硒蛋白P基因多態(tài)性與乳頭狀甲狀腺癌發(fā)病風險的關聯(lián)性分析

張利芳，蔡 琳，王云華，張克實，烏日娜

(1.包頭醫(yī)學院醫(yī)學技術與麻醉學院臨床生物化學檢驗與分子診斷學教研室，內蒙古 包頭 014040；2.內蒙古自治區(qū)包頭市腫瘤醫(yī)院檢驗科，內蒙古 包頭 014030；3.包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院普外科，內蒙古 包頭 014030；4.包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院超聲科，內蒙古 包頭 014010)

硒是維持人類健康的一種必需微量元素，參與體內多種代謝活動。缺硒或硒中毒與多種疾病的發(fā)生有關，如心血管疾病、糖尿病、腫瘤、免疫和甲狀腺功能低下等[1-4]。硒與甲狀腺之間存在著更為密切的關系，硒參與甲狀腺激素的合成、分泌與代謝，其在甲狀腺中的含量最高，硒含量異常與多種甲狀腺疾病有關，如甲狀腺腫、免疫性甲狀腺病(橋本氏甲狀腺炎和Graves病)和甲狀腺癌等[5-8]。

硒蛋白P(selenoprotein P，Sepp1)是硒蛋白家族中非常重要的成員之一，是血硒的主要儲運蛋白，對于維持血硒含量穩(wěn)定方面具有重要作用。同時Sepp1還具有抗氧化酶的活性，與其他抗氧化酶一起構成機體防御屏障，在保護機體免受氧化損傷、維持結構蛋白和基因組DNA的穩(wěn)定方面起重要作用[9]。國內外研究[10-13]表明：Sepp1與心血管疾病、糖尿病、老年癡呆和惡性腫瘤等發(fā)病相關。研究者[9,14-15]分別對不同位點Sepp1基因多態(tài)性與結直腸癌、乳腺癌和前列腺癌等進行了關聯(lián)研究，結果不盡一致?；赟epp1重要生理功能及其在惡性腫瘤中異?；虮磉_模式，本課題組選擇內蒙古地區(qū)漢族人群乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyriod carcinoma，PTC)患者為研究對象，采用一種快速簡易的點突變檢測技術——等位基因特異性聚合酶鏈式反應(allele-specific polymerase chain reaction， AS-PCR)技術檢測PTC患者Sepp1基因rs7579位點多態(tài)性，并進行分層分析和結合非遺傳因素聯(lián)合分析綜合探討Sepp1基因遺傳易感性與PTC患病風險的關聯(lián)性，研究內容與方法均與以往報道不同，旨在為臨床甲狀腺癌的防治提供可靠的實驗室依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集2017年12月—2018年12月在內蒙古自治區(qū)包頭市腫瘤醫(yī)院、包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院和包頭醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院經(jīng)臨床組織病理學確診的新發(fā)漢族PTC患者138例(病例組)，其中女性104例，男性34例，平均年齡(49.39±8.47)歲。收集同期社區(qū)健康者140人(對照組)，其中女性105人，男性35人，平均年齡(47.91±6.60)歲，經(jīng)問卷調查排除相關腫瘤史，同時記錄2組研究對象吸煙、飲酒、碘鹽攝入、放射線接觸和精神狀態(tài)等情況(吸煙界定標準：每天1支以上，時間超過6個月；飲酒界定標準：平均每周1次，時間超過1年；碘鹽攝入標準：日常食入含碘鹽，時間不少于5年；放射線接觸史：近5～10年接受過放射線暴露，如做CT等影像檢查及職業(yè)接觸等；精神狀態(tài)好標準：主觀感覺體力好，睡眠質量好，情緒穩(wěn)定，反之為精神狀態(tài)差，時間超過3年；工作壓力小標準：主觀感覺工作輕松、愉快，反之為壓力大，時間超過3年)。經(jīng)樣本總體檢驗病例組和對照組研究對象年齡和性別匹配(年齡：t=1.432，P=0.153；性別：χ2=0.005，P=0.944)，具有可比性。

1.2 基因組DNA提取與引物合成采集研究對象空腹全血2 mL，EDTA抗凝，提取血液基因組DNA。通過PubMed-SNP數(shù)據(jù)庫查詢Sepp1基因rs7579位點兩側基因序列，應用Premier 5.0軟件設計引物。見表1。

特異性內引物F1和R1分別在3′端倒數(shù)第3位引入1個人為的錯配堿基(下劃線部分)以便于增加分型的特異性。F1和R2組合檢測G等位基因，其PCR產(chǎn)物片段大小為212 bp。F2和R1組合檢測A等位基因，其PCR產(chǎn)物片段大小為183 bp。外引物F2和R2組合擴增出的PCR產(chǎn)物片段大小為338 bp，作為陽性對照。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 Sepp1基因rs7579位點引物序列

1.3 AS-PCR法進行擴增反應體系為25 μL，包括DNA模板6 μL(約100 ng)，F(xiàn)2和R2(10 μmol·L-1)各0.4 μL，F(xiàn)1和R1(10 μmol·L-1)各0.8 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，去離子水4.1 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)35次；最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物于3%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。隨機選取50個PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序驗證，所用引物為表1中的F2和R2，PCR反應體系為50 μL，包括DNA模板12 μL(約100 ng)，F(xiàn)2和R2(10 μmol·L-1)各2 μL，2×Taq PCR Master Mix 25 μL，去離子水9 μL。反應條件同AS-PCR法。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。群體樣本進行Hardy-Weinberg平衡定律檢驗；2組研究對象基因型和等位基因頻數(shù)分布比較采用χ2檢驗，采用非條件Logistic回歸分析計算風險比(OR)及其95%可信區(qū)間(CI)描述相對風險度，雙側檢驗以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用非條件多因素Logistic回歸分析基因型、吸煙和飲酒等與PTC發(fā)病的關系，以P<0.1為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Sepp1基因rs7579位點基因分型AS-PCR法檢測后可見3種基因型：產(chǎn)生338、212和183 bp3個條帶的為GA基因型，產(chǎn)生338和183 bp 2個條帶的為AA基因型，產(chǎn)生338和212 bp 2個條帶的為GG基因型。見圖1。

2.2 Sepp1基因rs7579位點基因測序Sepp1基因rs7579位點3種基因型測序結果與AS-PCR法檢測結果一致。見圖2。

Lane 1，2：GG genotype； Lane 3，4，5，7：GA genotype；Lane 6：AA；M：50 bp DNA marker.

圖1 Sepp1基因rs7579位點基因分型電泳圖

Fig.1 Electrophoregram of genetypes at rs7579 site of Sepp1 gene

A：GG genotype；B：GA genotype；C：AA genotype.

Fig.2 Sequencing results of PCR products of rs7579 site of Sepp1 gene

2.3 2組研究對象Sepp1基因rs7579位點基因型和等位基因頻數(shù)分布為檢驗研究對象Sepp1基因rs7579位點多態(tài)性分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，對研究對象的基因型頻數(shù)分布進行遺傳平衡檢驗，結果顯示：所觀察的樣本具有群體代表性(χ2=0.642，P=0.773)。病例組與對照組GG、GA和AA 3種基因型頻數(shù)分布比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.622，P= 0.733)；等位基因G和A頻數(shù)分布比較差異亦無統(tǒng)計學意義(χ2=0.673，P=0.412)。見表2。

表2 2組研究對象Sepp1基因rs7579位點基因型和等位基因頻數(shù)分布

2.4 不同臨床特征研究對象Sepp1基因rs7579位點基因型頻數(shù)分布在年齡分層中，≥50歲病例組和對照組研究對象GG、GA和AA基因型頻數(shù)分布比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.717，P= 0.028 )，PTC患者AA基因型頻數(shù)分布明顯低于對照者(P<0.05)，說明攜帶A等位基因的AA和(或)GA基因型研究對象患PTC的風險低于GG基因型者(OR=0.481，95%CI：0.267～0.866)；而病例組中<50歲組、男性組、女性組、無淋巴轉移組、淋巴轉移組、腫瘤直徑≥2 cm組、腫瘤直徑<2 cm組PTC患者GG、GA和AA基因型頻數(shù)分布與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=1.887，P=0.389；χ2=0.451，P=0.797；χ2=0.165，P=0.921；χ2=1.369，P=0.504；χ2=3.845，P=0.146；χ2=0.713，P=0.700；χ2=0.396，P=0.821)。提示Sepp1基因rs7579位點單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)對PTC患病風險的影響與年齡有關聯(lián)，但與性別、淋巴結轉移和腫瘤大小無關聯(lián)。見表3。

表3 不同臨床特征研究對象Sepp1基因rs7579位點基因型頻數(shù)分布

2.5 PTC發(fā)病多因素Logistic回歸分析以發(fā)生PTC為應變量(患者=1，正常=0)，以Sepp1基因型(GG或GA基因型=1，AA型=0)、吸煙(是=1，否=0)、飲酒(是=1，否=0)、體質量指數(shù)(body mass index，BMI)(<18.5 kg·m-2=0，18.5～23.9 kg·m-2=1，≥24.0 kg·m-2=2)、碘鹽攝入(是=1，否=0)、放射接觸史(有=1，無=0)、精神狀態(tài)(差=1，好=0)、工作壓力(大=1，小=0)等影響因素為自變量，進行多因素非條件Logistic回歸分析，結果顯示：高BMI、碘鹽攝入和工作壓力大是PTC發(fā)病的危險因素(OR=1.149，95%CI：1.004～1.264；OR=5.112，95%CI：1.597～16.367；OR=2.848，95%CI：1.549～5.235，均P<0.1)，精神狀態(tài)好是PTC保護性因素(OR=0.347，95%CI：0.203～0.895；P<0.1)。見表4。

表4 PTC發(fā)病影響因素的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

硒在人體中主要以硒代半胱氨酸的形式存在于各種硒蛋白中，硒蛋白具有廣泛的生理作用，如參與免疫反應、甲狀腺激素的代謝、保護細胞免受氧化損傷和男性精子生成等[9,16]。Sepp1是硒蛋白家族中非常重要的成員之一，是血硒的儲運蛋白，包含幾乎50%的總血漿硒[17]。Sepp1基因定位于人染色體5q31，包含7個外顯子，全長16 000 bp，由2個結構域構成，即大片段N末端和小片段C末端。Sepp1由肝臟合成分泌入血，進入外周組織后C端片段分泌硒被組織細胞攝取，以維持細胞正常生理功能，N末端與細胞膜有較強的親和力，釋放了硒的Sepp1結合至細胞膜上可發(fā)揮抗氧化作用。Sepp1在維持血硒含量穩(wěn)定和保護機體免受氧化損傷方面具有重要作用[18-19]。

人類Sepp1基因SNPs位點現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)1萬多個，且這些多態(tài)性位點與Sepp1的存在形式、功能的發(fā)揮及與疾病的患病風險有密切關聯(lián)，其中有關rs3877899和rs7579位點的研究最多。Sepp1基因SNPs與腫瘤遺傳易感性關系的研究較多，但結果缺乏一致性。MéPLAN等[14]以丹麥975例乳腺癌患者與相同時間健康對照者作為研究對象進行Sepp1基因多態(tài)性與乳腺癌遺傳易感性關聯(lián)性分析，結果顯示rs3877899多態(tài)性位點與導管性乳腺癌有關。STEINBRECHER等[15]發(fā)現(xiàn)：在歐洲人群中Sepp1基因 rs7579位點多態(tài)性與前列腺癌患病不具有相關性；張龍等[9]研究湖南省人群結直腸癌患者Sepp1基因rs7579位點基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)：A等位基因在55歲以上腫瘤組與對照組人群中存在差異。

本研究結果顯示：BMI、攝入碘鹽、精神狀態(tài)和工作壓力是PTC發(fā)病危險因素，提示肥胖、攝入含碘的鹽，精神壓力大和睡眠不足等增加PTC患病風險，在生活中應該注意相關方面的調節(jié)。本研究進一步檢測Sepp1基因 rs7579位點多態(tài)性結果顯示：病例組和對照組研究對象GG、GA、AA基因型和G、A等位基因頻數(shù)分布比較差異雖無統(tǒng)計學意義，但根據(jù)臨床特征進行分層分析發(fā)現(xiàn)：年齡≥50歲組PTC患者GG、GA、AA基因型頻數(shù)分布與健康對照者比較差異有統(tǒng)計學意義，PTC患者AA基因型頻數(shù)分布明顯低于對照者，說明攜帶A等位基因的AA和(或)GA基因型個體患PTC的風險低于GG基因型者(OR=0.481，95%CI：0.267～0.866)，說明A等位基因可能是≥50歲組人群降低PTC發(fā)病的保護性因素之一。這與張龍等[9]研究結果接近。rs7579位點位于Sepp1 3′UTR，該位點的基因變異可以影響Sepp1合成過程中硒代半胱氨酸的插入，影響Sepp1的合成及其在血中的存在形式，進而影響其功能的發(fā)揮。健康人血漿中主要存在2種Sepp1，即相對分子質量為51 000和61 000的Sepp1[17]，后者運輸硒的能力強。MéPLAN等[20]研究Sepp1基因rs7579多態(tài)性位點發(fā)現(xiàn)：AA基因型人群中相對分子質量為61 000的Sepp1水平高于GG基因型人群，隨年齡不斷增長，細胞代謝活性降低，機體運輸硒的能力也隨著降低。本研究中年齡≥50歲組對照人群rs7579位點AA基因型頻數(shù)高于PTC人群，即含大相對分子質量的Sepp1較多，可能一定程度上保證了機體對硒的需求，進而降低了PTC的患病風險。本研究結果與以往研究結果不盡一致，分層分析和多因素回歸分析提示了PTC發(fā)病的復雜性，這可能與選擇的人群、地區(qū)和樣本有關，還需進一步驗證。

綜上所述，Sepp1基因rs7579位點基因突變與環(huán)境因素(BMI、攝入碘鹽、精神狀態(tài)和工作壓力)可能共同或交互作用影響PTC患病，可采取高危策略加強PTC群體預防，除篩查具有易感基因型的個體，更要加強健康生活方式教育，減少人群吸煙和碘鹽攝入等暴露，以降低PTC發(fā)病風險。