技術(shù)都將可能是我們攻克難治性疾病的有效武器，如抗HIV等病毒的治療研究[42]。

CAR-T細(xì)胞技術(shù)的升級(jí)換代一直在持續(xù)研發(fā)中，每一個(gè)組件的進(jìn)步都可能帶來(lái)更多的臨床獲益。近年來(lái)快速發(fā)展的生物技術(shù)，也是CAR-T細(xì)胞技術(shù)成熟的推動(dòng)力。隨著未來(lái)腫瘤治療的希望必然是構(gòu)建在基于免疫療法的聯(lián)合治療之上的觀點(diǎn)的提出，相信將會(huì)有更多的生物技術(shù)投入到腫瘤免疫治療的研發(fā)中。通用型CAR-T的研發(fā)將可能解決臨床上的規(guī)?；瘧?yīng)用問(wèn)題，即采用正常第三方細(xì)胞來(lái)源的T細(xì)胞，通過(guò)敲除內(nèi)源性TCR基因，排除同種異體TCR導(dǎo)致的移植物抗宿主病，且能進(jìn)一步提高CAR-T的殺腫瘤效率[43-44]。產(chǎn)生雙特異性銜接分子的CAR-T(ENG-CAR-T)細(xì)胞具有更強(qiáng)、更持久的抗腫瘤作用[45]。多靶標(biāo)CAR-T細(xì)胞技術(shù)在臨床前實(shí)驗(yàn)中顯示出更強(qiáng)的抗瘤效應(yīng)[46]。

干細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步將進(jìn)一步豐富CAR-T療法。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)的根本，可以預(yù)測(cè)設(shè)計(jì)針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的靶向治療是今后的又一重要研究方向[47]。此外，T記憶細(xì)胞的篩選將會(huì)應(yīng)用更多，尤其是中央記憶性T干細(xì)胞的研究。Themeli等[48]首次利用誘導(dǎo)重編程干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)技術(shù)獲得靶向腫瘤細(xì)胞的T干細(xì)胞。該研究從正常外周血采集T細(xì)胞，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法導(dǎo)入OCT-4、SOX2、KLF4和c-MYC，使T細(xì)胞重編程為T(mén)-iPSC;再通過(guò)慢病毒載體將編碼針對(duì)CD19的CAR的目的基因片段插入T-iPSC，進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為同時(shí)表達(dá)CDl9-CAR和內(nèi)源性TCR的初始T細(xì)胞。