星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化鹽酸川芎嗪鼻用凝膠劑的處方及其體外釋放行為研究*

郝 晶，王小寧，閆夢茹，馬遠濤，梁曉燕

（西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安710021）

前 言

鹽酸川芎嗪是中藥傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的有效成分之一，臨床常以鹽酸鹽的形式應(yīng)用，用于閉塞性血管疾病、腦血栓形成、脈管炎、冠心病、心絞痛等疾病的治療，目前上市的川芎嗪主要劑型有注射劑和口服片劑[1,2]。然而，川芎嗪半衰期短、易氧化，導(dǎo)致口服生物利用度不高，而注射給藥極不方便，極大地限制了其臨床應(yīng)用，因此關(guān)于川芎嗪的新制劑研究日益受到關(guān)注[3]。近年來，鼻腔給藥是研究較多的腦靶向給藥途徑之一。鼻腔給藥后，藥物可通過嗅黏膜上皮通路和嗅神經(jīng)通路繞過血腦屏障直接吸收入腦，也可以通過血液循環(huán)通路透過血腦屏障進入腦組織[4]。鼻用原位凝膠劑是鼻腔給藥途徑研究的熱點，將其以溶液狀態(tài)給藥，滴入鼻腔后因鼻腔的pH 環(huán)境改變而發(fā)生膠凝，成為半固體凝膠狀態(tài)，從而延長藥物在鼻腔內(nèi)滯留時間、增加藥物吸收[5～7]。鑒于此，研究川芎嗪的鼻腔給藥凝膠制劑，對于探究其經(jīng)鼻給藥的可行性具有重要意義。因此，本研究采用卡波姆934、羥丙基甲基纖維素（HPMC）為鹽酸川芎嗪鼻用凝膠基質(zhì)，旨在通過星點設(shè)計- 效應(yīng)面法優(yōu)化凝膠處方，并采用透析法考察其體外釋放性能，為下一步鹽酸川芎嗪鼻用新制劑的開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 主要原料與試劑

鹽酸川芎嗪對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：Y19O7Y17134，純度≥98%），卡波姆940、HPMC（藥用級別，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鉀等試劑（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），甲醇（色譜純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫加熱磁力攪拌器（ZNCL-T1000 型，西安予輝儀器有限公司）；數(shù)顯黏度計（NDJ-8S 型，上海標(biāo)卓科學(xué)儀器有限公司）；冷凍干燥機（FreeZone，Labconco 公司）；電子分析天平（BS210S，北京賽多利斯天平有限公司）；高效液相色譜儀（1260 型，Agilent）。

1.3 鹽酸川芎嗪鼻用凝膠的制備

（1）人工鼻液的配制

精密稱取磷酸二氫鉀13.6g，加入純水1L 溶解，用0.1mol/L 的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=6.8 即得[8]。

（2）凝膠基質(zhì)的制備

按處方量取卡波姆溶液和HPMC 溶液混勻，用三乙醇胺調(diào)節(jié)pH=4.0，再用人工鼻液調(diào)節(jié)至pH=5.0，得到凝膠基質(zhì)[5]。

（3）星點設(shè)計- 效應(yīng)面法優(yōu)化凝膠處方

選取卡波姆濃度和HPMC 濃度作為2 個主要因素，進行2 因素5 水平優(yōu)化，以凝膠黏度為指標(biāo)優(yōu)選處方。根據(jù)星點設(shè)計- 效應(yīng)面法原理，采用Design-Expert 實驗設(shè)計軟件（8.05b 版本）輔助設(shè)計，各因素水平代碼和具體物理量見表1[9]。

表1 自變量水平表Table 1 The factors and levels

1.4 鹽酸川芎嗪含量測定方法的建立

（1）對照品儲備液的配制

精密稱取鹽酸川芎嗪對照品25mg，置于50mL量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.5mg/mL 的鹽酸川芎嗪儲備液。

（2）供試品溶液的制備

取一定量的鼻用凝膠1mL 置于50mL 容量瓶中，加入去離子水適量，超聲20min，搖勻，添加去離子水至刻度，放冷待測。

（3）陰性對照溶液的制備

取處方量的輔料加入到去離子水中，制成空白輔料溶液，冰箱冷藏。

（4）色譜條件

色譜柱：Agilent HC-C18（2）（4.6×150mm，5μm）；流動相：水- 甲醇- 三乙胺（40∶60∶0.2，v/v）；流速：1.0mL/min；檢測波長：294nm；柱溫：室溫；進樣量：20μL[10]。

（5）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對照品儲備液1、2、4、6、8mL 置于10mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度和對應(yīng)液相色譜峰面積作圖，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)液濃度C，縱坐標(biāo)為對應(yīng)的峰面積A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時進行精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗。

1.5 藥物釋放試驗

精密取按優(yōu)化處方制備的原位凝膠2.50mL 3份，置于透析袋中（截留相對分子質(zhì)量3500）中，于新配人工鼻液80.00mL 中用磁力攪拌器攪拌進行釋放試驗，轉(zhuǎn)速200r/min，溫度37℃，分別于30min和l、2、3、4、5、6、8、10、12h 取樣1.50mL（同時補加同溫等量人工鼻液），樣品按照色譜條件進行測定，計算各取樣時間點介質(zhì)中藥物的累積釋放率。

2 結(jié)果與討論

2.1 鼻用凝膠處方的優(yōu)化

星點設(shè)計及實驗結(jié)果見表2。

表2 星點設(shè)計及實驗結(jié)果Table 2 The results of central composite design and experiment

根據(jù)表2 試驗結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.5軟件進行多元回歸方程擬合和方差分析。回歸方程為 ：R=1.904-0.034A+1.003B+1.179AB+0.363A2-0.431B2，方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

方差分析結(jié)果顯示，該擬合模型P＜0.0001，表明模型具有極顯著性，模型修正系數(shù)R2=0.9543，表明模型擬合度好。同時，方程的失擬項F 值為3.07，P＞0.05，表示失擬項不顯著，回歸方程在整個回歸區(qū)域內(nèi)的擬合情況良好，可用該回歸模型代替真實試驗點對結(jié)果進行分析[9]。由表3 可知，卡波姆濃度和HPMC 濃度對響應(yīng)值不具有顯著性影響（P＞0.05）。各自變量間的三維效應(yīng)曲面圖如圖1 所示，各因素與OD 值呈較明顯的二次拋物關(guān)系，表明各交互因素在響應(yīng)值存在最大值。

圖1 因素A、B 對凝膠黏度影響的響應(yīng)曲面圖Fig. 1 The response surface plot of the effect of factor A and B on gel viscosity

2.2 驗證實驗

根據(jù)Design-Expert 8.0.5 軟件對試驗結(jié)果進行系統(tǒng)分析，得出最佳凝膠處方：卡波姆濃度為1.0%，HPMC 濃度為1.9%，預(yù)測在此工藝下所得凝膠的黏度為4.83Pa·s。按照以上優(yōu)化的條件進行平行3 組包合驗證試驗，可得出凝膠黏度平均值為4.85Pa·s，RSD 為0.41%，結(jié)果表明凝膠處方穩(wěn)定可行。

2.3 鹽酸川芎嗪含量的測定

（1）專屬性試驗 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液20μL，按照色譜條件進行測定，得色譜圖如圖2。在上述色譜條件下，鹽酸川芎嗪保留時間為3.026min，雜質(zhì)及溶劑峰無干擾。

圖2 HPLC 色譜圖（A：標(biāo)準(zhǔn)品溶液 B：樣品溶液 C：陰性對照溶液）Fig. 2 The HPLC chromatograms（A：standard solution B：sample solution C：negative control solution）

得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為A=99.905C-48.475，r=0.9997，鹽酸川芎嗪在0.05mg/mL～0.40mg/mL 范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

（2）精密度實驗 取1.4 項下的同一濃度的對照溶液（0.20mg/mL），按照色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，計算RSD 值為0.97%，表明精密度良好。

（3）穩(wěn)定性實驗 取1.4 項下的同一濃度的對照溶液（0.20mg/mL），分別在0、1、2、3、6、12h 按照色譜條件進樣測定，計算RSD 值為0.56%，表明在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（4）加樣回收率試驗 取3 份已知含量的鹽酸川芎嗪鼻用原位凝膠溶液適量，分別精密加入對照品適量。按照色譜條件進行測定，計算得回收率分別為98.61±2.55%、99.76±1.94%、100.22±3.11%，加樣回收率滿足含量測定方法學(xué)要求。

2.4 體外釋藥

采用透析法測定鹽酸川芎嗪鼻用凝膠的體外釋藥特性，按照色譜條件測定釋放的藥量，計算累積釋放度，釋放曲線見圖3。

由釋放曲線可以看出，鹽酸川芎嗪鼻用凝膠表現(xiàn)出明顯的緩釋特性。2h、4h 釋放度分別為（50.06±2.79）%、（59.82±4.56）%，具有突釋現(xiàn)象，隨后藥物的釋放達到平臺期。12h 時，微球的釋放度為（86.98±3.58）%，24h 時，微球的累積釋放度為（93.20±2.91）%，已基本釋放完全，因此，鹽酸川芎嗪鼻用凝膠具有較好的緩釋效果。這可能是因為釋放介質(zhì)滲入到凝膠中，使凝膠發(fā)生溶脹，凝膠孔隙增大，同時藥物在釋放介質(zhì)中溶解形成濃溶液，依靠與介質(zhì)間的濃度差進行擴散，藥物逐步緩慢釋放[11]。分別進行Higuchi 模型、Weibull 模型、零級釋藥過程和一級釋藥過程擬合，得出釋藥方程如表4 所示。由擬合結(jié)果可以看出，鹽酸川芎嗪鼻用凝膠的藥物體外釋放符合Weibull 模型。

圖3 鹽酸川芎嗪鼻用凝膠的釋放曲線Fig.3 The in vitro release curve of ligustrazine hydrochloride nasal gel

表4 體外釋放曲線模型擬合Table 4 The in vitro release curve fitting result

3 結(jié) 論

（1）通過星點設(shè)計- 效應(yīng)面法優(yōu)化鹽酸川芎嗪鼻用凝膠劑的處方，Design-Expert 8.0.5 軟件進行數(shù)據(jù)分析，所建立的模型擬合度高，試驗誤差小，說明采用星點設(shè)計- 效應(yīng)面法優(yōu)化原位凝膠處方具有較好的預(yù)測效果。

（2）體外釋藥實驗結(jié)果表明，鼻用凝膠釋放過程符合Weibull 模型，表現(xiàn)出明顯的緩釋效果，達到了研究的預(yù)期目標(biāo)，凝膠的鼻腔黏附性及鼻腔給藥時的黏膜通透性有待進一步研究。