基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討桃紅四物湯治療骨質(zhì)疏松癥的主要活性成分及藥理作用機制

樊梅 唐 芳 馬武開 蘭維婭

【摘 要】目的：從網(wǎng)絡(luò)藥理學角度研究桃紅四物湯治療骨質(zhì)疏松癥的主要活性成分及多維藥理作用機制。方法：從中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺中提取桃紅四物湯的化學成分，以口服生物利用度OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18篩選活性成分，通過該數(shù)據(jù)庫提取活性成分作用靶點，以GeneCards和OMIM在線分析平臺挖掘靶點相關(guān)疾病，采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建活性成分?作用靶點網(wǎng)絡(luò)，String10.0構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，最后通過基因本體（GO）和基因組百科全書（KEGG）富集分析桃紅四物湯治療骨質(zhì)疏松癥的藥理作用機制。結(jié)果：共篩選得到桃紅四物湯69個活性成分，涉及5346個作用靶點，主要涉及破骨細胞分化，激素，相關(guān)炎癥因子，甲狀旁腺激素的合成、分泌及作用等生物過程，通過調(diào)節(jié)白細胞介素-17、輔助性T細胞17、T細胞受體、Toll樣受體、雌激素、絲裂原活化蛋白激酶、PI3K-Akt、甲狀腺激素、FoxO、Wnt等信號通路發(fā)揮治療骨質(zhì)疏松癥的作用。結(jié)論：本研究體現(xiàn)了桃紅四物湯多成分?多靶點?多途徑的作用特點，為進一步開展桃紅四物湯治療骨質(zhì)疏松癥作用機制的研究提供了新的思路與方法。

【關(guān)鍵詞】 骨質(zhì)疏松癥;網(wǎng)絡(luò)藥理學;桃紅四物湯;活性成分;作用機制

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種全身性骨骼疾病，表現(xiàn)為骨組織微結(jié)構(gòu)退行性變和低骨量，引起骨的脆性和骨折的敏感性增加。各年齡段骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)病率都在增加，女性患骨折的風險是男性的2倍。隨著我國社會進入人口老齡化階段，本病的發(fā)病率將持續(xù)升高[1]。OP主要以雙膦酸鹽類作為一線治療藥物，其次是核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子配體（RANKL）抑制劑。甲狀旁腺素（甲狀旁腺激素的一個片段）是只有經(jīng)批準的合成代謝劑，激素替代療法（HRT）包括大量雌激素或雌激素加孕激素聯(lián)合制劑，其中一些被批準用于預(yù)防絕經(jīng)后骨折高危婦女的OP，補充鈣和維生素D經(jīng)常被認為是治療OP的輔助手段[2]。盡管這些策略對OP有很好的療效，但研究顯示長期服用這些藥物具有較大的不良反應(yīng)，如對胃腸道損害、耐藥等。因此，尋求一種安全有效治療OP的藥物具有重要的臨床意義[3]。

OP屬中醫(yī)學“骨痿”“虛勞”“骨痹”“骨枯”等范疇。許多中草藥及經(jīng)典古方在辨證論治基礎(chǔ)上治療OP得到了良好的應(yīng)用，在臨床上取得了較好的療效[4]。桃紅四物湯最早出自清·吳謙所著《醫(yī)宗金鑒》，是由四物湯加桃仁、紅花而成，也稱加味四物湯，全方有活血化瘀、養(yǎng)血補血的作用，是治療血瘀證的常用方。四物湯中當歸、川芎為血中之氣藥，熟地黃、白芍為血中之血藥，加上桃仁、紅花的活血作用，全方具有養(yǎng)血而不滯血、活血而不傷血的功效[5]。楊國柱等[6]利用潑尼松誘導斑馬魚OP模型評價桃紅四物湯抗OP作用的實驗研究發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯對斑馬魚OP模型有明顯的治療作用。此外，很多研究都表明，桃紅四物湯具有治療OP的作用，這也體現(xiàn)了中醫(yī)藥治療OP具有很大的優(yōu)勢及潛力。桃紅四物湯在中醫(yī)藥治療OP的臨床實踐中雖得到廣泛的運用，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及具體作用機制尚不清楚，這是限制其臨床廣泛運用的關(guān)鍵問題。因此，基于桃紅四物湯所含有效成分的復(fù)雜性、多樣性，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法探討桃紅四物湯對OP的藥理作用機制，并基于藥物、靶點和OP靶點之間的關(guān)系建立藥理學網(wǎng)絡(luò)，希望能為深入了解桃紅四物湯治療OP提供一定的參考依據(jù)。

1 研究方法

1.1 桃紅四物湯所含化合物的收集與篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）收集桃紅四物湯中桃仁、紅花、當歸、川芎、白芍、熟地黃6味藥的成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為限定條件對所收集到的化合物進行篩選。

1.2 桃紅四物湯所含化合物作用靶點的預(yù)測 對1.1中化合物的作用靶點進行預(yù)測。

1.3 OP發(fā)病靶點檢索及桃紅四物湯作用OP相關(guān)靶點的預(yù)測 通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將所得藥物靶點ID轉(zhuǎn)換成GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）的基因名稱。以“osteoporosis”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫收集與OP相關(guān)的基因，取得分≥0.4的靶點，將挖掘得到的OP相關(guān)基因與桃紅四物湯靶點基因互相映射篩選出共同靶點，獲得桃紅四物湯治療OP的作用靶點。

1.4 桃紅四物湯所含化合物作用OP相關(guān)靶點相互作用的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將每個化合物與其作用的OP靶點相聯(lián)系，通過Cytoscape 3.7.2軟件進行桃紅四物湯的成分-OP相關(guān)靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建并繪制網(wǎng)絡(luò)圖，利用軟件中的Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點度和介數(shù)中心度。

1.5 桃紅四物湯對OP作用靶點的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為了說明靶點蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，將桃紅四物湯相關(guān)靶點基因上傳至在線String10.0軟件（https：//string-db.org/），選擇研究物種為人類，設(shè)置靶點之間最低要求聯(lián)系分數(shù)為0.4，并隱藏不與其他靶點聯(lián)系的靶點，構(gòu)建由導入基因表達產(chǎn)物組成的PPI網(wǎng)絡(luò)，并且利用R語言3.6.1軟件（https：//www.r-project.org/）對PPI網(wǎng)絡(luò)中的蛋白繪制條形圖。

1.6 桃紅四物湯治療OP預(yù)測靶點富集分析 運用DAVID數(shù)據(jù)庫，以P < 0.05作為篩選條件獲得靶點蛋白進行基因本體（GO）功能富集分析及基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，包括生物過程、細胞組成和分子功能3個部分。

2 結(jié) 果

2.1 活性化合物的篩選 為了提供更準確的結(jié)果，本研究挑選TCMSP中OB≥30%、DL≥0.18的化合物，共檢索出730個化合物，其中桃仁66個、紅花189個、當歸125個、川芎189個、白芍85個、熟地黃76個，通過篩選得出69個活性化合物，如谷甾醇α1、β-胡蘿卜素、黃芩苷、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、槲皮素、豆甾醇、芍藥總黃酮、芍藥苷、兒茶素等。

2.2 桃紅四物湯所含化合物作用靶點的預(yù)測 對2.1中化合物的作用靶點進行預(yù)測，共得到5346個作用靶點。

2.3 桃紅四物湯靶點與OP靶點相互作用韋恩圖 依據(jù)Relevance score≥4標準，按分子-靶蛋白對接結(jié)果篩選出相關(guān)靶蛋白，利用UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換成對應(yīng)的基因名稱，如遇PBD ID對應(yīng)多個基因，則核對靶蛋白內(nèi)容選擇基因，確保1個蛋白對應(yīng)1個基因。結(jié)果，共得到199個靶基因，再依據(jù)GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫挖掘得到OP相關(guān)基因615個，最后將桃紅四物湯活性成分-OP靶點相關(guān)基因映射，共發(fā)現(xiàn)41個共同基因，確定為桃紅四物湯治療OP的靶基因。見圖1。

2.4 桃紅四物湯靶點-OP相互作用網(wǎng)絡(luò) 將候選化學成分與OP靶點通過Cytoscape 3.7.2建立桃紅四物湯成分靶點-OP靶點群網(wǎng)絡(luò)，得出桃紅四物湯靶點-OP網(wǎng)絡(luò)主要由56個節(jié)點（13個化合物節(jié)點，43個靶點節(jié)點）和115條邊組成，其中菱形節(jié)點紅色表示疾病OP，六邊形紫色表示藥物，黃色三角形節(jié)點表示桃紅四物湯藥物活性成分，圓形綠色節(jié)點表示桃紅四物湯可能是通過這些基因治療OP，連接化合物與靶點的每條邊表示桃紅四物湯活性成分與OP靶點之間的相互作用關(guān)系。見圖2。在桃紅四物湯靶點-OP靶點網(wǎng)絡(luò)中，桃紅四物湯中有13種主要成分作用于OP相關(guān)靶點，充分體現(xiàn)了其多成分、多靶點的作用特點。其主要的化合物有β-谷甾醇、木脂素、6-羥基山奈酚、黃芩素、槲皮素、β-胡蘿卜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素、芍藥苷、兒茶素、肉豆蔻堿等，這些藥物的活性成分可能是治療OP的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.5 靶點PPI網(wǎng)絡(luò)、關(guān)鍵基因分析 PPI網(wǎng)絡(luò)包含41個靶蛋白節(jié)點，共有403條相互作用連線。見圖3。其中度值較大的有白細胞介素（IL）-6（度值 = 38）、IL-B（度值 = 35）、JUN（度值 = 32）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9，度值 = 30）、表皮生長因子（EGF，度值 = 28）、低聚果糖（FOS，度值 = 28）等，它們與其他蛋白相互作用，在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。見圖4。

2.6 GO生物過程分析 將41個靶基因在DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO生物過程富集，根據(jù)錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR） < 0.05篩選出62個GO生物過程。其中受體調(diào)節(jié)活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、受體配體活性、染色質(zhì)結(jié)合活性等位于GO生物過程富集的前面。見圖5、圖6。OP的發(fā)生、發(fā)展涉及蛋白質(zhì)的活性、轉(zhuǎn)錄因子的活性、DNA及RNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物過程，而桃紅四物湯可通過調(diào)節(jié)以上生物過程治療OP。

2.7 KEGG信號通路分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫將桃紅四物湯的41個靶基因在KEGG信號通路中富集，根據(jù)FDR < 0.05篩選出與OP密切相關(guān)的信號通路，包括IL-17、輔助性T細胞17（Th17）細胞、T細胞受體、Toll樣受體、雌激素、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、PI3K-Akt、甲狀腺激素、FoxO、Wnt等信號通路。其中每條通路都有相對應(yīng)的通路圖，涉及破骨細胞分化，激素，相關(guān)炎癥因子，甲狀旁腺激素的合成、分泌及作用等生物過程。由此推測，桃紅四物湯可能主要通過調(diào)節(jié)以上關(guān)鍵基因，影響此類信號通路發(fā)揮治療OP的作用。KEGG富集通路的柱狀圖，見圖7。

3 討 論

OP是一種以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)破壞為主要特征的全身性疾病，臨床上以全身骨痛及易于發(fā)生骨折為主要表現(xiàn)，尤以老年人及絕經(jīng)后婦女多見，隨著我國人口老齡化加快，其分型又以絕經(jīng)后OP為常見[7-8]。季兆潔等[9]發(fā)現(xiàn)，桃紅四物湯具有顯著的促進骨折愈合作用，促進骨痂微血管的新生，顯示出良好的祛瘀生新作用。中醫(yī)藥治療OP具有價格低廉、劑型豐富、不良反應(yīng)小、依從性好等優(yōu)勢，在治療早中期OP方面發(fā)揮著不可替代的作用[10]。而網(wǎng)絡(luò)藥理學通過對中藥的收集整合，建立了多種中藥數(shù)據(jù)庫，以可視化的形式將各個藥物與疾病之間的關(guān)系系統(tǒng)地呈現(xiàn)出來[11]。從本研究結(jié)果來看，桃紅四物湯中關(guān)鍵的活性成分、基因參與并調(diào)控了OP的進程，與目前已有的關(guān)于桃紅四物湯治療OP的研究相一致，為桃紅四物湯“多成分—多靶點—多疾病”治療OP的機制提供了參考。

從OP與桃紅四物湯的共同靶點來看，OP與桃紅四物湯相關(guān)的活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡(luò)中包含41個靶點，其中度值較大的有IL-6、IL-B、JUN、MMP-9、EGF、FOS等，推測桃紅四物湯有效成分可能通過抑制上述靶點發(fā)揮作用。如血清IL-6可能與OP的發(fā)病有關(guān)[12]，MMP-9是破骨細胞前體的重要調(diào)節(jié)因子[13]。

本研究初步篩選出桃紅四物湯治療OP的活性成分有β-谷甾醇、木脂素、6-羥基山奈酚、黃芩素、槲皮素、β-胡蘿卜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素、芍藥苷、兒茶素、肉豆蔻堿等。β-谷甾醇是一種植物甾醇，在體外和體內(nèi)研究中被報道為具有抗炎、抗血管生成和降低膽固醇作用;槲皮素為一種黃酮類化合物，據(jù)報道，槲皮素可以降低因小鼠卵巢切除和骨修復(fù)而導致的骨完整性喪失。研究發(fā)現(xiàn)，這兩種藥物具有改善骨脆性和骨折的藥理作用，能逆轉(zhuǎn)體內(nèi)外雌激素調(diào)節(jié)引起的骨重塑的衰弱狀態(tài)，維持鈣、磷水平和骨完整性[14]。有研究者利用代謝組學的方法，評價木脂素對去卵巢OP模型大鼠的療效和治療靶點，最終鑒定出16種潛在的生物標志物，通過影響內(nèi)源性相關(guān)代謝機制，為絕經(jīng)后OP的治療提供了藥理依據(jù)[15]。付方勝等[16]實驗提示，黃芩素可以通過抑制RANKL誘導的破骨細胞分化和骨吸收功能，預(yù)防破骨細胞增強導致的OP;此外，它還可通過激活mTORC1信號通路刺激MC3T3-E1細胞分化為成骨細胞[17]。

山奈酚是一種天然黃酮類化合物，從山奈酚根狀莖中提取，研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚對去卵巢大鼠OP的防治作用是使骨密度有顯著提高，明顯抑制大鼠尿液中骨鈣和磷的流失，能夠顯著抑制去卵巢大鼠血清中酒石酸酸性磷酸酶和組織蛋白酶K的活性，改善OP大鼠骨小梁形態(tài)結(jié)構(gòu)[18-19]。β-胡蘿卜素能促進成骨細胞的早期分化，維持骨轉(zhuǎn)換的正平衡[20]。木犀草素是一種具有抗氧化活性的植物類黃酮。研究發(fā)現(xiàn)，其可以通過減輕氧化應(yīng)激促進成骨細胞增殖，并通過調(diào)節(jié)ERK/LRP-5/GSK-3β途徑促進成骨細胞分化，在糖皮質(zhì)激素性O(shè)P的治療中發(fā)揮重要作用[21]。芍藥苷是一種天然產(chǎn)物，能提高成骨細胞活性，抑制破骨細胞活性，從而減少去卵巢引起的OP[22]。綜上所述，桃紅四物湯的有效成分之間不僅存在緊密的協(xié)同關(guān)系，而且其作用靶點也在整個疾病進程中發(fā)揮著重要作用。

從通路富集結(jié)果分析可知，桃紅四物湯治療OP核心基因的KEGG通路主要涉及IL-17、Th17細胞、T細胞受體、Toll樣受體、雌激素、MAPK、PI3K-Akt、甲狀腺激素、FoxO、Wnt、AGE-RAGE等。其中每條通路都有相對應(yīng)的通路圖，涉及破骨細胞分化，激素，相關(guān)炎癥因子，甲狀旁腺激素的合成、分泌及作用等生物過程。

根據(jù)本研究結(jié)果，桃紅四物湯多靶點、多通路治療OP的機制得到初步驗證，網(wǎng)絡(luò)藥理學分析結(jié)果從另一方面也說明了引起OP因素多且復(fù)雜，為從分子水平方向進一步揭示桃紅四物湯治療OP的潛在化學成分及作用機制，為后期藥物研發(fā)及疾病治療提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻

[1] ZHOU S，TAO Z，ZHU Y，et al.Mapping theme trends and recognizing hot spots in postmenopausal osteoporosis research：a bibliometric analysis[J].Peer J，2019，7（1）：e8145.

[2] 沈衛(wèi)，楊蔚，張冠亞，等.補腎活血湯聯(lián)合補鈣劑口服治療老年性骨質(zhì)疏松癥臨床觀察[J].風濕病與關(guān)節(jié)炎，2017，6（1）：22-25，32.

[3] 李佳凌，高明利.補腎中藥及方劑對骨質(zhì)疏松OPG/RANK/RANKL系統(tǒng)作用的研究進展[J].風濕病與關(guān)節(jié)炎，2019，8（2）：72-76.

[4] 李娜，杜麗坤，王冰梅.原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)證素辨證法[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2019，25（7）：1010-1014.

[5] 李雙雙，郭春燕.桃紅四物湯化學成分及藥理作用研究進展[J].神經(jīng)藥理學報，2016，6（4）：42-49.

[6] 楊國柱，段濤，盧麗，等.桃紅四物湯對潑尼松誘導斑馬魚骨質(zhì)疏松的治療作用[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2017，23（8）：1007-1010，1021.

[7] 陳翔，林燕萍，賈曉康.口服類西藥及中藥復(fù)方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥進展[J].風濕病與關(guān)節(jié)炎，2016，5（3）：59-62.

[8] 吳楊鵬，蔡弢藝，何燕倩，等.狀態(tài)理論指導下絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的病機再認識[J].風濕病與關(guān)節(jié)炎，2019，8（10）：59-61，79.

[9] 季兆潔，韓嵐，彭代銀，等.桃紅四物湯對早期閉合性骨折祛瘀生新作用的初步探討[J].中國實驗方劑學雜志，2015，21（3）：125-129.

[10] 葛繼榮，鄭洪新，萬小明，等.中醫(yī)藥防治原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥專家共識（2015）[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2015，21（9）：1023-1028.

[11] 韓森，呂愛平，李健，等.網(wǎng)絡(luò)藥理學在中藥藥性理論研究中的應(yīng)用概述[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志，2019，25（1）：127-130.

[12] JI YF，JIANG X，LI W，et al.Impact of interleukin-6 gene polymorphisms and its interaction with obesity on osteoporosis risk in Chinese postmenopausal women[J].Environ Health Prev Med，2019，24（1）：48.

[13] SUN M，ZHOU X，CHEN L，et al.The regulatory roles of micrornas in bone remodeling and perspectives as biomarkers in osteoporosis[J].BioMed Res Int，2016（1）：1-11.

[14] CHAUHAN S，SHARMA A，UPADHYAY NK，et al.In-vitro osteoblast proliferation and in-vivo anti-osteopo-rotic activity of Bombax ceiba with quantification of Lupeol，gallic acid and β-sitosterol by HPTLC and HPLC[J].BMC Complement Altern Med，2018，18（1）：233.

[15] ZHANG AH，MA ZM，SUN H，et al.High-throughput metabolomics evaluate the efficacy of total lignans from acanthophanax senticosus stem against ovariectomized osteoporosis rat[J].Front Pharmacol，2019，10（1）：553.

[16] 付方勝，丁佳昕，邵思遠，等.黃芩素抑制RANKL誘導的破骨細胞分化和功能[J].錦州醫(yī)科大學學報，2019，40（2）：18-20.

[17] LI SF，TANG JJ，CHEN J，et al.Regulation of bone formation by baicalein via the mTORC1 pathway[J].Drug Des Ther，2015，9（1）：5169-5183.

[18] 丁淑琴，楊風琴，張瑋，等.山奈酚治療去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的實驗研究[J].中國新藥雜志，2014，23（24）：2925-2929，2932.

[19] ZHAO J，WU J，XU B，et al.Kaempferol promotes bone formation in part via the mTOR signaling pathway[J].Mol Med Rep，2019，20（6）：5197-5207.

[20] NISHIDE Y，TOUSEN Y，TADAISHI M，et al.Combined effects of soy isoflavones and β-carotene on osteoblast differentiation[J].Int J Environ Res Public Health，2015，12（11）：13750-13761.

[21] JING Z，WANG C，YANG Q，et al.Luteolin attenuates glucocorticoid-induced osteoporosis by regulating ERK/Lrp-5/GSK-3β signaling pathway in vivo and in vitro[J].J Cell Physiol，2019，234（4）：4472-4490.

[22] WANG Y，DAI J，ZHU Y，et al.Paeoniflorin regulates osteoclastogenesis and osteoblastogenesis via manipulating NF-κB signaling pathway both in vitro and in vivo[J].Oncotarget，2018，9（7）：7372-7388.

收稿日期：2020-02-29;修回日期：2020-04-16