蒲黃不同藥用部位的質(zhì)量比較

嚴華 魏鋒 馬雙成

摘 要 目的：比較草蒲黃和蒲黃花粉的質(zhì)量差異，為蒲黃質(zhì)量標準的完善提供科學依據(jù)。方法：收集15批次草蒲黃，按照2015年版《中國藥典》中蒲黃相關(guān)方法篩分出篩下蒲黃花粉和篩上雜質(zhì)（花絲、花藥），通過雜質(zhì)百分比、性狀、顯微鏡鑒別、薄層色譜鑒別確證草蒲黃和蒲黃花粉、花絲、花藥的特征和成分，采用高效液相色譜法測定草蒲黃、蒲黃花粉、篩上雜質(zhì)（花絲、花藥）中異鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷的含量。結(jié)果：草蒲黃為蒲黃花粉、花藥及花絲的混合物，呈棕黃色絮狀;蒲黃花粉呈黃色粉末，手感細膩，氣微，味淡，細胞表面略呈條狀;花絲和花藥呈絲狀、短線狀，手感粗澀，表面觀細胞呈長條形。草蒲黃、蒲黃花粉及蒲黃雜質(zhì)的薄層色譜鑒別結(jié)果具有一致的色譜斑點;含量測定結(jié)果顯示，異鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷及其二者總含量在蒲黃花粉中均最高（分別為0.42%、0.24%、0.64%），草蒲黃其次（0.22%、0.17%、0.39%），篩上雜質(zhì)中含量最低（0.19%、0.14%、0.33%）;草蒲黃與篩上雜質(zhì)中異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的總含量均未達到2015年版《中國藥典》規(guī)定含量限度（不得少于0.50%）。結(jié)論：蒲黃的藥用成分主要存在于花粉中。建議草蒲黃應作為獲取花粉的原料，而不宜直接藥用。

關(guān)鍵詞 蒲黃;草蒲黃;藥用部位;異鼠李素-3-O-新橙皮苷;香蒲新苷;質(zhì)量標準

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To compare the quality between Stamen typhae and pollen of T. angustifolia， and provide scientific evidence for the improvement of quality standard of T. angustifolia. METHODS： Fifteen batches of S. typhae were collected. Pollen minus sieve， impurity plus sieve （filament and anther） were sift out from S. typhae according to the identification method of T. angustifolia in Chinese Pharmacopoeia （2015 edition）. The characteristics and components of S. typhae and pollen， filament and anther of T. angustifolia were comfirmed by impurity， character examination and microscope， TLC. The contents of isorhamnetin-3-O-neohesperidoside and typhaneoside in S. typhae and pollen， impurities plus sieve （filament and anther） of T. angustifolia were determined by HPLC. RESULTS： S. typhae was a mixture of pollen， anther and filament of T. angustifolia， in the form of brownish yellow flocculent. The pollen of S. typhae was yellow powder with delicate hand feel， slight smell and light taste; the surface of cells was slightly striped. The filaments and anthers were filiform and short-term， rough and astringent， and the cell surface were long strip. TLC chromatogram of S. typhae， pollen and impurity of T. angustifolia had the same color spots at the same location. The contents of isorhamnetin-3-O-neohesperidoside， typhaneoside and their aggregate were the highest in pollen （0.42%， 0.24%， 0.64%）; the second in S. typhae （0.22%， 0.17%， 0.39%）; the lowest in the impurities plus sieve （0.19%， 0.14%， 0.33%）. The total contents of isorhamnetin-3-O-neohesperidoside and typhaneoside in S. typhae and in impurities plus sieve did not reach the content limit stipulated in Chinese Pharmacopoeia （not less than 0.50%）. CONCLUSIONS： The medicinal components of T. angustifolia mainly exist in pollen. It is suggested that S. typhae should be used as the raw material to obtain pollen， and should not be used directly.

KEYWORDS? ?Typha angustifolia; Stamen typhae; Medicinal part; Isorhamnetin-3-O-neohesperidoside;

中藥蒲黃在2015年版《中國藥典》（一部）中的記載為：“蒲黃為香蒲科植物水燭香蒲（Typha angustifolia L.）、東方香蒲（Typha orientalis Presl）或同屬植物的干燥花粉。夏季采收蒲棒上部的黃色雄花序，曬干后碾軋，篩取花粉。剪取雄花后，曬干，成為帶有雄花的花粉，即為草蒲黃”[1]。由此可見，蒲黃既可以是純花粉，也可以是包含雄花或雄花序的花粉（下文分別以“蒲黃花粉”和“草蒲黃”描述），蒲黃為蒲黃花粉與草蒲黃的統(tǒng)稱。但有研究表明，蒲黃花粉與草蒲黃的質(zhì)量差異顯著，蒲黃花粉的質(zhì)量明顯優(yōu)于草蒲黃[2]。而《中國藥典》記載的蒲黃的檢驗項目均未明確說明是否適用于蒲黃花粉和草蒲黃[1]。這為蒲黃的質(zhì)量控制帶來一定的困擾。

2017-2018年市場和流通領(lǐng)域抽驗結(jié)果顯示，市場常依據(jù)蒲黃中蒲黃花粉的純度對其進行等級劃分[3-4]，但由于摻雜的蒲黃花粉和草蒲黃的外觀不易分辨，使得草蒲黃常作為蒲黃主流商品銷售[5-8]。為此，筆者深入蒲黃主產(chǎn)區(qū)內(nèi)蒙古實地調(diào)研了其生產(chǎn)、加工過程，并結(jié)合藥材市場考察，獲取不同環(huán)節(jié)（包括生產(chǎn)采收、晾曬加工、流通銷售等）的代表性樣品，通過雜質(zhì)檢查、薄層色譜分析及含量測定等方法，分析比較草蒲黃及其篩下蒲黃花粉和篩上雜質(zhì)（含雄蕊、花絲等）中主要化學成分異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的含量差異，旨為完善蒲黃質(zhì)量標準提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

2695-2996系列高效液相色譜（HPLC）儀（美國Waters公司）;SZX16型體視顯微鏡、BX53型生物顯微鏡（日本Olympus公司）;CAMAG型薄層色譜系列儀器，配有全自動點樣儀、薄層雙槽展開缸、Reprostar 3型薄層成像系統(tǒng)、Wincat薄層色譜軟件（瑞士Camag公司）;FED-115型熱循環(huán)干燥箱（德國Binder公司）;XSE 205型分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司];KQ-300DAG型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;DK-98-Ⅰ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 藥材與試劑

草蒲黃于2018年6-7月采自或購自內(nèi)蒙古、山東、廣東、湖北等地區(qū)，均為野生品，經(jīng)中國食品藥品檢定研究院張南平主任藥師鑒定均為香蒲科植物水燭香蒲（T. angustifolia L.）的雄花，樣品陰干后備用。蒲黃對照藥材（蒲黃花粉，批號：121225-201804）、異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品（批號：111571-201806，純度：93.0%）、香蒲新苷對照品（批號：111573-201806，純度：96.5%）均由中國食品藥品檢定研究院提供;乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為自制超純水。草蒲黃樣品來源信息詳見表1。

1.3 其他

聚酰胺薄膜（臺州市路橋四甲生化塑料廠，規(guī)格：20 cm×10 cm）。

2 方法與結(jié)果

2.1 雜質(zhì)檢查

依照《中國藥典》蒲黃標準中“檢查”項方法[1]操作：取各批草蒲黃藥材樣品10 g，未經(jīng)碾壓處理，稱定質(zhì)量，置于七號篩中，保持水平狀態(tài)過篩，左右往返，邊篩邊輕叩2 min。獲取篩下蒲黃花粉樣品和篩上雜質(zhì)樣品兩部分，稱定雜質(zhì)的質(zhì)量，計算雜質(zhì)質(zhì)量在草蒲黃中所占百分比（%），平行操作2次，取平均值。結(jié)果，序號1～15草蒲黃樣品中雜質(zhì)質(zhì)量百分比分別為94.7%、93.6%、92.7%、94.1%、24.1%、50.3%、86.9%、64.8%、68.1%、41.0%、80.0%、74.8%、34.8%、26.8%、24.6%（n=2）。由此可見，草蒲黃中雜質(zhì)質(zhì)量百分比差異較大，部分草蒲黃中雜質(zhì)所占比例極高，遠高于《中國藥典》規(guī)定的蒲黃雜質(zhì)檢查限度（≤10.0%）[1]。

2.2 性狀檢查

2.2.1 肉眼 取各批草蒲黃樣品及其篩下蒲黃花粉和篩上雜質(zhì)部分（再過四號篩）各適量，于光線充足條件下肉眼觀察其性狀。結(jié)果顯示，草蒲黃為花粉、花藥及花絲的混合物，呈棕黃色絮狀。篩上雜質(zhì)主要為花絲和花藥，花絲呈絲狀，不規(guī)則彎曲或纏繞成團，顯棕黃色至棕色，手捻易成團，手感粗澀;花藥呈短線狀，長0.2～0.3 cm，顯棕黃色，手捻易碎，手感粗糙。篩下蒲黃花粉呈粉末狀，顯黃色，手捻有光滑感，易附著于手指上，手感細膩，氣微，味淡。草蒲黃、雜質(zhì)、蒲黃花粉的圖片詳見圖1。

2.2.2 體視顯微鏡 在50倍體視顯微鏡下觀察蒲黃花粉、花藥及花絲的形狀。結(jié)果顯示，蒲黃花藥具有四棱，棱槽明顯，頂端呈褐色至黑褐色;花絲呈細線狀;花粉為細小顆粒，詳見圖2。

2.2.3生物顯微鏡 取各批草蒲黃樣品及其篩下蒲黃花粉、篩上花絲（再過四號篩）各適量，分別置于水合氯醛-甘油（1 ∶ 1，V/V）溶液中，加熱透化裝片，置于100倍和400倍生物顯微鏡下檢視。結(jié)果顯示，草蒲黃顯黃色。蒲黃花粉呈類圓形或橢圓形，直徑17～29 μm，表面有網(wǎng)狀雕紋，周邊輪廓線光滑，呈波狀或齒輪狀，具單孔，但不甚明顯，花粉囊壁細胞表面略呈條狀，細胞界限不明顯，有不規(guī)則螺狀紋理。蒲黃花絲碎片顯無色或淡棕黃色，表面觀細胞呈長條形，排列緊密，呈草酸鈣針晶束狀，長50～70 μm，散在或存在于薄壁細胞中。草蒲黃、蒲黃花粉和花絲的生物顯微圖詳見圖3。

2.3 薄層色譜鑒別

2.3.1 供試品溶液制備 取草蒲黃或其篩下蒲黃花粉、篩上雜質(zhì)樣品粉末各2 g，加80%乙醇50 mL，冷浸24 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加水5 mL使溶解，濾過;濾液加水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次5 mL;合并正丁醇萃取液，蒸干，殘渣加乙酸乙酯2 mL使溶解，即得。

2.3.2 對照藥材溶液制備 取蒲黃對照藥材2 g，按“2.3.1”項下方法制成對照藥材溶液。

2.3.3 對照品溶液制備 取異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品、香蒲新苷對照品各適量，加乙醇分別制成每1 mL含上述成分均為0.5 mg的溶液，即得。

2.3.4 陰性對照溶液制備 按“2.3.1”項下方法取除藥材樣品外的試劑，制成陰性對照溶液。

2.3.5 展開預檢視 吸取不同批次草蒲黃供試品溶液及其篩上雜質(zhì)供試品溶液、篩下蒲黃花粉供試品溶液，以及對照藥材溶液、對照品溶液和陰性對照溶液各2? ?μL，分別點于同一聚酰胺薄膜上，以丙酮-水（1 ∶ 2，V/V）為展開劑，展開。取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，于紫外光燈（365 nm波長）下檢視，部分薄層色譜圖詳見圖4。

由圖4顯示，草蒲黃及其篩下蒲黃花粉和篩上雜質(zhì)具有一致的色譜斑點，且在與對照藥材和對照品色譜相應位置均分別顯一致的斑點，雜質(zhì)的斑點與草蒲黃的斑點大小基本一致，均較蒲黃花粉的斑點稍小，說明雜質(zhì)中成分與花粉的成分類別一致。

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Perkin Elmer C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈-0.05%磷酸溶液（15 ∶ 85， V/V）;檢測波長：254 nm;流速：1 mL/min;柱溫：35 ℃;進樣量：5～20 μL（視峰面積的大小適當調(diào)整）。

2.4.2 供試品溶液制備 取同一批次的草蒲黃及其篩下蒲黃花粉、篩上雜質(zhì)樣品粉末（批號：PHGM-1）各約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，冷浸12 h，超聲（功率：250 W，頻率：50 kHz）提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 混合對照品溶液制備 取異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品、香蒲新苷對照品各適量，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成異鼠李素-3-O-新橙皮苷質(zhì)量濃度為0.530 mg/mL、香蒲新苷質(zhì)量濃度為0.517 mg/mL的對照品母液。再分別精密吸取上述對照品母液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成異鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷質(zhì)量濃度分別為53.0、51.7 μg/mL的混合對照品溶液。

2.4.4 陰性對照溶液制備 按“2.4.2”項下方法，取除樣品外的試劑，制成陰性對照溶液。

2.4.5 系統(tǒng)適用性試驗 取供試品溶液、混合對照品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，詳見圖5。

由圖5顯示，異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷分離度大于1.5，理論板數(shù)按異鼠李素-3-O-新橙皮糖苷峰計為1.57×104;陰性對照不影響異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的測定。

2.4.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.4.3”項下混合對照品溶液1、5、10、15、20 μL，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測物進樣量為橫坐標（x，μg）、其峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸分析，得異鼠李素-3-O-新橙皮苷的回歸方程為y=300 000x-228 992（r=0.998 8），香蒲新苷的回歸方程為y=121 260x+73 388（r=0.998 4）。結(jié)果，異鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷進樣量的線性范圍分別為0.053～1.060、0.052～1.034 μg。

2.4.7 檢測限與定量限考察 精密吸取“2.4.3”項下混合對照品溶液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇逐級稀釋后，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。當異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷對照品峰面積與基線信噪比達到3 ∶ 1時即為檢測限，信噪比達到10 ∶ 1時即為定量限。結(jié)果，異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的檢測限、定量限均分別為0.005、0.025 μg。

2.4.8 精密度試驗 精密吸取“2.4.3”項下混合對照品溶液適量，按“2.4.1”項下色譜條件連續(xù)測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，異鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷峰面積的RSD分別為1.5%、2.0%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.4.9 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一批次的草蒲黃供試品溶液（批號：PHGM-1）適量，分別于室溫放置0、4、8、12、20、24 h時，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，異鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷峰面積的RSD分別為1.5%、1.8%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.10 重復性試驗 精密稱取同一批次的草蒲黃樣品粉末（批號：PHGM-1），共6份，分別按“2.4.2”項下方法制成供試品溶液，再精密吸取上述供試品溶液適量，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的含量。結(jié)果，各樣品中異鼠李素-3-O-新橙皮苷的含量分別為0.23%、0.22%、0.23%、0.24%、0.23%、0.22%（RSD=3.0%，n=6），香蒲新苷的含量分別為0.15%、0.15%、0.14%、0.15%、0.15%、0.14%（RSD=3.0%，n=6），表明本方法重復性良好。

2.4.11 加樣回收率試驗 精密稱取同一批次的草蒲黃樣品粉末（批號：PHGM-1），共6份，每份約0.25 g，精密加入等量的異鼠李素-3-O-新橙皮苷對照品和香蒲新苷對照品，按“2.4.2”項下方法制成供試品溶液，分別精密吸取20 μL，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，按外標法計算含量，再計算加樣回收率。結(jié)果，異鼠李素-3-O-新橙皮苷的平均回收率分別為97.9%、96.1%、98.6%、99.4%、97.8%、102.8%（RSD=2.3%，n=6），香蒲新苷的平均回收率分別為98.5%、96.5%、101.2%、100.4%、98.8%、99.2%（RSD=1.6%，n=6），表明本方法準確度良好。

2.4.12 樣品含量測定 分別取表1中各批樣品及其篩下蒲黃花粉和篩上雜質(zhì)適量，按“2.4.2”項下方法制成供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，采用外標法計算異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的含量以及二者的總量。結(jié)果，蒲黃花粉中異鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷的平均含量及其總量分別為0.42%、0.24%、0.66%;草蒲黃中分別為0.22%、0.17%、0.39%;雜質(zhì)中分別為0.19%、0.14%、0.33%。其中，僅蒲黃花粉中異鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷的總量達到藥典規(guī)定限度（不得少于0.50%）。樣品含量測定結(jié)果詳見表2。

2.4.13 《中國藥典》方法測定 分別取表1中各批樣品及其篩下蒲黃花粉和篩上雜質(zhì)適量，采用《中國藥典》中記載的蒲黃含量測定方法[1]制成供試品溶液：取樣品粉末0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，冷浸12 h后加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按“含量測定”中色譜條件進樣測定，記錄峰面積，采用外標法計算異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的總含量，結(jié)果詳見表3。

表3結(jié)果顯示，僅蒲黃花粉中異鼠李素3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的總含量達到《中國藥典》規(guī)定限度（≥0.50%）。比較表2和表3結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用本文提取方法的測定結(jié)果與《中國藥典》方法結(jié)果基本一致，均是蒲黃花粉中異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷的總含量最高，但不同產(chǎn)地的樣品中總含量有一定差異。

3 討論

筆者通過實地考察及農(nóng)戶走訪后發(fā)現(xiàn)，天然蒲黃花粉的含量受氣候因素影響較大，蒲黃的花期僅1周時間，開花后，隨成熟時間延長，花粉成熟度增加，極易從花藥的花粉囊中破囊而出，在風吹草葉互碰時有花粉散失。已有研究顯示，花粉量對草蒲黃質(zhì)量影響顯著[9]。因此，為防止花粉損失，宜選擇蒲黃花開1～4 d內(nèi)進行采收，此時花粉大部分存在于花藥囊中，花粉散失少，相應的質(zhì)量更好。

蒲黃中的黃酮類化學成分主要分為黃酮醇、黃酮、二氫黃酮和黃烷類，以香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷為主，二者既是蒲黃的主要活性物質(zhì)，也是其質(zhì)量控制指標性成分[10]。從本研究雜質(zhì)檢查結(jié)果可見，草蒲黃中蒲黃花粉的質(zhì)量百分比最低僅約為6%，雜質(zhì)占比可高達90%以上。雖然薄層色譜圖顯示，草蒲黃雜質(zhì)與蒲黃花粉的成分基本一致，但異鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷的含量測定結(jié)果均顯示，草蒲黃雜質(zhì)中二者的總含量達不到《中國藥典》規(guī)定的含量限度。

雖然《中國藥典》中對蒲黃供試品溶液的制備有具體的方法，即采用加熱回流的方法進行提取，但是該方法操作時間長，加之本研究樣本量大，所以不便于采用《中國藥典》方法進行操作。為了節(jié)約時間，本研究采用超聲進行提取。通過比較本研究方法與《中國藥典》方法測定異鼠李素-3-O-新橙皮苷和香蒲新苷總含量結(jié)果顯示，本研究方法結(jié)果與《中國藥典》方法結(jié)果基本一致。

4 結(jié)語

本研究將草蒲黃按蒲黃花粉和花絲、花藥分離后進行成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蒲黃花粉中香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷含量最高;草蒲黃因其含有大量的花絲、花藥，使其中香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷總含量達不到《中國藥典》規(guī)定的含量限度。筆者建議草蒲黃應作為獲取蒲黃花粉的原料，而不宜直接藥用。

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（收稿日期：2019-09-10 修回日期：2020-01-07）

（編輯：鄒麗娟）

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