石墨烯溶膠對(duì)逆境下歐洲山楊組培苗生長(zhǎng)的影響

薛斌龍，王海雁，趙建國(guó),3，關(guān)媛媛

(1.山西省桑干河楊樹(shù)豐產(chǎn)林實(shí)驗(yàn)局科技服務(wù)中心；2.大同大學(xué)化工學(xué)院/炭材料研究所，山西 大同 037000；3.太原理工大學(xué)材料學(xué)院，太原 030000)

中國(guó)鹽堿土總面積約為0.36億公頃，并以每年1%的速度增加[1]。鹽堿地改良是一個(gè)世界性難題，改良方法主要有水利法、物理化學(xué)法和生物法。土壤施用物理、化學(xué)物料(磷石膏類(lèi)、腐植酸類(lèi)、有機(jī)肥等)主要作用是緩解土壤危害，提高土壤肥力，能夠取得一定的改良效果。其主要優(yōu)點(diǎn)是易推廣，但見(jiàn)效慢、費(fèi)用大[2-4]。

石墨烯(graphene)是真正意義上的二維納米材料[5]，具有優(yōu)異的電化學(xué)性能、大比表面積[6]等特殊理化特性,在眾多領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用價(jià)值。石墨烯溶膠是表面經(jīng)過(guò)功能化的石墨烯納米材料[7]，能夠在水中長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，更便于應(yīng)用在眾多領(lǐng)域。目前石墨烯溶膠在林業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用研究較少，對(duì)林木抗逆性影響研究還處于起步階段。

植物的早期生長(zhǎng)是植物對(duì)鹽離子響應(yīng)最敏感的階段[8]。楊屬植物作為林業(yè)研究的模式植物,具有優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)特性[9]。歐洲山楊(Populustremula)為白楊派(Sect.Populus)樹(shù)種，屬于楊屬。該樹(shù)種在山西基本適應(yīng)，最適生長(zhǎng)區(qū)為山西中南部的山區(qū)[10]。

本研究以歐洲山楊組培苗為試驗(yàn)材料，分別采用較高濃度的NaCl、PEG-6000對(duì)其進(jìn)行模擬鹽脅迫和干旱脅迫處理，以便分析得出石墨烯溶膠對(duì)歐洲山楊組培苗耐鹽能力、耐旱能力的影響，為探索逆境條件下石墨烯溶膠對(duì)林木生長(zhǎng)的影響提供數(shù)據(jù)資料，也對(duì)促進(jìn)石墨烯在鹽堿化地區(qū)推廣應(yīng)用，加快鹽堿地植被恢復(fù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用山西省楊樹(shù)局科技中心組培室保存的歐洲山楊(P.tremula)組培苗作為試驗(yàn)材料。采集成年樹(shù)基部枝條，經(jīng)過(guò)水培后采集帶葉嫩芽作為外植體來(lái)源，經(jīng)過(guò)1 a增殖培養(yǎng)形成壯苗。歐洲山楊生根培養(yǎng)基使用(1/2MS+0.1 mg·L-1NAA+0.3 mg·L-1IBA+瓊脂6 g·L-1+糖30 g·L-1，PH值5.8～6.0)。培養(yǎng)室培養(yǎng)條件為:溫度(25±2) ℃，光周期為14 h·d-1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 NaCl脅迫處理 試驗(yàn)共設(shè)4種處理(表1)。NaCl為固體顆粒，石墨烯溶膠為液體，在制備歐洲山楊生根培養(yǎng)基時(shí)加入。選取增殖培養(yǎng)的健壯組培苗,切割成帶葉的腋芽莖段,轉(zhuǎn)接至試驗(yàn)各處理生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)。單株處理(包括對(duì)照)分別接種20瓶，3次重復(fù)。

1.2.2 PEG-6000脅迫處理 聚乙二醇6000(polyethylene glycol，PEG6000)作為較理想的滲透調(diào)節(jié)劑被廣泛用于模擬干旱脅迫研究。試驗(yàn)共設(shè)3種處理(表2)。PEG-6000為固體顆粒、石墨烯溶膠為液體，在制備基本培養(yǎng)基時(shí)分別加入。接種方式參照NaCl脅迫處理，單株處理(包括對(duì)照)分別接種20瓶,3次重復(fù)。

1.2.3 歐洲山楊形態(tài)學(xué)研究和保護(hù)酶活性的測(cè)定 NaCl脅迫各處理接種后培養(yǎng)25 d，PEG-6000脅迫處理接種后培養(yǎng)10 d，分別統(tǒng)計(jì)成活率、生根率,觀察測(cè)量株高、根系與植株?duì)顩r。優(yōu)良苗占比以目測(cè)生長(zhǎng)正常植株個(gè)數(shù)占接種植株個(gè)體的百分?jǐn)?shù)表示。優(yōu)良苗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為植株葉色為淺綠或深綠，未出現(xiàn)黃化；葉片形態(tài)舒展，未出現(xiàn)干枯或萎蔫落葉現(xiàn)象；植株莖段未出現(xiàn)干枯黃化現(xiàn)象。綠色葉占比以目測(cè)綠色植株個(gè)數(shù)占接種植株個(gè)數(shù)的百分?jǐn)?shù)表示。鹽害率以受害組培苗個(gè)數(shù)占接種植株體個(gè)數(shù)的百分?jǐn)?shù)表示。采用LA-S植物圖像分析儀系統(tǒng)量化分析生根組培苗的根系。

用于分析植株保護(hù)酶活性的材料均為全株,從瓶中取出新鮮植株,溫水洗凈瓊脂后，立即放入液氮中冷凍,取出保存于-80 ℃冰柜中。用于測(cè)定蛋白含量，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(Catalase CAT)和過(guò)氧化物酶( peroxidase，POD)活性。酶活性為每個(gè)處理測(cè)定3株，每株3次重復(fù)。測(cè)定方法參照南京建成公司的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

表1 NaCl脅迫試驗(yàn)中各處理

表2 PEG6000脅迫實(shí)驗(yàn)中各處理

1.2.4 NaCl脅迫各處理培養(yǎng)基電導(dǎo)率的變化 培養(yǎng)基電導(dǎo)率測(cè)定采用雷磁DDSJ-308F型電導(dǎo)率儀。NaCl脅迫4種處理(不加瓊脂)準(zhǔn)確定容至1 L，靜置冷卻至室溫，關(guān)閉周?chē)僧a(chǎn)生影響性能振動(dòng)和電磁干擾的設(shè)備。平行測(cè)定6次。

查閱說(shuō)明書(shū)，電導(dǎo)率儀根據(jù)所測(cè)培養(yǎng)基電導(dǎo)率范圍為0～20 mS·cm-1，按說(shuō)明書(shū)所述，配制0.1 mol·L-1和0.01 mol·L-1的KCl溶液進(jìn)行標(biāo)定。標(biāo)定后的電導(dǎo)率儀測(cè)相應(yīng)校準(zhǔn)液，檢驗(yàn)結(jié)果是否與標(biāo)準(zhǔn)值一致。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用EXCEL 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)收集和初步整理，采用SPSS17.0 Statistics軟件LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。繪圖軟件采用Origin 8.5，顯著性水平為P<0.05，數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaCl脅迫下石墨烯溶膠對(duì)歐洲山楊組培苗生根培養(yǎng)效果的影響

如圖1所示，與對(duì)照相比,在僅加入75 mmol·L-1NaCl的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d,歐洲山楊植株的成活率、生根率、優(yōu)良苗占比、綠色葉占比4項(xiàng)指標(biāo)均顯著減小,減幅分別為20%、61.67%、71.7%、24.97%，以對(duì)根系的生長(zhǎng)和發(fā)育抑制作用最大，生根率為0。NaCl脅迫下加兩種不同濃度的石墨烯溶膠,前述4項(xiàng)指標(biāo)均有所增加,最大增幅分別為16.67%、18.33%、31.7%、15%。其中加入7.5 mg·L-1石墨烯溶膠生根率高達(dá)18.33%。根系分析表明處理4根系的總根長(zhǎng)與平均直徑均較對(duì)照顯著減少，減幅分別為28.29%與64.64%。而根系表面積和根數(shù)沒(méi)有顯著差異。

NaCl脅迫下鹽害率為31.67%，植株地上部同樣受到影響，平均株高降低49.07%，葉數(shù)降低29.98%。而NaCl脅迫下加7.5 mg·L-1石墨烯溶膠處理鹽害率最低降到6.67%，植株株高和葉數(shù)與單獨(dú)NaCl脅迫沒(méi)有顯著差異。

如圖2所示，與對(duì)照相比,在僅加入75 mmol·L-1NaCl的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d,歐洲山楊組培苗的形態(tài)發(fā)生明顯變化，植株葉色多呈現(xiàn)淡綠色，少數(shù)頂部尖端死亡或部分葉片死亡。底部未生根，愈傷組織膨脹。NaCl脅迫下加入4 mg·L-1石墨烯溶膠，植株葉色多呈正常綠色，少數(shù)微黃，葉片舒展肥大，底部未生根。NaCl脅迫下加入7.5 mg·L-1石墨烯溶膠處理，植株葉色多呈淡綠，部分呈微黃泛白，部分植株生根。

這些結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的石墨烯溶膠處理可減輕鹽脅迫對(duì)植株地上部的傷害，提高成活率。而較高濃度的石墨烯溶膠處理可以促進(jìn)植株在鹽脅迫環(huán)境下根系的生長(zhǎng)和發(fā)育，但所形成的根系較為細(xì)弱短小。

2.2 NaCl脅迫下石墨烯溶膠對(duì)歐洲山楊組培苗保護(hù)酶活性的影響

研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)NaCl處理后葉中SOD、CAT、POD 3種保護(hù)酶活性表現(xiàn)出同樣的規(guī)律，即高于對(duì)照(圖3)。其中SOD升高約39.14%，CAT約為對(duì)照4倍，兩者與對(duì)照之間都達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。而葉中POD活力較對(duì)照升高91.51%，總蛋白含量降低26.34%。與單獨(dú)NaCl脅迫處理相比，NaCl脅迫添加兩種濃度石墨烯溶膠后3種保護(hù)酶的活性均降低，其中添加4 mg·L-1石墨烯溶膠的SOD酶活力降低63.31%，POD酶活力降低29.71%，兩者都達(dá)到極顯著水平(p<0.01)。與單獨(dú)NaCl處理相比，添加4 mg·L-1石墨烯溶膠的CAT保護(hù)酶活力降低43.90%，總蛋白含量提高63.57%，兩者都達(dá)到顯著水平(p<0.05)。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差;同一組數(shù)據(jù)后小寫(xiě)字母不同者以及帶有*，表示差異達(dá)顯著水平(p<0.05)，下同。

圖2 石墨烯溶膠對(duì)NaCl脅迫下歐洲山楊組培苗形態(tài)的影響

本試驗(yàn)的4種處理中，僅對(duì)照與(NaCl+7.5 mg·L-1石墨烯溶膠)處理的試驗(yàn)組產(chǎn)生根系(圖4)。測(cè)試發(fā)現(xiàn)后者根中SOD、CAT、POD三種保護(hù)酶活性均顯著提高，差異達(dá)到顯著水平(p<0.05)。

根據(jù)資料，NaCl脅迫往往會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量積累，植物體內(nèi)會(huì)啟動(dòng)一系列活性氧清除系統(tǒng)(抗氧化酶系統(tǒng))，以減少活性氧積累對(duì)植物造成的傷害[14]。本試驗(yàn)中，單獨(dú)NaCl處理后植株葉片中三種保護(hù)酶活性都顯著提高，而蛋白含量卻有所下降。NaCl處理添加4 mg·L-1和7.5 mg·L-1石墨烯溶膠后，葉片中三種保護(hù)酶活性相較單獨(dú)NaCl處理均顯著下降，而蛋白含量有所上升?？梢哉J(rèn)為兩種濃度石墨烯溶膠的加入緩解了NaCl脅迫對(duì)植株地上部分造成的傷害。而在(NaCl+7.5 mg·L-1石墨烯溶膠)試驗(yàn)處理的根系中三種保護(hù)酶活性相較于對(duì)照均顯著提高，而總蛋白含量卻顯著下降，可以認(rèn)為植株仍然受到一定程度的脅迫。

圖3 石墨烯溶膠對(duì)NaCl脅迫下楊樹(shù)組培苗葉中SOD、POD、CAT等3種保護(hù)酶活性及蛋白含量的影響

圖4 石墨烯溶膠對(duì)NaCl脅迫下楊樹(shù)組培苗根系中SOD、POD、CAT等3種保護(hù)酶活性及蛋白含量的影響

2.3 石墨烯溶膠對(duì)PEG-6000脅迫下歐洲山楊組培苗培養(yǎng)效果的影響

與對(duì)照相比，在含10%PEG-6000的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d,歐洲山楊組培苗的成活率僅為43%。PEG-6000脅迫下加4 mg·L-1石墨烯溶膠處理，成活率并未上升。由圖5可見(jiàn),10.0%PEG-6000處理的葉片出現(xiàn)了干枯、變黃的癥狀，部分葉片脫落，植株底部?jī)H有較小愈傷組織，沒(méi)有生根跡象，而添加石墨烯溶膠后這種狀況并未明顯好轉(zhuǎn)，植株仍受到嚴(yán)重脅迫。

2.4 石墨烯溶膠對(duì)PEG-6000脅迫下歐洲山楊組培苗保護(hù)酶活性的影響

研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)PEG-6000處理后植株葉片中SOD、POD兩種酶活性表現(xiàn)出同樣的規(guī)律，即顯著低于對(duì)照。而葉片中CAT酶活力與蛋白含量高于對(duì)照(圖6)。加入4 mg·L-1石墨烯溶膠后(POD、CAT)保護(hù)酶活力與蛋白含量均未有顯著差異，而SOD酶活力高于單獨(dú)PEG-6000脅迫處理的。

圖5 石墨烯溶膠對(duì)PEG6000脅迫下歐洲山楊組培苗形態(tài)的影響

圖6 石墨烯溶膠對(duì)PEG-6000脅迫下楊樹(shù)組培苗根系中SOD、POD、CAT等3種保護(hù)酶活性及蛋白含量的影響

2.5 NaCl脅迫各處理培養(yǎng)基電導(dǎo)率的變化

如圖7所示，在含75 mmol·L-1NaCl的生根培養(yǎng)基電導(dǎo)率為9.86 mS·cm-1,顯著高于對(duì)照3.65 mS·cm-1。而添加4 mg·L-1與7.5 mg·L-1石墨烯溶膠后，電導(dǎo)率分別為10.45 mS·cm-1與10.11 mS·cm-1，兩者均顯著高于單獨(dú)NaCl脅迫處理的培養(yǎng)基，而加入7.5 mg·L-1石墨烯溶膠培養(yǎng)基電導(dǎo)率略低于4 mg·L-1石墨烯溶膠的。

石墨烯可以吸附溶解性有機(jī)質(zhì)(DOM)[11]，自然水環(huán)境中的DOM與石墨烯通過(guò)π-π作用力、氫鍵和Lewis酸堿作用力等機(jī)制發(fā)生吸附行為[12]。水溶液中存在離子時(shí),石墨烯的團(tuán)聚傾向增強(qiáng),團(tuán)聚程度與溶液的離子強(qiáng)度成正比[13]。本試驗(yàn)中加入75 mmol·L-1NaCl，培養(yǎng)基中具有較高的離子濃度。而在含75 mmol·L-1NaCl培養(yǎng)基中加入4 mg·L-1石墨烯溶膠后，石墨烯溶膠會(huì)發(fā)生一定程度的團(tuán)聚，影響其對(duì)金屬離子的吸附作用。而石墨烯溶膠表面的負(fù)電荷會(huì)使培養(yǎng)基電導(dǎo)率有所升高。而加入較高濃度(7.5 mg·L-1)石墨烯溶膠后，與培養(yǎng)基中金屬陽(yáng)離子特別是Na+發(fā)生較強(qiáng)的離子吸附作用，電導(dǎo)率有所降低。

圖7 石墨烯溶膠對(duì)NaCL脅迫下楊樹(shù)生根培養(yǎng)基電導(dǎo)率的影響

3 討論

NaCl脅迫對(duì)植物個(gè)體形態(tài)發(fā)育具有顯著的影響,整體表現(xiàn)為抑制植物組織和器官的生長(zhǎng)[15]。此次研究表明，加入7.5 mg·L-1石墨烯溶膠，可以提高歐洲山楊組培苗在NaCl脅迫下的成活率與生根率，但所生根較細(xì)弱短小。而4 mg·L-1石墨烯溶膠的加入也能提升植株地上部分質(zhì)量，優(yōu)良苗占比與綠葉占比均有所提升。植物在鹽脅迫條件下,體內(nèi)保護(hù)性酶(SOD、POD、CAT)能相互協(xié)調(diào)以降低植物體內(nèi)氧自由基水平,以維持植物體正常生長(zhǎng)、代謝[16]。在本試驗(yàn)中單獨(dú)NaCl脅迫處理植株葉片中三種保護(hù)酶活性均較對(duì)照明顯升高，而加入4 mg·L-1和7.5 mg·L-1石墨烯溶膠后，葉片中三種保護(hù)酶活性相較單獨(dú)NaCl脅迫處理都明顯下降。其中4 mg·L-1比7.5 mg·L-1下降更多，原因可能是較高濃度石墨烯溶膠的加入促進(jìn)了根系的生成，影響到植株地上部分的生長(zhǎng)發(fā)育。在NaCl脅迫下選擇合適濃度石墨烯溶膠是應(yīng)用的重點(diǎn)，本試驗(yàn)所設(shè)濃度還相對(duì)較少，隨著濃度升高可能會(huì)有更好的效果。

PEG-6000能夠很好的模擬干旱對(duì)植株的脅迫作用，加入10%PEG-6000后大約10 d植株大部分葉片已經(jīng)發(fā)黃、脫落，瀕臨死亡，而4 mg·L-1石墨烯溶膠的加入并未使情況好轉(zhuǎn)。試驗(yàn)處理的三種保護(hù)酶活性與蛋白含量也均未有好的變化。本試驗(yàn)結(jié)果表明石墨烯溶膠并不能在提升植株耐旱性方面發(fā)揮有益作用。

有研究表明，在常溫下，鹽溶液在0.244 2～2.442 mol·L-1，電導(dǎo)率與濃度呈線性關(guān)系[17]。本實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)NaCl脅迫處理，電導(dǎo)率顯著升高。而(NaCl+7.5 mg·L-1石墨烯溶膠)實(shí)驗(yàn)處理培養(yǎng)基電導(dǎo)率低于(NaCl+4 mg·L-1石墨烯溶膠)，但兩者均高于單獨(dú)NaCl處理培養(yǎng)基電導(dǎo)率。隨著石墨烯溶膠濃度的升高，電導(dǎo)率是否會(huì)持續(xù)降低，需要做更進(jìn)一步有針對(duì)性的研究。

在不同環(huán)境下不同濃度的石墨烯溶膠作用效果是完全不同的，在應(yīng)用過(guò)程中必須進(jìn)行大量的針對(duì)性實(shí)驗(yàn)。本試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室組培環(huán)境下進(jìn)行，培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單明確。而在自然環(huán)境中，土壤成分復(fù)雜、氣侯多變，石墨烯溶膠可能會(huì)出現(xiàn)不同的作用效果。根據(jù)本試驗(yàn)研究結(jié)果，我們認(rèn)為石墨烯溶膠在沿海半濕潤(rùn)鹽堿區(qū)、東北半濕潤(rùn)低洼鹽堿區(qū)或者有灌溉條件的鹽堿地具有較廣泛的應(yīng)用前景。

綜上所述，石墨烯溶膠能夠緩解NaCl對(duì)植株的脅迫，提高其生存率與生根率，促進(jìn)植株生長(zhǎng)，但并不能在干旱脅迫下發(fā)揮有益影響。石墨烯溶膠對(duì)Na+吸附作用并不強(qiáng)。石墨烯溶膠具有巨大的表面積和高表面活性，能夠?qū)ε囵B(yǎng)基中肌醇、維生素、糖、甘氨酸等有機(jī)質(zhì)產(chǎn)生穩(wěn)定的吸附作用，提升植株對(duì)有機(jī)質(zhì)的吸收作用。