碎米椏小孢子發(fā)生與雄配子體發(fā)育

(河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，鄭州 450046)

碎米椏(Rabdosiarubescens(Hemsl.) Hara)為唇形科香茶菜屬的小灌木，主要分布于黃河、長江流域，主產(chǎn)于河南濟(jì)源太行山一帶。夏、秋二季莖葉茂盛時(shí)采割其地上部分，曬干，即為中藥冬凌草。冬凌草具有清熱解毒，活血止痛之功效[1]?，F(xiàn)代研究證明，冬凌草還有抗腫瘤作用，作為天然藥物在臨床上的應(yīng)用非常廣泛。隨著各地對碎米椏需求量的增加，野生的碎米椏資源由于亂采濫挖，導(dǎo)致自然資源枯竭。

目前，對碎米椏的研究更多地集中在化學(xué)成分及藥理作用方面，但關(guān)于其有性生殖過程尚未見詳細(xì)報(bào)道，小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育是植物有性生殖過程的重要方面?；ㄋ幨潜蛔又参锏男坌云鞴?，是花粉發(fā)生和發(fā)育的場所，其結(jié)構(gòu)及功能的正常行使直接影響花粉的發(fā)育與成熟過程，花粉發(fā)育包括小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)生2個(gè)連續(xù)過程。因此，通過組織解剖學(xué)手段觀察了碎米椏花藥和花粉發(fā)育過程，旨在揭示小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育的主要特征，為探究碎米椏的胚胎學(xué)特征奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步開展碎米椏繁殖育種研究做好準(zhǔn)備。

1 材料與方法

研究材料采自河南省濟(jì)源市。碎米椏的花期為每年8—10月份，在開花初期，采摘不同大小的花蕾，同時(shí)收集綻開花的花藥，放入FAA固定液中進(jìn)行固定，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1 石蠟切片

FAA固定48 h，然后酒精梯度脫水(50%、70%、85%、95%、100%)，二甲苯透明后用石蠟包埋，使用LEICA-RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，切片厚度7～12μm，用鐵釩-蘇木精染色， 用奧林巴斯BX 51顯微鏡觀察并照相。

1.2 半薄切片

分別取不同發(fā)育時(shí)期的花蕾或花藥用FAA固定液固定后，50%、70%、80%、90%、95%、95%乙醇∶95%丙酮(1∶1)、95 %丙酮和100%丙酮逐級梯度脫水，每步驟10 min，脫水后，用Epon 812樹脂包埋。用萊卡R型超薄切片機(jī)制作0.5～1μm厚的半薄切片。染色采用高碘酸-希夫試劑。用奧林巴斯BX 51顯微鏡觀察并照相。

2 結(jié) 果

2.1 解剖特征

碎米椏的花期一般為8—10月，花為兩性花，每朵花內(nèi)有雄蕊4枚。成熟的花藥由4個(gè)花粉囊構(gòu)成。

2.2 花藥壁的發(fā)育

年幼的花藥外有1層表皮，表皮內(nèi)充滿一團(tuán)薄壁組織細(xì)胞(圖版： 1)。稍后，在橫切片上觀察到花藥在4個(gè)角隅表皮層下面有一群細(xì)胞質(zhì)濃厚、細(xì)胞核顯著的大型細(xì)胞，這就是孢原細(xì)胞(圖版，2)。孢原細(xì)胞經(jīng)過一次切向分裂，形成產(chǎn)生內(nèi)外2層細(xì)胞，分別為初生造孢細(xì)胞和初生壁細(xì)胞(圖版：3)。初生壁細(xì)胞經(jīng)切向分裂形成2層細(xì)胞(圖版：4)，外層細(xì)胞再分裂1次形成藥室內(nèi)壁和中層，內(nèi)層細(xì)胞為絨氈層。隨著花藥的生長，花藥的體積增大，此時(shí)在花藥的橫切片上觀察時(shí)，可以看到花藥在4個(gè)角隅形成囊狀體構(gòu)造，這就是花粉囊，碎米椏花藥有4個(gè)花粉囊，位于花藥的兩側(cè)，一邊1對?；ㄋ幈谟?層細(xì)胞構(gòu)成，由外至內(nèi)分別為表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層(圖版：5，6)。 藥室內(nèi)壁細(xì)胞通常只圍繞在花粉囊的外側(cè)，絨氈層細(xì)胞則完整地圍繞著花粉囊(圖版：5，6)，向著藥隔一側(cè)的絨氈層細(xì)胞是由小孢子母細(xì)胞鄰近的藥隔薄壁組織細(xì)胞分化形成的。

表皮細(xì)胞在花藥發(fā)育過程中在花藥壁中占據(jù)的厚度比較小(圖版：6～13)，在花藥發(fā)育接近成熟時(shí)被撐扁，最終破壞(圖版：14)或變?yōu)槿橥粻?，花粉成熟時(shí)，僅留下少許殘跡，花藥接近成熟時(shí)表皮細(xì)胞最后批次分離呈乳突狀(圖版：15)，當(dāng)花藥成熟時(shí)僅留下干枯的殘跡(圖版：16)。藥室內(nèi)壁在花藥發(fā)育的后期徑向伸長，排列整齊(圖版：13，14)，在花藥發(fā)育的晚期，藥室內(nèi)壁的徑向壁和內(nèi)切向壁上具有許多徑向排列纖維狀的次生加厚的條紋(圖版：15)，這時(shí)的藥室內(nèi)壁也稱纖維層，加厚條紋一般是積累了纖維素，花藥成熟時(shí)略微木質(zhì)化。藥室外壁細(xì)胞壁上的加厚條紋發(fā)育較晚，在花粉將要散播之前才發(fā)育完全，此時(shí)藥室內(nèi)壁之內(nèi)的藥室內(nèi)充滿了花粉(圖版：16)。 在花粉發(fā)育過程中，中層細(xì)胞由于不斷受到表皮細(xì)胞和絨氈層細(xì)胞的擠壓呈扁平狀(圖版：8～10)，細(xì)胞核小，細(xì)胞質(zhì)稀少，在四分體解體進(jìn)入游離小孢子時(shí)期后，中層細(xì)胞逐漸解體(圖版：11～13)，至小孢子單核靠邊期時(shí)被完全吸收(圖版：14)。在花藥發(fā)育的早期，絨氈層細(xì)胞是單核的，細(xì)胞近方形，細(xì)胞核大，細(xì)胞質(zhì)濃厚(圖版：5)。在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的早期，絨氈層細(xì)胞逐漸增大變長，細(xì)胞核進(jìn)行分裂，此時(shí)，絨氈層細(xì)胞以雙核形態(tài)存在(圖版：6)，細(xì)胞質(zhì)變濃(圖版：7，8)，在四分體時(shí)期絨氈層細(xì)胞體積最大，液泡體積達(dá)到最大，細(xì)胞質(zhì)顏色較淺，此時(shí)絨氈層的位置不變，細(xì)胞保持完整性(圖版：9，10)。在四分體即將解體時(shí)，絨氈層內(nèi)切向壁和徑向壁已經(jīng)出現(xiàn)退化現(xiàn)象(圖版：11)，在四分體以后，絨氈層的內(nèi)切向壁和徑向壁解體(圖版：12，13)，在小孢子發(fā)育到單核靠邊期時(shí)，絨氈層細(xì)胞幾乎完全解體(圖版：14)，在花粉發(fā)育成熟時(shí)，花藥壁只剩下纖維層和表皮細(xì)胞的殘跡(圖版：15，16)。

2.3 小孢子的發(fā)生

當(dāng)花藥壁形成時(shí)，初生造孢細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂以后，產(chǎn)生很多小孢子母細(xì)胞。小孢子母細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞壁薄， 細(xì)胞核顯著，細(xì)胞質(zhì)濃厚， 其橫切面呈多邊形(圖版：5)。小孢子母細(xì)胞發(fā)育到一定階段，在其質(zhì)膜與細(xì)胞壁之間沉積一定厚度的胼胝質(zhì)(圖版：6)，原來的細(xì)胞壁解體，細(xì)胞質(zhì)變濃、細(xì)胞核增大，核仁明顯(圖版：7)。小孢子母細(xì)胞經(jīng)過發(fā)育，進(jìn)入減數(shù)分裂狀態(tài)，小孢子母細(xì)胞由原來的緊密排列(圖版：7)變?yōu)槭杷膳帕?，形狀也由原來不?guī)則的多邊形變?yōu)榻鼒A形，細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核大(圖版：8)。小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂第1次分裂完成后不形成細(xì)胞壁，直接進(jìn)入到減數(shù)分裂第2次分裂形成4個(gè)小孢子(圖版：9)，小孢子又叫花粉細(xì)胞。4個(gè)小孢子排列成四面體形，被共同的胝胝質(zhì)壁包圍，相互之間也被胼胝質(zhì)壁分離(圖版：10)。隨著花藥的發(fā)育，四分體發(fā)育到后期，胼胝質(zhì)逐漸解體(圖版：11)，4個(gè)小孢子相互分離開來，發(fā)育成為游離小孢子，剛釋放的小孢子體積較小，形狀不規(guī)則(圖版：12)。

注：EP為表皮層；EN為藥室內(nèi)壁；M為中層；T為絨氈層；GC為生殖細(xì)胞；VC為營養(yǎng)細(xì)胞。1為花藥原基；2為孢原細(xì)胞；3為孢原細(xì)胞分裂；4為初生壁細(xì)胞分裂；5為花藥壁分化完成，初生造孢細(xì)胞經(jīng)過分裂，形成小孢子母細(xì)胞；6、7為小孢子母細(xì)胞時(shí)期；8為小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期，中層細(xì)胞開始解體；9、10為四分體時(shí)期的花藥壁，4個(gè)小孢子被共同的與各自產(chǎn)生的胼胝質(zhì)壁包被著；11為四分體的胼胝質(zhì)壁解體；12為剛從四分體中釋放出來變形的小孢子，多邊形或圓形；13為游離小孢子形成中央大液泡；14為小孢子單核靠邊期的花藥壁；15為花藥壁只剩下表皮層細(xì)胞和纖維層細(xì)胞；16為成熟的花藥；17為單核中央期小孢子；18為單核靠邊期小孢子,大液泡將細(xì)胞核擠向細(xì)胞壁一側(cè)；19為小孢子進(jìn)行有絲分裂，形成營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞；20為2-細(xì)胞花粉粒。圖版 碎米椏小孢子發(fā)生和雄配子體形成

2.4 雄配子體的發(fā)育

小孢子是雄配子體的第一個(gè)細(xì)胞，小孢子經(jīng)過進(jìn)一步發(fā)育后，體積稍變大，無明顯的液泡，核位于細(xì)胞中央，具濃厚的細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞壁不明顯，此時(shí)期為小孢子單核中央期(圖版：17)。之后，小孢子體積迅速增大，形成一個(gè)中央大液泡，細(xì)胞呈圓形，典型的花粉壁和6個(gè)萌發(fā)溝開始形成(圖版：13)。中央大液泡將細(xì)胞核擠向細(xì)胞壁一側(cè)，進(jìn)入單核靠邊期(圖版：14，18)。后來，小孢子繼續(xù)發(fā)育，靠近細(xì)胞壁的細(xì)胞核進(jìn)行一次不均等的有絲分裂，形成大小顯著不同的2個(gè)細(xì)胞，較大的為營養(yǎng)細(xì)胞，位于花粉中央，較小的為生殖細(xì)胞(圖版：19)，生殖細(xì)胞緊貼花粉壁一側(cè)，并靠著營養(yǎng)細(xì)胞的壁。不久，生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)細(xì)胞之內(nèi)，花粉粒體積繼續(xù)增大，形成成熟的二細(xì)胞型花粉粒(圖版：16，20)?；ǚ哿０l(fā)育成熟后，花粉囊開裂，最后花藥壁僅留存藥室內(nèi)壁和殘存的表皮(圖版：16)，以二核形態(tài)進(jìn)行傳粉(圖版：20)。

3 討 論

對碎米椏小孢子發(fā)生與雄配子發(fā)育過程的觀察表明，碎米椏雄蕊花藥具有4個(gè)花粉囊，花藥壁由四部分構(gòu)成，由外到內(nèi)依次是表皮、藥室內(nèi)壁、中層(一層)和絨氈層。根據(jù)Davis的分類方法，碎米椏花藥壁發(fā)育類型屬雙子葉型[2]。碎米椏成熟的花藥最外層是一層破壞了的表皮細(xì)胞層，表皮層之內(nèi)是一層徑向伸長的大型細(xì)胞，即藥室內(nèi)壁，花藥內(nèi)壁細(xì)胞纖維狀加厚，有利于成熟花藥的開裂。花藥壁中層只有一層細(xì)胞，從花藥發(fā)育的早期開始，中層細(xì)胞被擠壓，其細(xì)胞內(nèi)含物被相鄰的絨氈層和藥室內(nèi)壁吸收。

絨氈層在花粉發(fā)育過程中起重要作用[3-6]，為花粉發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，因而與花粉發(fā)育密切相關(guān)[7]。絨氈層有2種類型[8,9]：一種叫變形絨氈層，變形絨氈層在早期就發(fā)生解體，原生質(zhì)體移動到花粉囊中并融合為一體；另一種叫分泌絨氈層或腺質(zhì)絨氈層，分泌絨氈層向花粉囊腫分泌小孢子發(fā)育需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，在花粉發(fā)育的過程中細(xì)胞始終保持其完整性，細(xì)胞位置不變，直到花粉發(fā)育成熟之后才破壞消失。由于植物種類不同，花藥壁的細(xì)胞層數(shù)以及絨氈層的發(fā)育方式往往有所變化[10]。雙子葉植物中大多數(shù)都具有分泌絨氈層，碎米椏花藥的絨氈層在退化過程中，細(xì)胞壁消失，營養(yǎng)物質(zhì)可以通過其保留下來的細(xì)胞膜釋放到花粉囊內(nèi)，花粉成熟后絨氈層完全自溶，因此屬于分泌絨氈層。

花粉發(fā)育過程包括小孢子發(fā)生和雄配子體形成兩個(gè)方面[11,12]，小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂形成4個(gè)小孢子是小孢子發(fā)生的過程[5]，小孢子也叫花粉細(xì)胞。雙子葉植物花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程只進(jìn)行一次胞質(zhì)分裂，叫做同時(shí)型胞質(zhì)分裂，減數(shù)分裂所形成的4個(gè)小孢子(四分體)排列成四面體形。碎米椏小孢子母細(xì)胞也是進(jìn)行同時(shí)型胞質(zhì)分裂，減數(shù)分裂產(chǎn)生的4個(gè)小孢子排列為四面體形。四分體中的4個(gè)小孢子除了共同被小孢子母細(xì)胞原來的胝胝質(zhì)壁所包被外，小孢子各自產(chǎn)生自己的胝胝質(zhì)壁，胝胝質(zhì)是一種多糖類化合物，大多數(shù)化合物的分子是不能夠透過胝胝質(zhì)的，因此，胝胝質(zhì)壁的出現(xiàn)使得小孢子母細(xì)胞之間及4個(gè)小孢子彼此之間相互隔離開來，這種隔離對于花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂產(chǎn)生小孢子是非常必要的，否則將產(chǎn)生不育的花粉[13,14]。在絨氈層細(xì)胞產(chǎn)生的胼胝質(zhì)酶的作用下，發(fā)育到后期時(shí)的四分體的胝胝質(zhì)壁逐漸解體，絨氈層細(xì)胞也開始產(chǎn)生孢粉素，4個(gè)小孢子相互分離開來。

雄配子體形成是從小孢子開始至精子產(chǎn)生的過程，小孢子是雄配子體的第1個(gè)細(xì)胞，小孢子經(jīng)歷2次有絲分裂[15,16]，四分體的4個(gè)小孢子相互分離后，細(xì)胞增大體積，先進(jìn)行1次不均等的有絲分裂，產(chǎn)生1個(gè)營養(yǎng)細(xì)胞(較大)和1個(gè)生殖細(xì)胞(較小)；生殖細(xì)胞被1層胼胝質(zhì)構(gòu)成的薄壁包被著，緊靠營養(yǎng)細(xì)胞的壁。生殖細(xì)胞的胼胝質(zhì)壁存在時(shí)間不長，不久就消失，此時(shí)，生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)細(xì)胞之內(nèi)，包埋在營養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；第2次是生殖細(xì)胞分裂，產(chǎn)生2個(gè)精子。多數(shù)植物的小孢子只進(jìn)行1次有絲分裂形成2個(gè)細(xì)胞(營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞，為二細(xì)胞花粉)，花粉粒就發(fā)育成熟了，第2次分裂要在花粉管中進(jìn)行。但是也有很多植物的生殖細(xì)胞在花粉內(nèi)再進(jìn)行1次有絲分裂，形成2個(gè)精子，在花粉散布時(shí)含有3個(gè)細(xì)胞(三細(xì)胞花粉)。在已經(jīng)研究過的植物中大約有75%的植物就有二細(xì)胞花粉，有25%的植物具有三細(xì)胞花粉[17]。碎米椏雄配子體在開花時(shí)只完成1次有絲分裂，產(chǎn)生1大1小2個(gè)細(xì)胞，較大的為營養(yǎng)細(xì)胞，較小為生殖細(xì)胞，后來，生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)細(xì)胞之內(nèi)，成熟的花粉粒為二細(xì)胞型。第2次分裂要在花粉管中進(jìn)行?；ǚ鄢墒旌?，花藥每一側(cè)的2個(gè)花粉囊打通，各形成一室，即為藥室，此時(shí)花藥也發(fā)育成熟了。

碎米椏小孢子發(fā)生和雄配子體發(fā)育特征與Harley et al[18]對唇形科總結(jié)的特征大體上一致，然而，在有些特征方面有也所不同。例如：Harley et al認(rèn)為唇形科的絨氈層具有多細(xì)胞核，而已經(jīng)報(bào)道的幾種唇形科植物如：黃芩[19]、石香薷[20]、線紋香茶菜[21]、地椒[22]等絨氈層也都含有2個(gè)細(xì)胞核，本研究發(fā)現(xiàn)碎米椏的絨氈層也是含有2個(gè)細(xì)胞核；此外，與碎米椏的花粉粒為6個(gè)萌發(fā)溝2-細(xì)胞型，這與Harley et al[18]總結(jié)的也不一致。