基于斑馬魚模型的知母皂苷BⅡ的血管保護(hù)作用及機制研究

杜孟姣 陳堅平 余嘉賢 梅文杰 余楚欽 王延?xùn)|

摘 要 目的：研究知母皂苷BⅡ（TB-Ⅱ）的血管保護(hù)作用，并探討其可能的作用機制。方法：以養(yǎng)殖水為空白對照，考察100、200和400 μg/mL TB-Ⅱ培養(yǎng)受精后24 h（24 hpf）的正常斑馬魚胚胎48 h后對其腸下靜脈血管（SIVs）的影響。采用酪氨酸激酶抑制劑PTK787（0.06 μg/mL）誘導(dǎo)斑馬魚腸下血管損傷模型;以0.1%二甲基亞砜、不加PTK787為空白對照，加PTK787、不加藥物為模型對照，考察100、200、400 μg/mL TB-Ⅱ作用48 h后對血管損傷模型斑馬魚SIVs的影響，并采用實時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測斑馬魚體內(nèi)fam樣酪氨酸激酶1（Flt-l）、含激酶插入?yún)^(qū)受體（Kdr）、含激酶插入?yún)^(qū)受體l（Kdr-l）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）以及腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6） mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果：100 μg/mL TB-Ⅱ作用后可顯著增加正常斑馬魚的SIVs出芽數(shù)（P<0.05），200 μg/mL TB-Ⅱ作用后可顯著增加正常斑馬魚的SIVs數(shù)（P<0.05）。與空白對照比較，PTK787作用后斑馬魚SIVs數(shù)顯著減少（P<0.01），F(xiàn)lt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A、TNF-α和IL-6 mRNA的相對表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;而經(jīng)不同質(zhì)量濃度的TB-Ⅱ作用后，血管損傷模型斑馬魚的SIVs數(shù)均不同程度地增加，F(xiàn)lt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A、TNF-α和IL-6 mRNA相對表達(dá)量均不同程度地升高，除100 μg/mL TB-Ⅱ作用后斑馬魚SIVs數(shù)和Flt-l、TNF-α mRNA表達(dá)量以及400 μg/mL TB-Ⅱ作用后斑馬魚TNF-α mRNA表達(dá)量增加不顯著外，其余指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：TB-Ⅱ具有一定的促血管新生和修復(fù)受損血管的作用，其機制可能與上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子受體和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)相關(guān)。

關(guān)鍵詞 知母皂苷BⅡ;血管保護(hù);斑馬魚;腸下靜脈血管;機制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the protective effect of timosaponin BⅡ （TB-Ⅱ） on blood vessels and explore its possible mechanism. METHODS： Using aquaculture water as blank control， the effects of 100， 200 and 400 μg/mL TB-Ⅱ treatment for 48 h on the situation of subintestinal veins （SIVs） in normal zebrafish embryos 24 h after fertilization （24 hpf） were investigated. PTK787 （0.06 μg/mL）， a tyrosine kinase inhibitor， was used to induce the model of zebrafish intestinal vascular injury; using combing with 0.1% dimethyl sulfoxide but no PTK787 as blank control， combing with PTK787 but no drug as model control， the effects treatment of 100， 200 and 400 μg/mL TB-Ⅱ for 48 h on the SIVs of zebrafish model with vascular injury were investigated. Relative expressions of fam-like tyrosine kinase 1 （Flt-1）， kinase insert domain containing receptor （Kdr）， kinase insert domain containing receptor l （Kdr-l）， vascular endothelial growth factor A （VEGF-A）， tumor necrosis factor α （TNF-α） and interleukin 6 （IL-6） mRNA were detected by RT-PCR. RESULTS： 100 μg/mL TB-Ⅱ could significantly increase the sprouting vessel of normal zebrafish SIVs sprouting vessel number （P<0.05）， and 200 μg/mL TB-Ⅱ could significantly increase SIVs number of normal zebrafish （P<0.05）. Compared with blank control， SIVs number of zebrafish decreased significantly after PTK787 treatment （P<0.01）， and the relative expressions of Flt-l， Kdr， Kdr-l， VEGF-A， TNF-α and IL-6 mRNA were alse decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After treated with different concentrations of TB-Ⅱ， SIVs number of vascular injury model zebrafish increased to different extents; relative expressions of Flt-l， Kdr， Kdr-l， VEGF-A， TNF-α and IL-6 mRNA were increased to different extents. There was no significant difference in SIVs number and the expression of Flt-l， TNF-α mRNA in zebrafish treated with 100 μg/mL TB-Ⅱ and the expression of TNF-α mRNA in zebrafish treated with 400 μg/mL TB-Ⅱ， but there was statistical significance in other indexes? （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TB-Ⅱ has a certain function of promoting angiogenesis and repairing damaged blood vessels， and its mechanism is related to the up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor and pro-inflammatory cytokine expression.

KEYWORDS? ?Timosaponin BⅡ; Vascular protection; Zebrafish; Subintestinal veins; Mechanism

知母為百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的根莖[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性寒，味苦，具有滋陰降火、止渴除煩等藥理作用，是中醫(yī)臨床常用的傳統(tǒng)藥物[2]。知母皂苷BⅡ（TB-Ⅱ）作為知母的主要活性成分，具有抗炎[3]、抗病毒[4]、抗癌[5]等多種藥理活性。Guo CR等[6]在細(xì)胞層面的研究發(fā)現(xiàn)，TB-Ⅱ具有防止糖尿病心血管并發(fā)癥的潛力，可能具有心血管保護(hù)作用。但關(guān)于TB-Ⅱ的血管保護(hù)作用在體內(nèi)動物模型層面并未被證實，并且在基因?qū)用?，TB-Ⅱ的血管保護(hù)作用機制也不明確。目前，血管保護(hù)藥物的篩選模型多為體外試驗，其結(jié)果需要借助體內(nèi)模型驗證和評價。斑馬魚是一種優(yōu)良的脊椎動物模型，借助具有快速篩選、高通量化、與人的遺傳物相似度高等優(yōu)點的轉(zhuǎn)基因斑馬魚來作為藥物篩選模型，得到了廣泛的關(guān)注[7]。而且在斑馬魚發(fā)育過程中，其腸下靜脈血管（SIVs）區(qū)域是一個光滑的籃網(wǎng)形結(jié)構(gòu)，在發(fā)育初期清晰可見，利于觀察和統(tǒng)計[8]，已成為血管研究的重要模型[9]。因此，本研究以熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（fli1：EGFP）為體內(nèi)模型動物，探究TB-Ⅱ的血管保護(hù)作用，并利用實時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測不同質(zhì)量濃度TB-Ⅱ?qū)Π唏R魚體內(nèi)fam樣酪氨酸激酶1（Flt-l）、含激酶插入?yún)^(qū)受體（Kdr）、含激酶插入?yún)^(qū)受體1（Kdr-l）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）的mRNA表達(dá)，從而探究TB-Ⅱ保護(hù)血管的可能機制，為TB-Ⅱ血管保護(hù)作用的進(jìn)一步開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Z-A-S5型斑馬魚養(yǎng)殖單元（上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司）;SZ780型連續(xù)變倍體視顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）;CFX96型實時熒光定量-PCR儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）;ZXSD-A1090型生化培養(yǎng)箱（上海智誠分析儀器制造有限公司）;DMi8型熒光顯微鏡（德國Leica公司）;CP225D型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）;1424R型低溫冷凍離心機（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）;K2800型微量分光光度計（北京凱奧科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

TB-Ⅱ?qū)φ掌?（西安匯林生物科技有限公司，批號：18041004，純度：≥98%）;酪氨酸激酶抑制劑PTK787（批號：A0625AS，純度：>98%）;胰蛋白酶（批號：19030710，純度：≥99%）均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司;RNA抽提試劑Trizol（美國Invitrogen公司，批號：15596026）;PCR反應(yīng)試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司，批號分別為RR420AA、2641A-1）;二甲基亞砜（DMSO）、異丙醇、三羥甲基氨基甲烷（Tris）堿（廣州化學(xué)制劑總廠，均為分析純）;PCR引物由深圳優(yōu)迪生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成;水為自制養(yǎng)殖水。

1.3 動物

成年熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（fli1：EGFP），雌雄兼有，購自中國斑馬魚資源中心。斑馬魚飼養(yǎng)于循環(huán)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，水溫控制在（28.5±1.0） ℃、pH為 6.9～7.5、光照（14 h）/黑暗（10 h）周期交替，每天喂食3次鹽水蝦。

2 方法

2.1 斑馬魚胚胎的培養(yǎng)與收集

在繁殖的前一天晚上，將雌雄斑馬魚按照1 ∶ 1的比例放入繁殖盒中，使用隔板將不同性別的斑馬魚隔開。次日清晨，將繁殖隔板拆掉，在燈亮（光照強度54～324 lux）條件下30 min內(nèi)，由斑馬魚自然交配，自然產(chǎn)生斑馬魚胚胎。收集斑馬魚胚胎，用水清洗多次，轉(zhuǎn)入干凈的培養(yǎng)皿中，即獲得了實驗所需的斑馬魚胚胎。

2.2 TB-Ⅱ?qū)φ０唏R魚血管新生的影響考察

將受精后24 h（24 hpf）的斑馬魚胚胎用胰蛋白酶進(jìn)行脫膜處理后，在體視顯微鏡下將其隨機暴露于24孔板中，每孔16個胚胎。實驗設(shè)置TB-Ⅱ不同質(zhì)量濃度組（100、200、400 μg/mL，以水為溶劑制備）和空白對照組（水），每孔加入相應(yīng)溶液1 mL。加藥完畢后，將24孔板用錫紙遮光，置于溫度28.5 ℃、光照（14 h）/黑暗（10 h）交替的環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，在熒光顯微鏡下觀察各組斑馬魚SIVs數(shù)和SIVs出芽數(shù)。

2.3 TB-Ⅱ?qū)TK787誘導(dǎo)的血管損傷斑馬魚血管新生的影響考察

將24 hpf的斑馬魚胚胎用胰蛋白酶進(jìn)行脫膜處理后，在體視顯微鏡下隨機暴露于24孔板中，每孔16個胚胎。采用酪氨酸激酶抑制劑PTK787誘導(dǎo)斑馬魚腸下血管損傷模型。實驗設(shè)置TB-Ⅱ不同質(zhì)量濃度組（100、200、400 μg/mL TB-Ⅱ溶液+0.06 μg/mL PTK787溶液，DMSO終濃度為0.1%）、模型對照組（0.06 μg/mL PTK787溶液，DMSO終濃度為0.1%）和空白對照組（0.1%DMSO），每組均按1 mL/孔加入相應(yīng)溶液。加藥完畢后，將24孔板用錫紙遮光，置于溫度28.5 ℃、光照（14 h）/黑暗（10 h）交替的環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，在熒光顯微鏡下觀察各組斑馬魚SIVs數(shù)。

2.4 TB-Ⅱ?qū)TK787誘導(dǎo)的血管損傷斑馬魚體內(nèi)相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響考察

采用實時熒光定量PCR法進(jìn)行檢測。將24 hpf的斑馬魚胚胎用胰蛋白酶進(jìn)行脫膜處理后，在體視顯微鏡下隨機暴露于24孔板中，每孔16個胚胎。實驗分組、給藥及培養(yǎng)情況同“2.3”項。培養(yǎng)48 h后，每孔隨機抽取3條斑馬魚，按照Trizol試劑說明書操作提取斑馬魚總RNA，再按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板采用兩步法進(jìn)行PCR擴增。擴增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸34 s，39個循環(huán);反應(yīng)體系：cDNA（稀釋5倍）5 μL，SYBR Premix Ex Taq （Tli RNaseH Plus） 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 4 μL，共20 μL。以甘酒醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔct法計算各目標(biāo)基因的相對表達(dá)量。引物序列及產(chǎn)物長度詳見表1。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時組間兩兩比較采用Dunnett檢驗，方差不齊性時組間兩兩比較采用Dunnetts T3檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 TB-Ⅱ?qū)φ＾D(zhuǎn)基因斑馬魚血管新生的影響

與空白對照組比較，TB-Ⅱ 100 μg/mL組斑馬魚SIVs出芽數(shù)顯著增加（P<0.05），TB-Ⅱ 200 μg/mL組斑馬魚SIVs數(shù)顯著增加（P<0.01），提示TB-Ⅱ具有促進(jìn)斑馬魚血管新生的作用，結(jié)果詳見圖1、表2。

3.2 TB-Ⅱ?qū)ρ軗p傷斑馬魚血管新生的影響

與空白對照組比較，模型對照組斑馬魚SIVs數(shù)顯著

3.3 TB-Ⅱ?qū)ρ軗p傷斑馬魚體內(nèi)Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型對照組斑馬魚體內(nèi)Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A mRNA的相對表達(dá)量顯著降低（P<0.05或P<0.01）。與模型對照組比較，TB-Ⅱ 100 μg/mL組斑馬魚體內(nèi)Kdr、Kdr-l、VEGF-A mRNA的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05或P<0.01），但Flt-l mRNA的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;TB-Ⅱ 200、400 μg/mL組斑馬魚體內(nèi)Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.01），結(jié)果詳見表4。

3.4 TB-Ⅱ?qū)ρ軗p傷斑馬魚體內(nèi)TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型對照組斑馬魚體內(nèi)TNF-α、IL-6 mRNA的相對表達(dá)量顯著降低（P<0.01）。與模型對照組比較，TB-Ⅱ 100、400 μg/mL組斑馬魚體內(nèi)TNF-α mRNA的相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），IL-6 mRNA的相對表達(dá)量顯著升高（P<0.05或P<0.01）;而TB-Ⅱ 200 μg/mL組斑馬魚體內(nèi)TNF-α、IL-6 mRNA的相對表達(dá)量均顯著升高（P<0.01），結(jié)果詳見表5。

4 討論

在前期研究中，筆者根據(jù)經(jīng)濟合作與發(fā)展組織提案斑馬魚胚胎毒性試驗（OECD，2013）進(jìn)行了斑馬魚胚胎的急性毒性評價[10]，結(jié)果顯示，在96 hpf時，100、200、400、600 μg/mL TB-Ⅱ作用后斑馬魚胚胎的存活率分別為100%、94.8%、98.2%、100%;在72 hpf時，100、200、400、600 μg/mL TB-Ⅱ作用后斑馬魚胚胎全部孵化（存活率為100%），但是600 μg/mL TB-Ⅱ作用后斑馬魚胚胎出現(xiàn)了畸形、心包水腫。因此，本研究選用100、200、400 μg/mL這3個質(zhì)量濃度作為本研究的實驗濃度。PTK787是一種酪氨酸激酶抑制劑，其能夠顯著抑制Kdr，從而引起血管損傷[11]。因此，本研究利用PTK787來構(gòu)建血管損傷模型，模擬缺血區(qū)域的血管內(nèi)皮損傷。

血管新生是指從原有的血管結(jié)構(gòu)中生成新的血管，涉及內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移、基底膜降解、血管管腔形成等一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程[12]。VEGF及VEGF受體（VEGFR）是血管生成的關(guān)鍵信號分子，兩者結(jié)合后能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶（eNOS）的釋放，從而引起血管舒張，使血管通透性增加，達(dá)到促血管新生的作用[13]。VEGF是一個家族，包括了VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盤生長因子（PIGF）。VEGFR主要有3類，分別為Flt-l、Kdr和VEGFR-3。其中，F(xiàn)lt-l主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、造血肝細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，Kdr分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，VEGFR-3主要分布于成人淋巴內(nèi)皮表面[14]。其中，F(xiàn)lt-l和Kdr可調(diào)控VEGF/VEGFR系統(tǒng)，促進(jìn)血管新生。另外VEGF-A是血管生成的主要調(diào)控因子，其可結(jié)合并激活2種酪氨酸激酶受體Flt-l和Kdr[15]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Kdr-l亦和血管新生有關(guān)聯(lián)[16]。因此，本研究選用Flt-l、Kdr、Kdr-l和VEGF-A來研究TB-Ⅱ?qū)EGFR的調(diào)控能力。此外，已有研究報道，免疫系統(tǒng)在血管生成中具有重要的作用，促炎細(xì)胞因子（如IL-6、TNF-α等）已被報道具有促進(jìn)血管生成的作用[17-18]。因此，本研究通過觀察TB-Ⅱ?qū)Π唏R魚體內(nèi)IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)的影響，從炎癥免疫角度闡釋TB-Ⅱ血管保護(hù)的機制，從而為TB-Ⅱ防治心血管疾病提供實驗依據(jù)。

從本研究結(jié)果可知，在正常轉(zhuǎn)基因斑馬魚中，一定濃度的TB-Ⅱ可顯著增加SIVs數(shù)和SIVs出芽數(shù)，表明TB-Ⅱ?qū)φ０唏R魚有促血管生成作用。而在PTK787誘導(dǎo)的血管損傷模型斑馬魚中，100、200、400 μg/mL TB-Ⅱ均可不同程度地抑制PTK787對血管的損傷，增加SIVs數(shù)，這表明TB-Ⅱ?qū)κ軗p血管亦具有改善作用。在基因?qū)用嫔希?00、200、400 μg/mL的TB-Ⅱ均能夠不同程度地逆轉(zhuǎn)PTK787誘導(dǎo)的斑馬魚體內(nèi)Flt-l、Kdr、Kdr-l、VEGF-A、TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)量的下降，從而修復(fù)血管損傷，發(fā)揮血管改善作用。因此，筆者推斷TB-Ⅱ可通過上調(diào)VEGFR和促炎細(xì)胞因子，發(fā)揮其促血管新生以及修復(fù)受損血管的作用。

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（收稿日期：2019-11-20 修回日期：2020-01-19）

（編輯：林 靜）