PELGE-克班寧納米粒在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)研究

孔淑君 蔡俊飛 孫杏倩 劉云寬 馬云淑

摘 要 目的：研究聚乙二醇-（聚乳酸-羥基乙酸）-聚乙二醇三嵌段共聚物（PELGE）-克班寧納米粒（PELGE-Cre-NPs）在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)。方法：取6只家兔，耳緣靜脈注射PELGE-Cre-NPs（3.5 mg/kg），分別于給藥后5、15、30、60、90、120、150、180、240、300 min時，于其耳緣靜脈采血1 mL。分離血漿，用乙酸乙酯萃取Cre，并采用高效液相色譜法，以鹽酸維拉帕米為內(nèi)標(biāo)，測定Cre的血藥濃度，然后采用DAS 2.0軟件繪制血藥濃度-時間曲線并計算藥動學(xué)參數(shù)。色譜條件采用色譜柱為Agilent ZORBAX Extend-C18，流動相為甲醇-0.01%三乙胺溶液（75 ∶ 25，V/V），流速為1 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為20 μL。結(jié)果：Cre檢測血藥濃度的線性范圍為45.0～3 600 ?g/L（R2=0.999 9），日內(nèi)、日間精密度試驗和穩(wěn)定性試驗的RSD均小于5%（n=6或n=12），準(zhǔn)確度為（97.44±2.41）%～（98.45±3.87）%（n=6）。PELGE-Cre-NPs在家兔體內(nèi)分布符合二室模型;主要藥動學(xué)參數(shù)t1/2為（109.357±33.917）min，CL為（0.016±0.001） L/（min·kg），MRT為（76.733±7.502） min，cmax為（3 699.458±287.713） μg/L。結(jié)論：PELGE-Cre-NPs在家兔體內(nèi)的半衰期較Cre注射劑長，滯留時間延長，有緩釋效果。

關(guān)鍵詞 聚乙二醇-（聚乳酸-羥基乙酸）-聚乙二醇三嵌段共聚物-克班寧納米粒;藥動學(xué);家兔;血藥濃度

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the pharmacokinetics of PELGE-crebanine nanoparticles （PELGE-Cre-NPs） in rabbits. METHODS： Totally 6 rabbits were collected， and injected with PELGE-Cre-NPs （3.5 mg/kg） via ear vein. 1 mL of blood samples were collected at 5，15，30，60，90，120，150， 180，240， 300 min after administration from the ear vein. After the plasma were isolated and Cre were extracted with ethyl acetate， HPLC method was adopted to determine the plasma concentration of Cre by using verapamil hydrochloride as internal standard. The plasma concentration-time curve was drawed and pharmacokinetic parameters were calculated by using DAS 2.0 software. Chromatographic conditions such as the chromatographic column was Agilent ZORBAX Extend-C18; the mobile phase consisted of methanol-0.01% triethylamine solution （75 ∶ 25， V/V）; the flow rate was 1 mL/min; the detection wavelength was 280 nm; the column temperature was 30 ℃; the injection volume was 20 μL. RESULTS： The linear range of Cre were 45.0-3 600 ?g/L（R2=0.999 9）. RSDs of inter-day and intra-day precision and stability tests were all lower than 5% （n=6 or n=12）; the accuracies were （97.44±2.41）%-（98.45±3.87）%（n=6）. PELGE-Cre-NPs was in a two-compartment model in rabbits. Main pharmacokinetic parameters included that t1/2 was （109.357±33.917） min; CL was （0.016±0.001） L/（min·kg）; MRT was （76.733±7.502） min; cmax was （3 699.458±287.713） μg/L. CONCLUSIONS： The half-life period of PELGE-Cre-NPs in rabbits is longer than that of Cre injection; its retention time in the body is prolonged， and sustained-release effect is obvious.

KEYWORDS? ?PELGE-crebanine nanoparticles; Pharmacokinetics; Rabbit; Plasma concentration

克班寧（Crebanine，Cre）是從防己科千金藤屬云南地不容（Stephania yunnanensis H.S.Lo）及其同屬植物的塊莖中提取的一種異喹啉阿樸菲型生物堿[1-2]。實驗研究證明，Cre對多種實驗性心律失常具有較強的抑制作用，且作用迅速[3-5]，其小鼠靜脈注射的藥效劑量為2.5～5 mg/kg，半數(shù)致死量（LD50）為9.382 mg/kg[6]，由此可見其抗心律失常的治療范圍較窄，劑量不當(dāng)常會導(dǎo)致中毒，甚至死亡。同時，Cre的藥動學(xué)數(shù)據(jù)顯示，其半衰期較短[7-8]。因此，Cre作為活性顯著的心律失常先導(dǎo)化合物，其毒性較大、半衰期較短的問題亟待解決。本課題組前期將Cre分別制備成了脂質(zhì)體、納米粒與經(jīng)皮貼劑以期達(dá)到減毒、保效的作用[9-13]，結(jié)果顯示，以聚乙二醇-（聚乳酸-羥基乙酸）-聚乙二醇三嵌段共聚物（PELGE）載體材料制備的Cre納米粒（PELGE-Cre-NPs）的載藥量較高、穩(wěn)定性較好。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究主要考察PELGE-Cre-NPs在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)特征，旨在延長Cre的半衰期，達(dá)到保效的目的。

1 材料

1.1 儀器

1260 Infinity 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）;T-1000型電子天平[美國雙杰兄弟（集團）有限公司];HSC-12A型氮吹儀（天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）;XHF-1型內(nèi)切式勻漿機（寧波新芝生物科技有限公司）;TGL-16G型臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）;XK96-A型快速混勻器（姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司）。

1.2 藥品與試劑

PELGE-Cre-NPs（云南中醫(yī)學(xué)院藥劑實驗室自制，批號：2016011003，Cre含量：1.5 mg/mL，包封率：90.32%）;Cre對照品[云南中醫(yī)學(xué)院藥劑實驗室自制，提取自云南地不容（S. yunnanensis H.S.Lo），批號：20141101，純度：99.2%];鹽酸維拉帕米對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100223-200102，供含量測定使用）;氯化鈉注射液（昆明南疆制藥有限公司，批號：20150917）;甲醇為色譜純，乙酸乙酯等其余試劑為分析純，水為純化水。

1.3 動物

SPF級家兔6只，雌雄各半，體質(zhì)量為2～2.5 kg，購自成都達(dá)碩生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2013-24。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液 取Cre對照品，精密稱定，用甲醇溶解定量稀釋制成150 μg/mL的對照品溶液。分別精密量取該溶液適量，用甲醇稀釋制成合適的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 取鹽酸維拉帕米對照品，精密稱定，用水溶解稀釋制成質(zhì)量濃度為4 000 μg/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2 家兔血漿的處理

參考文獻方法[14-15]，精密量取家兔血漿樣品0.5 mL，置于離心管內(nèi)，加入鹽酸維拉帕米內(nèi)標(biāo)溶液（4 000 μg/L）10 μL，加入乙酸乙酯3 mL，渦旋萃取3 min，以4 000? ? ?r/min離心10 min;吸取上層有機相2.4 mL，置于5 mL離心管內(nèi)，并于50 ℃水浴中以氮氣流吹干，殘渣加入200 ?L甲醇復(fù)溶，渦旋1.5 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾頭過濾，取續(xù)濾液，備測。

2.3 Cre的血藥濃度測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）;流動相：甲醇-0.01%三乙胺溶液（75 ∶ 25，V/V）;流速：1 mL/min;檢測波長：280 nm;柱溫：30 ℃;進樣量：20 μL。

2.3.2 專屬性 取空白血漿、給藥1 h后的含藥血漿+內(nèi)標(biāo)、空白血漿+Cre對照品+內(nèi)標(biāo)，各0.5 mL，分別置于離心管內(nèi)，按“2.2”項下方法，從“加入乙酸乙酯3 mL”開始處理樣品。精密量取續(xù)濾液20 ?L，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。

由圖1顯示，空白血漿對檢測無干擾;內(nèi)標(biāo)鹽酸維拉帕米、Cre的出峰時間依次為8.095、9.399 min，分離度大于1.5，拖尾因子均在0.95～1.05之間，峰形對稱性良好，理論板數(shù)以Cre或鹽酸維拉帕米計均不低于2 000。這表明該色譜條件專屬性良好。

2.3.3 線性關(guān)系與定量限考察 精密量取空白血漿0.5 mL，置于10 mL離心管內(nèi)，分別加入“2.1.1”項下的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL，配制成Cre質(zhì)量濃度分別為45.0、90.0、180.0、450.0、900.0、1 800.0、3 600.0 ?g/L的系列血漿樣品。按“2.2”項下方法處理上述血漿樣品后，精密量取續(xù)濾液20 ?L，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以Cre質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、Cre與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y）進行線性回歸，得回歸方程為y=0.001 0x-0.022 9（R2=0.999 9）。結(jié)果表明，Cre檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為45.0～3 600 ?g/L，定量限為45.0 ?g/L。

2.3.4 精密度與準(zhǔn)確度試驗 分別按“2.3.3”項下的方法配制高、中、低質(zhì)量濃度（75.0、1 800.0、2 700.0 ?g/L）的血漿樣品，各平行6份，按“2.2”項下的方法處理后，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，考察日內(nèi)精密度;連續(xù)測定2 d，考察日間精密度;以測得血藥濃度與理論血藥濃度比較考察準(zhǔn)確度。結(jié)果表明，該方法精密度和準(zhǔn)確度均良好，詳見表1。

2.3.5 萃取回收率試驗 分別按“2.3.3”項下的方法配制高、中、低質(zhì)量濃度（75.0、1 800.0、2 700.0 ?g/L）的血漿樣品，各平行6份，再按“2.2”項下方法，從“加入乙酸乙酯3 mL”開始進行樣品處理。精密量取續(xù)濾液20 ?L，按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積（A1）。另將上述相應(yīng)質(zhì)量濃度的Cre對照品溶液各稀釋10倍，進樣20 μL，記錄峰面積（A0）。以A1/A0×100%計算萃取回收率。結(jié)果表明，該方法萃取效果良好，詳見表2。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 分別按“2.3.3”項下的方法配制高、中、低質(zhì)量濃度（75.0、1 800.0、2 700.0 ?g/L）的血漿樣品，各平行6份，共平行制備3組。分別于室溫放置24 h、-4 ℃放置48 h、-20 ℃-室溫凍融1次，再按“2.2”項下方法處理后，按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果表明，在上述條件下血漿樣品穩(wěn)定性均良好，詳見表3。

2.4 家兔藥動學(xué)試驗

取家兔6只，雌雄各半，禁食、不禁水24 h后，于耳緣靜脈單次注射PELGE-Cre-NPs，給藥劑量為3.5 mg/kg[14]。分別于給藥后5、15、30、60、90、120、150、180、240、300 min時，在兔耳緣靜脈取血1 mL于抗凝管中，以10 000? r/min離心10 min，分離上層血漿。按“2.2”項下的方法處理后，再按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。采用內(nèi)標(biāo)法，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Cre的血藥濃度，使用DAS 2.0軟件繪制平均血藥濃度-時間曲線，同時計算主要藥動學(xué)參數(shù)。PELGE-Cre-NPs在家兔體內(nèi)的平均血藥濃度-時間曲線詳見圖2，主要藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果詳見表4。

3 討論

3.1 血漿樣品萃取溶劑的篩選

在家兔血漿樣品處理方法的篩選過程中，參考文獻研究[8，14]方法，分別嘗試以乙酸乙酯、三氯甲烷、甲醇作為萃取溶劑進行樣品提取。結(jié)果顯示，甲醇處理家兔血清樣品，雖具有較好的蛋白沉淀效果，但對檢測有干擾;用三氯甲烷作萃取溶劑，其沉淀蛋白效果較差，容易污染堵塞檢測系統(tǒng);以乙酸乙酯萃取，能夠較好地沉淀蛋白，萃取回收率高而穩(wěn)定，萃取的空白血漿對檢測無干擾，主峰及內(nèi)標(biāo)峰的峰形良好，可滿足血漿樣品的檢測需求，故最終選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑。

3.2 藥動學(xué)研究結(jié)果分析

PELGE-Cre-NPs在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)測定結(jié)果顯示，t1/2為（109.357±33.917）min，CL為（0.016±0.001） L/（min·kg），MRT為（57.448±3.460） min;其中，t1/2比MRT大，說明納米粒的末端消除較緩慢。本課題組前期對Cre注射劑在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)進行了研究[7，14]，結(jié)果顯示，Cre注射劑在家兔體內(nèi)符合二室開放模型特征，各項藥動學(xué)參數(shù)表明，Cre注射劑靜脈注射給藥后的代謝、消除較快，在家兔體內(nèi)為超速處置類（t1/2<1 h）藥物;t1/2α、t1/2β、CL的數(shù)據(jù)顯示，其在家兔體內(nèi)的分布迅速、廣泛，維持有效血藥濃度的時間較短;雌、雄家兔各藥動學(xué)參數(shù)的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，其中t1/2β為（36.67±5.52） min，CL為（0.051±0.003） L/（min·kg），MRT為（37.34±4.52） min。結(jié)合本研究結(jié)果可知，將Cre制備成PELGE納米粒后，與Cre注射劑相比，在家兔體內(nèi)的t1/2延長了約3倍，MRT延長了約1.5倍，CL下降了70%。

綜上所述，將Cre制備成PELGE-Cre-NPs后，相較普通的注射劑而言，t1/2、MRT顯著延長，末端消除明顯變緩，在體內(nèi)初步實現(xiàn)了長循環(huán)，達(dá)到了一定的緩釋、保效作用。但本研究所建的HPLC法存在分離時間較長的問題，有待進一步開發(fā)更加高效、節(jié)約成本的分析方法。

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（收稿日期：2019-12-03 修回日期：2020-02-24）

（編輯：鄒麗娟）