酸堿滴定法解決綿羊凍精稀釋液卵黃沉淀試驗(yàn)

肖廣慶，李新月，劉欣偉

（1.洛陽(yáng)市畜牧良種繁育推廣中心，河南 洛陽(yáng)471013；2.河南科技大學(xué)）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 器材

采精器材（假陰道、水浴鍋、集精杯、保定架），精液檢測(cè)（顯微鏡、密度儀、水浴鍋），酸堿滴定（酸度儀、定量滴定管、定量瓶），凍精生產(chǎn)（細(xì)管灌裝機(jī)、冷凍儀、冰箱、冰柜）。

1.1.2 種羊

洛陽(yáng)市畜牧良種繁育推廣中心種羊場(chǎng)肉用種公羊。

1.1.3 稀釋液

羊凍精稀釋液配方主要成分：三羥甲基氨基甲烷、糖類(lèi)、檸檬酸鈉、檸檬酸、卵黃、甘油、抗生素。經(jīng)測(cè)基礎(chǔ)液pH值為6.42，稀釋液pH值為6.45。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)pH值溶液

氫氧化鈉（pH值為13）。

1.2 試驗(yàn)方法

先用氫氧化鈉溶液滴定10 ml 基礎(chǔ)液，滴定時(shí)記錄每次滴定量（用0.2 ml滴定管或移液槍?zhuān)?，滴定后搖勻用酸度儀測(cè)量pH，測(cè)3 次記錄平均值，直至較理想pH 值（6.6～6.9），計(jì)算滴定量，超過(guò)2 ml，則用較高濃度氫氧化鈉溶液替代，換算滴定量直接滴定。調(diào)好pH值后的基礎(chǔ)液加甘油、卵黃配制成品稀釋液，安排采精、冷凍，觀察活力情況，并與滴定前配方稀釋液進(jìn)行對(duì)比。

1.3 pH值測(cè)定

酸度儀使用前要用標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)，誤差在規(guī)定范圍方可測(cè)定。測(cè)定時(shí)待測(cè)液最好放水浴鍋中，水浴鍋溫度與室溫一致，在酸度計(jì)允許范圍即可，記錄時(shí)3 次測(cè)定取平均值。具體滴定情況見(jiàn)表1：

表1 10 ml基礎(chǔ)液用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉液滴定情況

由表1 可知：10 ml 基礎(chǔ)液滴定0.1 ml NaOH 溶液pH值為6.83，為較理想中性偏酸環(huán)境。配制100 ml基礎(chǔ)液可用1 ml NaOH溶液校準(zhǔn)。

1.4 試驗(yàn)組與對(duì)照組稀釋液配制

試驗(yàn)組稀釋液用滴定后基礎(chǔ)液（100 ml 原基礎(chǔ)液加1 ml NaOH）加卵黃、甘油配制。對(duì)照組用滴定前基礎(chǔ)液加卵黃、甘油配制。配好后放冰箱（0～4 ℃）保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 冰箱存放一晚稀釋液情況

試驗(yàn)組卵黃沉淀較少，對(duì)照組出現(xiàn)大量卵黃沉淀，沉淀均為乳白色顆粒沉淀。搖勻后鏡檢試驗(yàn)組卵黃滴布滿視野，對(duì)照組有少量卵黃滴但不影響視野清晰度。

2.2 羊精液稀釋、平衡、冷凍后活力情況（表2）

表2 羊精液稀釋、平衡、冷凍后活力情況

羊鮮精用兩種稀釋液稀釋后放0～4 ℃冰柜平衡4 h、用細(xì)管灌裝冷凍后觀察活力情況。

由表2 可知：對(duì)照組平衡后活力高于試驗(yàn)組，冷凍后卻低于對(duì)照組。說(shuō)明，酸堿滴定雖然可以改變卵黃沉淀，但精子活力下降，并且在顯微鏡下放置10 多分鐘后出現(xiàn)大量聚集死亡現(xiàn)象。［1-2］

3 討論

羊凍精稀釋液pH 值是導(dǎo)致卵黃沉淀的因素之一，但調(diào)整pH值后仍有少量沉淀，說(shuō)明導(dǎo)致卵黃沉淀的因素除基礎(chǔ)液pH值外還有其他因素存在。

單純用酸堿滴定方法調(diào)整基礎(chǔ)液pH值可能改變稀釋液電離平衡，導(dǎo)致精子產(chǎn)生凝聚反應(yīng)而大量死亡。

稀釋液中加有三羥甲基氨基甲烷等緩沖物質(zhì)，酸堿滴定降低稀釋液的緩沖性，導(dǎo)致精子凍傷或死亡，降低凍后活力。如果改用三羥甲基氨基甲烷滴定校準(zhǔn)基礎(chǔ)液酸堿度可能更為合適。