二步消化分離提取不同比例的混合斑精子DNA初探

何佳烘

（廣州市公安局黃埔區(qū)分局，廣東 廣州515800）

含有精子的混合生物檢材是法醫(yī)物證學(xué)領(lǐng)域研究的一個(gè)熱門(mén)課題，按照GAT 383-2014法庭科學(xué)DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)范關(guān)于混合斑的提取與純化方法，采用差異裂解法提取精子DNA。在實(shí)際檢案過(guò)程中，對(duì)混合斑檢材前期進(jìn)行消化處理、精子沉淀后期進(jìn)行洗滌純化都需要耗費(fèi)大量時(shí)間，特別是當(dāng)女性受害者被強(qiáng)奸時(shí)為處女或正處月事期時(shí)，事后提取到的混合斑檢材多為大量女性陰道血液與少量男性精液的混合物，檢材中男女成分比例懸殊，對(duì)檢材進(jìn)行前期預(yù)處理時(shí)需耗費(fèi)更長(zhǎng)時(shí)間，且單純?cè)黾酉礈鞎r(shí)間次數(shù)常常未能完全清除混合檢材中受害人成分。本文通過(guò)改進(jìn)傳統(tǒng)差異裂解法的洗滌程序，成功提取到該類混合斑中的單一女性成分，并能保證檢驗(yàn)結(jié)果的均衡性［1］。

1 材料與方法

1.1 樣本

提取正常男性精液（P30檢測(cè)呈陽(yáng)性）若干，人工制作男性精液與女性血液混合的樣本，按照男性精液與女性血液為1∶1，1∶10，1∶30，1∶50，1∶80，1∶100的配比分別制作面積為（1×1）cm2各10份的混合斑樣本，采用傳統(tǒng)差異裂解法與改進(jìn)的差異裂解法提取檢材精子DNA。

1.2 儀器和試劑

9700PCR儀（美國(guó)ABI）；3130XL測(cè)序儀（美國(guó)ABI）；博坤全自動(dòng)提取工作站及其提取試劑盒（中國(guó)遼寧）；QIAsymphony提取蛋白酶（德國(guó)凱杰）；PowerPlex21TM試劑盒（美國(guó)Promega）。

1.3 方法

1.3.1 傳統(tǒng)差異裂解法

（1）將樣本剪碎后加入200uL TNE緩沖液，37℃保溫1h，加入20uL 10%SDS和10uL 10mg/mL PK，37℃保溫2h；

（2）使用NAO套管離心10min，6000 r/min去除載體，去除上清液，沉淀物分別加入800uL TNE離心10min，6000 r/min，洗滌3次；

（3）沉淀物加入20uL DTT、10uL 10mg/mL PK，振蕩混勻至沉淀溶解后將所有液體移入博坤提取消化過(guò)濾板，使用博坤試劑盒提取DNA，模板洗脫體積為50uL，4℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.3.2 改進(jìn)差異裂解法

（1）將樣本剪碎后置于1.5mL EP管，分別加入600uL TNE緩沖液、60uL 10%SDS和10uL 10mg/mL PK，37℃保溫2h，EP管離心10min，6000 r/min，自上而下吸取去除上清液500uL，余下液體分別加入300uL TNE緩沖液、30uL 10%SDS和10uL 10mg/mL PK，37℃保溫2h；

（2）移入NAO套管離心10min，6000 r/min去除載體，去除上清液，沉淀物分別加入800uL TNE離心10min，6000 r/min，洗滌1次；

（3）沉淀物加入20uL DTT、10uL 10mg/mL PK，振蕩混勻至沉淀溶解后將所有液體移入博坤提取消化過(guò)濾板，使用博坤試劑盒提取DNA，模板洗脫體積為50uL，4℃保存?zhèn)溆茫?］。

1.3.3 DNA擴(kuò)增及分型檢測(cè)

參照PowerPlex21TM試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行擴(kuò)增，取PCR產(chǎn)物經(jīng)3130XL測(cè)序儀電泳，用GeneMapper ID-X軟件進(jìn)行分析并獲得分型圖譜。對(duì)于獲得基因座在13個(gè)以上、各等位基因峰高于100rfu且峰值間比不小于1/3的樣本判定為成功獲得分型的樣本。

2 結(jié)果

本文中，混合斑檢材經(jīng)兩種差異裂解法提取的檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩種差異裂解法提取混合斑中精子的DNA檢測(cè)結(jié)果

比較兩種差異裂解法提取的檢驗(yàn)結(jié)果，改進(jìn)的差異裂解法檢出率明顯高于傳統(tǒng)差異裂解法。并且，樣本精血比例越懸殊、檢測(cè)難度越高時(shí)，兩者差異越顯著。

3 討論

用傳統(tǒng)的差異裂解法處理混合斑檢材時(shí)，上皮細(xì)胞與精子細(xì)胞的分離并不都是完全的，特別是在含有大量女性上皮細(xì)胞且精子細(xì)胞含量少的混合斑檢材中，一些上皮細(xì)胞在第一步消化時(shí)沒(méi)有消化干凈，使得精子DNA溶液中出現(xiàn)女性成分，表現(xiàn)為混合分型，不利于結(jié)果判斷。實(shí)驗(yàn)分析，兩種方法在混合斑精血比例不大的情形下，均能很好地獲得混合斑中的精子DNA。而當(dāng)混合斑檢材中精血比例慢慢增大時(shí)，傳統(tǒng)差異裂解法即使添加過(guò)量的試劑也無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)通過(guò)一次性消化獲得穩(wěn)定的核酸得率和純度，在后期洗滌過(guò)程中往往會(huì)因?yàn)榍捌谂猿煞窒煌耆珜?dǎo)致丟失大部分精子DNA基因座甚至無(wú)法檢出；改進(jìn)的差異裂解法在前期處理混合斑時(shí)增加了純化和二次消化步驟，在精血比例懸殊先行洗滌進(jìn)行純化以除去大部分血液成分，二次消化進(jìn)一步減少女性成分，后期的洗滌使細(xì)胞碎片與精子沉淀分開(kāi)，減少了混合斑中精子的損失，這大大提高了分離提取混合斑精子DNA的成功率［4］。

綜上所述，由于改進(jìn)的差異裂解法使用的試劑與傳統(tǒng)方法無(wú)異，無(wú)需特殊設(shè)備，適用于常見(jiàn)的混合斑檢材，而提取效能上較前者更具優(yōu)勢(shì)，且檢驗(yàn)結(jié)果峰值具有更好的均衡性，在日常檢案中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。