小立碗蘚PpCASLUU3基因敲除載體的構(gòu)建

陳 波，閆慧清，李 莉，曹海鵬，辛健康，姜 山

(貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001)

【研究意義】小立碗蘚(Physcomitrellapatens)是葫蘆蘚目(Funariales)葫蘆蘚科(Funariaceae)小立碗蘚屬(Physcomitrium)的蘚類。苔蘚植物是非維管束植物，隸屬于高等植物中較低等的類群，是最早登陸的陸生植物代表[1-3]。細(xì)胞凋亡(apoptosis)指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，并不是病理?xiàng)l件下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過程。半胱氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinas, caspase)作為細(xì)胞凋亡過程的重要蛋白酶在細(xì)胞凋亡的最后實(shí)施過程中起決定性的作用，作為多種凋亡程序啟動(dòng)的執(zhí)行者，有著非常重要的意義和作用[4]。其對(duì)底物的切割使得細(xì)胞呈現(xiàn)出凋亡的一系列形態(tài)和分子生物學(xué)特征：如形成凋亡小體、DNA Ladder、凋亡細(xì)胞皺縮等[5-7]?；蚯贸夹g(shù)是研究基因功能的基本手段，Caspase基因功能的研究擬采用基因敲除的技術(shù)，而基因敲除技術(shù)中載體的構(gòu)建尤為重要。小立碗蘚基因組已測(cè)序完成，其核基因組易于與有同源片段的外源DNA發(fā)生高頻率的同源重組，從而使得精確的基因敲除成為可能，為基因功能的研究提供了良好的材料。目前已成為國內(nèi)外植物分子生物學(xué)研究的模式生物[18]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】雖然植物中沒有Caspase的同源蛋白，但是植物的細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)過程有時(shí)能檢測(cè)到Caspase的活性，這種酶活性被定義為類Caspase活性(caspase-like activity)[7]，命名為類半胱氨酸蛋白酶(Metacaspase)[9]，研究顯示，有些植物能夠產(chǎn)生類似Caspase活性的物質(zhì)，并且這種酶活性能調(diào)控PCD過程[10]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[11]、番茄(Lycopersiconesculentum)[12]和其他植物中均已進(jìn)行研究報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】超敏反應(yīng)是植物防御反應(yīng)中細(xì)胞程序性死亡的一類。在灰霉菌侵入后，小立碗蘚會(huì)激發(fā)與類似超敏反應(yīng)(Hypersensitive response-like，HR-like)的防衛(wèi)反應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)室(苔蘚分子生物學(xué)與運(yùn)用研究室)前期，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，比較對(duì)照組和灰霉菌處理12 h、1 d、2 d和3 d后小立碗蘚的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，得到23個(gè)參與誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡相關(guān)差異表達(dá)基因。其中PpCASPLUU3基因在灰霉菌侵染后的12 h與其他基因相比，該基因的表達(dá)量變化最為明顯，表明PpCASPLUU3基因可能參與了由灰霉菌引起的小立碗蘚類過敏反應(yīng)。而PpCASPLUU3(GenBank：XM 024524752；類半胱氨酸蛋白酶)存在于小立碗蘚中[13]。對(duì)苔蘚植物中PpCASLUU3基因的研究尚未見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建小立碗蘚PpCASLUU3的敲除載體，為后續(xù)研究PpCASLUU3是否參與了灰霉菌引起的小立碗蘚中類過敏反應(yīng)，對(duì)早期登陸植物的防衛(wèi)防御的進(jìn)化提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 小立碗蘚和質(zhì)粒pTN182(5006 bp，用于構(gòu)建PpCASLUU3基因敲除載體)由首都師范大學(xué)何奕騉教授提供，PTN182質(zhì)粒中含有nptII，該基因在大腸桿菌中表現(xiàn)為抗卡那霉素。E.coliDH5α(用于外源基因的轉(zhuǎn)化)由貴陽醫(yī)學(xué)院提供。E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞由貴州師范大學(xué)苔蘚分子生物學(xué)與運(yùn)用研究室制備。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司，TGL-16K)，PCR儀(美國SCILOGEX公司，TC1000-G)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，THZ-92A)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司，SW-CJ-2D)，凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司，76S /07904)，恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，HHS)，電子天平(美國賽多利斯，TP-214)，電泳儀(美國 Bio-Rad公司，A101439)，滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，YXQ-LS-75)。

1.1.3 主要試劑 DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、EcoR Ⅰ、EcoR Ⅴ、BamH Ⅰ、SmaⅠPremixTaqTM、T4-DNA連接酶、氨芐青霉素(Amp)、1.5K DNA Marker均購于Takara。Plas-mid Mini Kit I試劑盒購于OMEGA biotek，卡那霉素購于美國sigma公司，酵母提取物(yeast ex-tract)和胰蛋白胨(tryptone)購于英國OXOID公司，葡萄糖、氯化鈉、氫氧化鈉及瓊脂等試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。引物的合成和序列測(cè)定工作，均委托武漢金開瑞生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 酶切位點(diǎn)的選擇 在NCBI上檢索(Genebank:XM_024524752.1)得到PpCASLUU3的DNA序列，將PpCASLUU3的DNA序列1414 bp分成上游臂(PpCASLUU3.1、700 bp)和下游臂(PpCASLUU3.2、714 bp)2段，用DNAMAN軟件進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析，結(jié)合PTN182載體序列，最終選取EcoR I、EcoR V作為構(gòu)建載體上游臂的酶切位點(diǎn)，SmaI、BamH I作為下游臂的酶切位點(diǎn)。利用Primer Primer 5軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增上、下游目的片段的引物(表1)，在引物前端加入酶切位點(diǎn)序列，根據(jù)GC含量添加合適的保護(hù)堿基[19]。然后送武漢金開瑞生物工程公司合成，作為獲取上游(PCR產(chǎn)物大小為522 bp)、下游(PCR產(chǎn)物大小為548 bp)目的片段的PCR擴(kuò)增引物。

1.2.2 目的基因的獲取 取培養(yǎng)20 d的小立碗蘚新鮮材料，超純水洗凈，用液氮充分研磨至粉末，參照DNA提取試劑盒說明書提取DNA，以提取的小立碗蘚DNA為模板，PpCASLUU3.1-F、PpCASLUU3.1-R為上游臂引物擴(kuò)增上游臂片段，同樣，以PpCASLUU3.2-F、PpCASLUU3.2-R為下游臂引物擴(kuò)增下游臂片段。PCR反應(yīng)體系如下表2，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。將PCR后的產(chǎn)物進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)后根據(jù)膠回收試劑盒說明書對(duì)目的片段進(jìn)行割膠回收，獲得目的基因。

1.2.3 PTN182質(zhì)粒提取 取含PTN182質(zhì)粒的大腸桿菌加入含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃ 220 r/min過夜培養(yǎng)，取5 mL培養(yǎng)液，根據(jù)Plas-mid Mini Kit I試劑盒說明書抽提PTN182質(zhì)粒。

表1 PpCASLUU3上下游片段擴(kuò)增的引物序列Table 1 Primer sequences of PpCASLUU3 upstream and downstream segments amplification

注：表中劃橫線部分為酶切位點(diǎn)。
Note: The underlined part in the table was the enzyme cutting site.

表2 PpCASLUU3上下游片段擴(kuò)增的PCR反應(yīng)體系Table 2 PCR reaction system of PpCASLUU3 upstream and downstream fragment amplification

1.2.4 PpCASLUU3.1-PMD19-T、PpCASLUU3.2-PMD19-T載體構(gòu)建 將上述割膠回收的目的基因按表3的連接體系，16 ℃連接30 min，采用CaCl2法制作大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞[20]。將連接液加入到100 μl的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕搖混勻，冰浴30 min，42 ℃熱激90 s后立即冰浴3 min，加入900 μl不含氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)1 h，12 000 r/min離心1 min，取100 μl上清液重懸沉淀，將重懸的菌液涂布于含Amp抗性的LB平板，放置數(shù)分鐘，待菌液干后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)16 h。待其長出單菌后，挑取單菌于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱220 r/min培養(yǎng)16 h，取2 μl菌液，以表1中的引物做菌液PCR，篩選能擴(kuò)增出目的片段的菌液，用Plas-mid Mini Kit I試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提。得到PpCASLUU3.1-pMD19-T質(zhì)粒，用EcoR I、EcoR V酶切驗(yàn)證。使用相同的方法得到PpCASLUU3.2-pMD19-T質(zhì)粒。

1.2.5 PpCASLUU3.1-PTN182載體構(gòu)建 使用EcoR I、EcoR V同步酶切PpCASLUU3.1-pMD19-T和PTN182原始載體，酶切體系如表4所示，37 ℃酶切3 h后加入5 μl loading buffer進(jìn)行1 %的瓊脂糖凝膠電泳，割取目的片段大小的條帶及酶切后的PTN182載體回收，然后按表4連接體系進(jìn)行16 ℃連接16 h，取連接產(chǎn)物5 μl轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法同1.2.2。取100 μl轉(zhuǎn)化液涂布于含卡那霉素的LB平板，待菌液干后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)16 h。挑取單菌于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱220 r/min培養(yǎng)16 h，后取2 μl菌液做菌液PCR篩選，將能擴(kuò)增出目的片段的菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，酶切驗(yàn)證，選取陽性質(zhì)粒送武漢金開瑞生物工程公司測(cè)序。

表3 PpCASLUU3.1-pMD19-T及PpCASLUU3.2-pMD19-T載連接體系Table 3 PpCASLUU3.1-pMD19-T and PpCASLUU3.2-pMD19-T vector connection system

1.2.6 PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2載體構(gòu)建 將含有PpCASLUU3.2片段的 PpCASLUU3.2-pMD19-T質(zhì)粒和PpCASLUU3.1-PTN182質(zhì)粒分別搖菌過夜，取5 mL培養(yǎng)液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，PpCASLUU3.2-pMD19-T用SmaI和BamH I進(jìn)行雙酶切，回收切出片段，與同樣酶切的PpCASLUU3.1-PTN182載體連接，獲得重組質(zhì)粒PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2(圖1)，具體方法同1.2.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 PpCASLUU3.1、PpCASLUU3.2目的基因的獲取

通過設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PpCASLUU3.1、PpCASLUU3.2目的基因，將小立碗蘚總DNA經(jīng)過PCR反應(yīng)后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2)可見：A凝膠圖上1號(hào)泳道中的PCR產(chǎn)物的條帶與PpCASLUU3.1目的基因大小條帶相同(500 bp左右)，B凝膠圖上的1號(hào)泳道中的PCR產(chǎn)物的條帶與PpCASLUU3.2目的基因條帶大小相同(500 bp左右)，A、B圖中陰性對(duì)照在500 bp左右的位置未出現(xiàn)條帶。表明該引物設(shè)計(jì)合理，能正常擴(kuò)增出目的片段，可用于目的基因的獲取。

2.2 PpCASLUU3.1-pMD19-T及PpCASLUU3.2-pMD19-T載體構(gòu)建

如圖3所示，A中1號(hào)泳道為PpCASLUU3.1-pMD19-T質(zhì)粒用EcoR I、EcoR V酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，B中1號(hào)為PpCASLUU3.2-pMD19-T質(zhì)粒用BamH I、SmaI酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖，2號(hào)均為未經(jīng)過酶切的原始質(zhì)粒，兩者質(zhì)粒酶切后在泳道的相應(yīng)位置均出現(xiàn)了與目的片段(500 bp左右)大小一致的條帶。說明，PpCASLUU3.1、PpCASLUU3.2片段成功的克隆到pMD19-T載體中。

圖1 PpCASLUU3-PTN182載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of PpCASLUU3-PTN182 vector construction

表4 目的片段及載體體系Table 4 Objective fragment and vector enzyme cutting system

A圖中1為PpCASLUU3.1目的基因，2為陰性對(duì)照。 B圖中1為PpCASLUU3.2目的基因，2為陰性對(duì)照。 M：Marker= 15 000 bpFig.A1, PpCASLUU3.1; 2. Negative control. Fig.B 1, PpCASLUU3.2; 2. Negative control. M: Marker= 15 000 bp圖2 PpCASLUU3.1、PpCASLUU3.2目的基因的獲取Fig.2 Acquisition of target genes of PpCASLUU3.1 and PpCASLUU3.2

2.3 PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2載體構(gòu)建

通過篩選后的質(zhì)粒用EcoR I、EcoR V酶切后如上圖4A中的1號(hào)泳道所示，用BamH I、SmaI酶切驗(yàn)證如上圖4B中的1號(hào)泳道所示，兩者均能切出與目的片段大小的條帶，2號(hào)為對(duì)照(未用限制性內(nèi)切酶酶切)，在目的片段大小的位置處無條帶出現(xiàn)，表明PpCASLUU3.1、PpCASLUU3.2目的片段均已插入PTN182中。

由圖5可見，經(jīng)測(cè)序PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2 載體的PpCASLUU3.1序列與原始PpCASLUU3.1序列比對(duì)，相似高度達(dá)100 %。而載體上的PpCASLUU3.2序列與原始PpCASLUU3.2序列比對(duì)，相似度為99.63 %，證明PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2敲除載體構(gòu)建成功。

A為PpCASLUU3.1-pMD19-T質(zhì)粒酶切驗(yàn)證圖，1表示用EcoR I、EcoR V酶切的質(zhì)粒，2表示未酶切的PpCASLUU3.1-pMD19-T質(zhì)粒。B為PpCASLUU3.2-pMD19-T質(zhì)粒酶切驗(yàn)證圖，1表示用BamH I、Sma I酶切的質(zhì)粒，2表示未酶切的PpCASLUU3.2-pMD19-T質(zhì)粒，M：Marker = 15 000 bpNote: A. Verification diagram of plasmid digestion of PpCASLUU3.1-pMD19-T. 1, plasmid digestion with EcoR I and EcoR V; 2, plasmid digestion of PpCASLUU3.1-pMD19-T without enzyme digestion. B, enzyme digestion verification diagram of PpCASLUU3.2-pMD19-T plasmid, 1, plasmid digested by BamH I and Sma I; 2, plasmid digested by PpCASLUU3.2-pMD19-T without enzyme digestion, M: Marker = 15 000bp圖3 PpCASLUU3.1-pMD19-T、PpCASLUU3.2-pMD19-T質(zhì)粒酶切驗(yàn)證圖譜Fig.3 PpCASLUU3.1-pMD19-T and PpCASLUU3.2-pMD19-T plasmid digestion verification diagram

A 圖中1用EcoR I、EcoR V酶切的質(zhì)粒，2未經(jīng)過酶切的PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2質(zhì)粒。B圖中1用BamH I、Sma I酶切的質(zhì)粒，2表示未經(jīng)過酶切的PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2質(zhì)粒A, plasmid 1 was digested by EcoR I and EcoR V; 2, undigested PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2 plasmid. B, plasmid 1 was digested by BamH I and Sma I; plasmid 2 was undigested PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2圖4 PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2質(zhì)粒酶切驗(yàn)證圖譜Fig.4 PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2 plasmid digestion verification diagram

圖5 PpCASLUU3.1與PpCASLUU3.2插入片段測(cè)序Fig.5 PpCASLUU3.1 and PpCASLUU3.2 insert fragment sequencing results

3 討 論

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建敲除載體的方法也越來越多，如Gateway、in-fusion、TA克隆技術(shù)等。Gateway技術(shù)是一種快速構(gòu)建載體的方法，主要利用噬菌體體外位點(diǎn)特異性重組構(gòu)建載體，其特點(diǎn)是反應(yīng)時(shí)間短，不需要限制性內(nèi)切酶和連接酶參與便可完成[21]。in-fusion是一種快速將片段與載體進(jìn)行無縫連接的方法，能夠一次性插入多個(gè)片段，無需酶切和連接步驟，操作簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)[22]。但以上兩種方法成本都較高[21]。而TA克隆技術(shù)(TA cloning)是利用Taq聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)活性，但卻不具有3′和5′端外切酶校準(zhǔn)活性的特點(diǎn)，可在PCR產(chǎn)物的3′端加上一個(gè)非模板依賴堿基A。pMD19-T載體的3′攜帶一個(gè)堿基T。能高效地與帶A尾的PCR產(chǎn)物連接，極大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR產(chǎn)物最簡(jiǎn)便、快捷的方法[23]。鑒于此，試驗(yàn)選用了TA 克隆技術(shù)將PCR產(chǎn)物直接克隆到pMD19-T中，測(cè)序驗(yàn)證后將其酶切、連接到PTN182載體中，此法的酶切效率比直接酶切PCR產(chǎn)物高，可獲得較純的酶切片段，使得后續(xù)實(shí)驗(yàn)更為順利。在獲取PCR產(chǎn)物時(shí)，以小立碗蘚DNA為模板，使用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)的小立碗蘚PpCASLUU3基因上、下游同源臂的引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到小立碗蘚PpCASLUU3基因的上、下游同源臂，如圖2A、B中的2號(hào)泳道(對(duì)照)出現(xiàn)的條帶均低于250 bp，這可能是引物自身結(jié)合形成的二聚體所導(dǎo)致，試驗(yàn)采取割膠的方法回收PCR產(chǎn)物，此結(jié)果對(duì)后續(xù)試驗(yàn)無影響。

在載體構(gòu)建過程中，酶切位點(diǎn)的選擇尤為關(guān)鍵，試驗(yàn)在同一載體中分2次插入，進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析的時(shí)候應(yīng)將2條片段同時(shí)放入DNAMAN軟件中進(jìn)行分析，避免所選擇的酶在另一片段中存在作用位點(diǎn)。盡量選擇一些能共用Buffer、作用溫度相同的酶，這樣可以進(jìn)行同步酶切，相對(duì)于分步酶切可節(jié)約大量時(shí)間。限制行內(nèi)切酶在識(shí)辨太近、以及共用堿基對(duì)的酶切位點(diǎn)時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，所以在選擇酶切位點(diǎn)時(shí)應(yīng)盡量避開兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間堿基相隔少、共用堿基對(duì)這兩者因素，因此在選擇載體的酶切位點(diǎn)時(shí)需避開以上述情況，保證載體能夠充分的被切開。

構(gòu)建載體時(shí)若采用內(nèi)切酶直接切割PCR產(chǎn)物的方式進(jìn)行載體構(gòu)建，得到的陽性克隆極少，載體構(gòu)建效率低下。而采用此法后，得到的陽性克隆明顯增多，載體構(gòu)建的效率得到極大的提升。

4 結(jié) 論

用T4-DNA連接酶將酶切得到的目的片段與相同酶切后的PTN182載體連接，通過PCR陽性檢測(cè)、酶切和測(cè)序驗(yàn)證等結(jié)果證明PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2敲除載體構(gòu)建成功。該載體的構(gòu)建成功，為小立碗蘚中PpCASLUU3基因敲除提供了條件，為PpCASLUU3基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。