塊菌胞外多糖合成機(jī)制和運(yùn)動抗氧化作用

李 陸

（內(nèi)蒙古大學(xué)體育學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021）

塊菌（Tuber spp.）具有迷人的香味、獨(dú)特的口感和豐富的營養(yǎng)價(jià)值，在法國意大利等發(fā)達(dá)國家，與魚子醬、鵝肝醬同被稱為三大珍品[1]。塊菌含有17種氨基酸、8種維生素、適量的蛋白質(zhì)、以及雄性酮、甾醇、鞘脂、脂肪酸、氨基酸及微量元素等50余種營養(yǎng)成份[2]。塊菌具有滋陰補(bǔ)腎、抗腫瘤等功效，可增強(qiáng)人體免疫力，具有抗病毒、抗氧化的作用，是一種藥食兼?zhèn)渚N[3]。用于慢性遷延性肝炎和調(diào)節(jié)免疫等綜合性治療中，具有清熱解毒、消炎、預(yù)防機(jī)體氧化損傷等作用。塊菌作為一種稀有食藥用真菌，其天然的藥用價(jià)值還需要進(jìn)一步的挖掘，通過對塊菌中的多糖組成成份進(jìn)行研究，考察其胞外多糖的抗氧化作用，探討塊菌胞外多糖對運(yùn)動健康的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑藥品

試驗(yàn)用新鮮塊菌購自昆明匯珍園塊菌有限公司，該塊菌品種為印度塊菌（Tuber indicum），顏色為黑褐色。其它主要試劑藥品如表1所示。

1.2 主要試驗(yàn)儀器設(shè)備

本試驗(yàn)所用的主要儀器設(shè)備如表2所示。

表1 試驗(yàn)主要試劑Tab.1 Main test reagents

表2 試驗(yàn)主要儀器設(shè)備Tab.2 Main test instruments and equipment

1.3 塊菌胞外多糖提取方法

使用超聲波輔助熱水浸提法來提取塊菌胞外多糖[4]，具體提取方法如下。

將新鮮塊菌清凈、晾干、切片，在80℃下烘箱中烘干60 min后，上粉碎機(jī)制成粉，過80目篩。取塊菌粉末按1∶1的比例加水混合得塊菌混合液。

塊菌多糖具有醇沉的特性，將塊菌混合液中加入乙醇，將其濃縮，可沉淀較多的多糖[5]。將沉淀下來的塊菌混合液，在4℃冰箱中恒溫24 h，然后離心收集沉淀，再用丙酮和無水乙醇有機(jī)溶劑來反復(fù)洗滌3次，丙酮的作用主要是用來脫除多糖中的一些脂肪及部分色素，從而得到塊菌多糖粗液。

用超聲波提取設(shè)備對塊菌多糖粗液進(jìn)行處理，在480 W超聲條件下持續(xù)60 min，然后再進(jìn)行多糖的熱水浸提。將超聲波處理后的塊菌多糖粗液于95℃熱水環(huán)境下提取2 h，再經(jīng)過反復(fù)3次的提取，并用丙酮、無水乙醇進(jìn)行洗滌，沉淀后的多糖經(jīng)自然風(fēng)干即可得塊菌胞外粗多糖樣品。

2 塊菌胞外多糖精密度測試

取塊菌胞外粗多糖粉末，用蒸餾水稀釋配制成400 μg·mL-1的塊菌樣品溶液。使用苯酚-硫酸法的精密度，計(jì)算10組塊菌多糖樣品溶液的提取率，結(jié)果如表3所示。

表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Precision of test results

由表3可知，10份樣品多糖含量的平均提取率為6.083 mg·mL-1，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.370%，滿足精密度要求。

3 塊菌胞外多糖穩(wěn)定性測試

采用苯酚-硫酸法測定塊菌樣品溶液的穩(wěn)定性，取其中一個塊菌樣品溶液，分別于顯色后0、0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h、4.0 h、4.5 h，在560 nm下測吸光度，結(jié)果如表4所示。

由表4可知，塊菌胞外多糖樣品溶液吸光度隨時間變化不明顯，平均吸光度為0.403，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為1.310%，說明該方法滿足測定的要求，穩(wěn)定性良好。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Stability results

4 小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)

試驗(yàn)采用18 g～20 g體重的昆明種小鼠，購自江蘇艾菱菲生物科技有限公司。正常飼養(yǎng)條件適用性喂養(yǎng)2周后，按體重隨機(jī)分成4組，每組10只。高劑量組每天1次給小鼠灌胃塊菌多糖樣品0.3 mL；中劑量組每天1次灌胃塊菌多糖樣品0.2 mL和蒸餾水0.1 mL；低劑量組每天1次灌胃樣品0.1 mL和蒸餾水0.2 mL；空白對照組每天1次灌蒸餾水胃0.3 mL。以上4組均連續(xù)灌胃7 d，自由進(jìn)食飲水。最后1次灌胃1 h后，給小鼠尾根部按其體重5%負(fù)荷鉛皮，將各組小鼠分別置于40 cm×30 cm×40 cm的水箱中進(jìn)行游泳，水溫（25±2）℃，觀察并記錄各組小鼠游泳時間，記錄自小鼠進(jìn)入水中至游泳疲勞力竭時的游泳時間，以小鼠頭部入水7 s后不上浮時，判定其游泳已至力竭。

小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)的結(jié)果見表5。

表5 小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Effect of burden swimming time of mice

從表5可以看出，與對照組相比，塊菌的高、中、低3個劑量組都能夠顯著增加小鼠平均游泳時間（P＜0.05），其中，中、高劑量組對小鼠游泳時間的延長有極顯著的影響（P＜0.01），并存在著劑量的正相關(guān)性。說明塊菌多糖能夠明顯延長小鼠的肌肉耐力，具有顯著的抗疲勞保健效果。3個組別的小鼠游泳時間相對于對照組分別提高了29.3%、72.0%和97.8%。

5 小鼠肝臟稱重試驗(yàn)

稱量小鼠的肝臟重量，可間接顯示塊菌多糖樣品溶液對肝糖原含量的影響，從而判斷是否塊菌多糖具有提高能量貯備的功效，是否具有抗疲勞的作用。在上述小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)完成后，立即解剖小鼠，取出肝臟稱重，記錄各組小鼠肝臟重量，肝重系數(shù)（E，%） 計(jì)算公式為：

式中：M1為肝濕重（g）；M2為體重（g）。

小鼠肝臟重量變化試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。

由表6可以看出，各劑量組小鼠的肝重系數(shù)均高于對照組，均具有顯著性意義（P＜0.05），其中高劑量組相對于對照組具有極顯著意義。結(jié)果顯示，灌服塊菌多糖樣品溶液的小鼠相對于對照組小鼠的肝重占體重的比重系數(shù)明顯增加，且隨劑量的增加效應(yīng)增大。間接說明塊菌多糖能夠提高小鼠肝糖原的儲備，為肌體提高更多的能量，從而增加小鼠對疲勞的耐受性。

表6 小鼠肝重變化Tab.6 The change of liver weight of mice

6 討論

在對塊菌胞外多糖的提取的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了多糖的精密度和穩(wěn)定性測試。通過塊菌多糖樣品溶液的小鼠負(fù)重游泳試驗(yàn)表明，塊菌多糖能夠明顯延長小鼠的肌肉耐力，具有顯著的抗疲勞保健效果。分析其原因可能是塊菌胞外多糖對蛋白質(zhì)的分解起到了減緩作用，使機(jī)體獲得了更多的能量來延長運(yùn)動時間。另外也有研究表明，多糖對超氧陰離子自由基、羥自由基和羧自由基等有一定的清除效果。

通過小鼠的肝臟稱重試驗(yàn)表明，塊菌胞外多糖能夠提高小鼠肝糖原的儲備，具有顯著的抗氧化活性。各劑量的塊菌多糖樣品溶液對小鼠均具有顯著的抗疲勞作用，可能是因?yàn)樵黾蛹◇w肝糖原儲備量間接達(dá)到抗疲勞作用。后期還需要對其抗疲勞的機(jī)制深入研究，為抗疲勞功能食品開發(fā)提供新思路。