三七根際土壤中皂苷類自毒物質(zhì)降解拮抗細(xì)菌的分離篩選

王羅濤 楊冬英 鄧琳梅 李怡文 馬云云 韓光煜 黃惠川 朱書生 楊敏

摘要：【目的】篩選出既可降解三七皂苷類自毒物質(zhì)又能拮抗三七銹腐病菌的細(xì)菌菌株，為防治三七病害及克服連作障礙提供生防資源?！痉椒ā坷眠B續(xù)稀釋法從健康三七根際土壤中分離可培養(yǎng)細(xì)菌，測定細(xì)菌菌株在以粗皂苷為唯一碳源培養(yǎng)基上的生長情況，以對(duì)峙培養(yǎng)法測定細(xì)菌菌株對(duì)三七銹腐病菌毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）RS006的拮抗活性;結(jié)合16S rDNA測序和形態(tài)學(xué)特征對(duì)活性菌株進(jìn)行分類鑒定，并通過HPLC測定活性菌株在不同時(shí)間內(nèi)對(duì)主要皂苷類自毒物質(zhì)（R1、Rg1、Re、Rb1和Rd）的降解能力?！窘Y(jié)果】從三七根際土壤中分離獲得91株細(xì)菌分離物，其中17株分離物能在以粗皂苷為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長、14株分離物對(duì)菌株RS006具有拮抗活性;菌株41既能以三七粗皂為唯一碳源生長，又對(duì)菌株RS006具有較強(qiáng)抑制活性。綜合菌株41的形態(tài)特征和16S rDNA分子鑒定結(jié)果，將菌株41鑒定為蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii），編號(hào)為PM-41。菌株P(guān)M-41對(duì)三七主要皂苷類自毒物質(zhì)R1、Rg1、Re、Rb1和Rd均存在較明顯的降解效果?！窘Y(jié)論】蒙氏假單胞菌PM-41既能拮抗毀滅柱孢菌又能有效降解三七皂苷類自毒物質(zhì)，具有防治三七銹腐病和緩解三七連作障礙的生防潛力。

關(guān)鍵詞： 三七;連作障礙;自毒作用;銹腐病菌;微生物降解

中圖分類號(hào)： S435.672? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）02-0305-08

Isolation and screening of antagonistic autotoxin-degrading bacteria in Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen rhizosphere soil

WANG Luo-tao， YANG Dong-ying， DENG Lin-mei， LI Yi-wen， MA Yun-yun，

HAN Guang-yu， HUANG Hui-chuan， ZHU Shu-sheng， YANG Min*

（Key Laboratory of Agriculture Biodiversity for Plant Disease Management of Ministry of Education， Yunnan Agricultural University/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-Resources in Yunnan， Kunming? 650201， China）

Abstract：【Objective】Isolation and screening of antagonistic saponin-degrading and rust rot resistant bacteria in the rhizosphere soil of Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen were conducted， laying foundation for developing new technology to control P. notoginseng diseases and alleviate P. notoginseng replant failure. 【Method】The bacterial strains were isolated from healthy P. notoginseng rhizosphere soil by the serial dilution method， the ability of bacterial isolates to use crude saponins as sole carbon source was tested， and their inhibition activity against Cylindrocarpon destructans RS006 was also determined by confrontation culture. The antagonistic isolate were further identified by 16s rDNA sequencing and morphology characters，the ability to degrade the main five autotoxic saponins（R1，Rg1，Re，Rb1 and Rd） after inocula-ting at different time points were evaluated using HPLC. 【Result】A total of 91 bacterial strains were isolated from P. notoginseng rhizosphere soil， among them 17 isolates were able to grow on the medium with crude saponin as the sole carbon source， and 14 isolates showed strong antifungal activity against strain RS006. Strain 41 could grow with crude saponins as sole carbon source， and had strong antifungal activity against strain RS006. According to the morphological chara-cteristics and 16S rDNA molecular identification results， the antagonistic strain No.41 was identified as Pseudomonas monteilii（PM-41）. Strain PM-41 had obvious degradation on the five autotoxic saponins（R1，Rg1，Re，Rb1 and Rd）. 【Conclusion】P. monteilii PM-41 has antagonistic activity on C. destructans and efficient degradation ability on autotoxic saponins. It has the potential prospect in controlling P. notoginseng root rot and alleviating P. notoginseng replant failure.

Key words： Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen; replant failure; autotoxicity; Cylindrocarpon destructans; microbial degradation

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31772404，31660605）; National Key Research and Development Program（2017YFD0201601）; Yunnan Universities and Colleges Innovation Team Support Plan（IRTSTYN）

0 引言

【研究意義】三七[Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen]為五加科人參屬多年生藥用植物，是我國的名貴中藥材，主要分布于云南省文山州和廣西百色地區(qū)（繆作清等，2006）。三七生長性喜溫暖陰濕，栽培年限長，種植過程中存在嚴(yán)重的連作障礙。Yang等（2015）研究表明，三七根系分泌的皂苷類化合物是造成三七連作障礙的重要誘因。目前，生產(chǎn)中主要通過施用化學(xué)農(nóng)藥、輪作倒茬等措施緩解三七連作障礙，但農(nóng)藥的大量使用不但未能明顯減輕連作障礙，而且?guī)韲?yán)重的農(nóng)藥殘留和重金屬超標(biāo)等藥品安全問題;同時(shí)，三七輪作期限一般需要10年以上（郭宏波等，2017）。因此，以綠色健康的防治手段緩解三七連作障礙對(duì)三七產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】化感自毒是造成作物連作障礙的主要原因之一（Singh et al.， 1999）。游佩進(jìn)（2009）通過比較三七土壤水提液和根部化合物，利用HPLC-MS分離鑒定出相同化合物人參皂苷Rh1，發(fā)現(xiàn)Rh1在較低濃度下對(duì)三七幼苗生長表現(xiàn)顯著的抑制效果;張金燕等（2017）研究發(fā)現(xiàn)三七土壤水提液對(duì)三七種子的萌發(fā)和幼苗生長有抑制作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，三七皂苷類化合物人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1對(duì)三七幼苗萌發(fā)和生長產(chǎn)生不同程度的抑制（拱健婷等，2015）;一方面三七根系分泌的皂苷類自毒物質(zhì)（皂苷R1、Rg1、Re、Rg2和Rd）對(duì)三七根部細(xì)胞產(chǎn)生明顯的損害（Yang et al.， 2015，2018），另一方面，三七皂苷提取物能明顯促進(jìn)三七根腐病菌茄腐鐮刀菌、銹腐病菌和惡疫霉菌的生長（楊敏等，2014）。根際微生物與植物生長有著密切的關(guān)系。微生物作為植物的第二基因組，植物對(duì)根際微生物的影響主要是通過根系分泌物來實(shí)現(xiàn)（Etalo et al.， 2018）。根系分泌的小分子化合物（糖、氨基酸、有機(jī)酸、酚類及其他次生代謝產(chǎn)物）和大分子的蛋白和黏液等既能提供微生物生長所需的養(yǎng)分，又能作為信號(hào)來激活或募集微生物（Zhalnina et al.， 2018）。植物能通過募集有益微生物幫助自身抵御外界生物（病原菌的侵染、植食昆蟲的取食）和非生物（溫度、水分和鹽分等）脅迫（Chaparro et al.，2014）。植物根際土壤作為植物的一個(gè)有益菌庫，一直是國內(nèi)外研究植物—微生物互作的研究熱點(diǎn)。王志春和孫星星（2018）從番茄根際土壤中分離到一株對(duì)番茄枯萎病菌具有較強(qiáng)活性的拮抗細(xì)菌，通過菌液澆灌的方式驗(yàn)證其對(duì)番茄枯萎病和根腐病具有良好的防治效果。導(dǎo)致植物化感自毒的次生代謝產(chǎn)物主要有酚類化合物、萜類化合物和含氮有機(jī)物等，采用常規(guī)的物理化學(xué)方式處理很難獲得明顯的效果，且容易產(chǎn)生二次污染，因此微生物作為綠色高效的處理方式受到越來越多學(xué)者的關(guān)注（張曉玲等，2007）。趙東岳等（2013）從人參根際分離到5株具有高效降解人參自毒物質(zhì)苯甲酸、鄰苯二甲酸二異丁酯、丁二酸二異丁酯、棕櫚酸和2，2-（4-羥基苯基）丙烷的細(xì)菌。祁國振等（2016）通過分離蘋果根際土壤得到5株具有降解蘋果自毒物質(zhì)根皮苷、鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸和焦性沒食子酸的高效降解細(xì)菌，為緩解蘋果化感自毒作用提供了新思路。何志剛等（2017）從番茄根部分離到3株降解番茄自毒物質(zhì)苯甲酸的細(xì)菌，并通過菌劑添加方式驗(yàn)證了微生物菌劑緩解自毒物質(zhì)對(duì)番茄幼苗的抑制。【本研究切入點(diǎn)】已有研究表明根際微生物能降解植物分泌的自毒物質(zhì)，從而緩解植物化感作用。但三七在生長過程中是否會(huì)募集有益微生物來降解代謝其分泌到根際的皂苷類自毒物質(zhì)至今未見相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用連續(xù)稀釋法從健康三七根際土壤中分離可培養(yǎng)細(xì)菌菌株，進(jìn)而測定細(xì)菌菌株在以粗皂苷為唯一碳源培養(yǎng)基的生長情況，并利用對(duì)峙培養(yǎng)法測定其對(duì)三七銹腐病菌的拮抗活性，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)活性菌株進(jìn)行16S rDNA分類鑒定，借助HPLC評(píng)價(jià)接種活性菌株后不同時(shí)間對(duì)主要皂苷類自毒物質(zhì)的降解能力，以期從三七根際土壤中分離到既可降解三七皂苷類自毒物質(zhì)又能拮抗三七銹腐病菌的細(xì)菌菌株，為防治三七病害及克服三七連作障礙提供生防資源。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基（蛋白胨10.00 g、牛肉浸粉3.00 g、氯化鈉5.00 g、瓊脂粉15.00 g，蒸餾水定容至1000.0 mL）;粗皂苷培養(yǎng)基（硝酸鈉3.00 g、磷酸氫二鉀1.00 g、七水合硫酸鎂0.50 g、氯化鉀0.50 g、硫酸亞鐵0.01 g、三七粗皂苷10.00 g、瓊脂粉15.00 g，蒸餾水定容至1000.0 mL，pH 7.2±0.2）;LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10.00 g、酵母提取物5.00 g、氯化鈉5.00 g，蒸餾水定容至1000.0 mL）。

供試土壤：取健康三七植株，抖落根圍土壤，用無菌毛刷輕刷三七根系收集土壤，即為三七根際土壤。

供試菌株：三七銹腐病菌毀滅柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）RS006由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病害控制實(shí)驗(yàn)室從感病三七根部分離獲得，并通過形態(tài)學(xué)鑒定和致病性測定。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 三七根際細(xì)菌分離及純化 采用連續(xù)稀釋法分離健康三七根際土壤樣品中的細(xì)菌菌株。稱取健康三七根際土樣1 g分別置于15 mL的離心管中，加入9.0 mL無菌水，置搖床上振蕩（180 r/min）20 min，得到土壤菌懸液，靜置后將土壤菌懸液用無菌水梯度稀釋成10-2、10-3和10-4，分別取100 ?L均勻涂布在NA培養(yǎng)基表面，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d。待菌落長出后，挑取顏色、形狀差異明顯的菌落，用無菌牙簽在NA培養(yǎng)基上劃線，反復(fù)劃線直至得到細(xì)菌單菌落。

1. 2. 2 三七粗皂苷提取 按Yang等（2015）的方法將自然風(fēng)干的3年生三七塊根，用打粉機(jī)研磨成粉，取20 g三七粉末分別置于50 mL離心管中，用10.0 mL 80%甲醇超聲（30 ℃）提取40 min后離心（4 ℃，12000 r/min，5 min），收集上清液，下層粉末再重復(fù)提取2次，離心后合并3次上清液，將所有上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)（40 ℃），待甲醇蒸發(fā)完后收集剩余液體，冷凍干燥48 h后收集三七粗皂苷固體粉末，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 篩選以三七粗皂苷為唯一碳源生長的細(xì)菌 將上述分離純化的細(xì)菌，采用平板劃線法在以粗皂苷為唯一碳源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。劃線后的培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，2～5 d后觀察粗皂苷培養(yǎng)基上菌株的生長情況，每株菌株設(shè)4個(gè)重復(fù)。

1. 2. 4 篩選對(duì)三七銹腐病菌有拮抗活性的細(xì)菌

采用平板對(duì)峙法測定細(xì)菌分離物對(duì)毀滅柱孢菌RS006的拮抗活性。用直徑為5 mm的打孔器在預(yù)先培養(yǎng)好的菌株RS006菌落邊緣打取菌餅，并放置在PDA培養(yǎng)基中央，在距菌餅2.5 cm的4個(gè)點(diǎn)上分別用無菌牙簽接種不同細(xì)菌分離物，以只接種菌株RS006的培養(yǎng)基為對(duì)照，每株菌株設(shè)4個(gè)重復(fù)。接種好的培養(yǎng)基置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，6～7 d后測量對(duì)照組和處理組病原菌菌落半徑，計(jì)算菌絲抑制率。

抑制率（%）=（對(duì)照菌落半徑-處理菌落半徑）/

對(duì)照菌落半徑×100

1. 2. 5 菌株鑒定 對(duì)篩選獲得的既能以皂苷為唯一碳源生長又對(duì)菌株RS006具有拮抗活性的細(xì)菌菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和16S rDNA鑒定。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）對(duì)菌株進(jìn)行菌落、菌體形態(tài)觀察;分子鑒定采用試劑盒OMEGA Bacterial DNA Kit提取細(xì)菌基因組DNA，采用細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系50.0 μL：27F（10 μmol/L）和1492R（10 μmol/L）各2.0 μL，25.0 μL 2×PCR Taq MasterMix，DNA模板2.0 μL，19.0 μL無菌去離子水。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 40 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送昆明碩擎公司測序，測得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，選取相似度高的種屬確定供試細(xì)菌分離物的分類地位。在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載相近序列，利用MAGA 7.0進(jìn)行序列系統(tǒng)發(fā)育分析，利用Neighbor-joining算法和Jukes-Cantor模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 2. 6 HPLC分析活性菌株降解三七皂苷類自毒物質(zhì)的能力 參照趙東岳等（2013）的方法對(duì)篩選獲得的活性菌株進(jìn)行降解能力測定。用接種環(huán)挑取純化好的單一菌株，接種到50.0 mL的NA液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、150 r/min的搖床上培養(yǎng)過夜;取100 μL菌液加入到200.0 mL以三七粗皂苷為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中（三七粗皂苷1 g/L），以不加入菌液的處理作為空白對(duì)照，置于搖床上振蕩培養(yǎng)（28 ℃，150 r/min），每處理設(shè)3次重復(fù)，培養(yǎng)96、144和192 h時(shí)分別取樣測定。

從每瓶搖培菌液中取100.0 mL液體加入等體積甲醇，搖勻，20 ℃超聲20 min，靜置5 min后取200.0 mL混合液用0.22 μm的微孔濾膜真空抽濾，將抽濾好的溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至甲醇蒸發(fā)干;取20.0 mL溶液放入-20 ℃冰箱冷凍過夜，再放入冷凍干燥機(jī)中干燥48 h。待溶液干燥后，加入20.0 mL 70%色譜甲醇超聲溶解，充分搖勻后取10.0 mL溶液到15 mL離心管中離心（4 ℃，9000 r/min，5 min），取澄清液1.5 mL用0.22 ?m的尼龍濾膜過濾3次，濾液置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用HPLC檢測不同處理中主要皂苷物質(zhì)（R1、Rg1、Re、Rb1和Rd）的含量，并計(jì)算接菌處理中主要皂苷類自毒物質(zhì)的降解率。HPLC檢測條件：色譜柱（4.6 mm×150.0 mm，4 ?m，Agilent Poroshell 120 EC-C18）;流動(dòng)相A：乙腈;流動(dòng)相B：水;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測波長203 nm;進(jìn)樣體積10 ?L。洗脫梯度：0～20 min，82% B;20～40 min，82%～57% B;40～48 min，57%～45% B;48～54 min，45% B;54～56 min，45%～5% B;56～71 min，5% B;71～72 min，5%～82% B;72～74 min，82% B。在此條件下，可實(shí)現(xiàn)5種主要皂苷達(dá)到基線分離。

降解率（%）=（未接菌培養(yǎng)液的皂苷含量-接菌

培養(yǎng)液皂苷含量）/未接菌培養(yǎng)液

的皂苷含量×100

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，運(yùn)用SPSS 19.0中的Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 三七根際土壤細(xì)菌分離結(jié)果

從NA培養(yǎng)基上挑選顏色或形態(tài)特征具有差異的微生物，經(jīng)劃線純化后獲得細(xì)菌分離物91株。將91株細(xì)菌分離物保存于LB-甘油中（甘油終濃度40%），置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2. 2 三七粗皂苷降解細(xì)菌篩選結(jié)果

由表1可知，91株細(xì)菌分離物中有17株能以三七粗皂苷為唯一碳源生長，分別是菌株1、3、21、41、42、43、50、51、52、53、54、57、58、63、64、70和71，其余74株細(xì)菌不能利用三七粗皂苷生長。由此可見，三七根際細(xì)菌中大多數(shù)細(xì)菌不能利用三七皂苷為唯一碳源生長，僅有少數(shù)細(xì)菌可能具有降解三七皂苷類自毒物質(zhì)的能力。

2. 3 對(duì)三七銹腐病菌具有拮抗活性菌株篩選結(jié)果

平板對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，對(duì)菌株RS006具有抑制作用的菌株有14株，其中抑制率大于50.00%的有4株，分別為菌株17、24、36和46;大多數(shù)菌株對(duì)菌株RS006的抑制率在30.00%～40.00%，包括菌株32、41、42、49、53、65、81和91;菌株18和70的抑制率在20.00%～30.00%。

2. 4 拮抗菌株鑒定結(jié)果

由表1和表2可看出，菌株41既能以三七粗皂為唯一碳源生長，又對(duì)菌株RS006具有較強(qiáng)的抑制活性，因此進(jìn)一步對(duì)菌株41進(jìn)行形態(tài)觀察和16S rDNA分子鑒定。

菌落形態(tài)觀察結(jié)果（圖1-A）顯示，菌株41在NA培養(yǎng)基上生長48 h后形成白色圓形小菌落，菌落表面光滑隆起，邊緣不規(guī)則，不透明;由革蘭氏染色結(jié)果（圖1-B）可知，菌株41革蘭氏染色呈陰性，菌體呈短桿狀，無芽孢。

將菌株41得到的序列輸入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示，菌株41與蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）相似性最高，為98.35%，GenBank登錄號(hào)G0V375SV014。利用MEGA7.0構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖2）顯示，菌株41與蒙氏假單胞菌CIP 104883（登錄號(hào)NR 024910.1）位于同一分支，說明二者的親緣關(guān)系最近，且與假單胞菌屬的其他種能明顯分開。綜合菌株41的形態(tài)特征和16S rDNA分子鑒定結(jié)果，將菌株41鑒定為蒙氏假單胞菌，將其編號(hào)為PM-41。

2. 5 HPLC檢測蒙氏假單胞菌PM-41對(duì)皂苷類自毒物質(zhì)的降解能力

由表3可知，菌株P(guān)M-41對(duì)三七粗皂苷中5種主要皂苷類自毒物質(zhì)R1、Rg1、Re、Rb1和Rd均具有較強(qiáng)的降解活性，隨著接種時(shí)間的延長，皂苷R1在4個(gè)時(shí)期的濃度均存在顯著差異（P<0.05，下同）;皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd在接種0 h與接種96 h間差異不顯著（P>0.05，下同），但濃度有所降低，而在接種144和192 h后，4種皂苷的濃度顯著降低（皂苷Rd在接種144和192 h后濃度低于96 h時(shí)的濃度，但差異不顯著）。結(jié)合降解率分析可知，5種皂苷在接種菌株P(guān)M-41 96～144 h出現(xiàn)明顯降解，可推斷這5種皂苷的主要降解時(shí)間為96～144 h。在培養(yǎng)后期（144～192 h），皂苷Rb1和皂苷Rg1的降解率趨于平緩;皂苷Re和皂苷Rd的降解率仍表現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，可能還存在降解;而皂苷R1濃度出現(xiàn)先降低后升高的趨勢，可能與皂苷之間的轉(zhuǎn)化有關(guān)（許歡等，2017）。

3 討論

本研究從健康三七根際土壤中分離到91株細(xì)菌，并從中篩選獲得一株既能在以三七皂苷為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，又對(duì)毀滅柱孢菌具有明顯拮抗活性的蒙氏假單胞菌菌株P(guān)M-41，HPLC測定結(jié)果顯示菌株P(guān)M-41對(duì)5種主要三七自毒皂苷類化合物R1、Rg1、Re、Rb1和Rd均具有較好的降解效果，為緩解三七連作障礙提供了新思路。

通過微生物降解環(huán)境中的有毒物質(zhì)，已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。環(huán)境科學(xué)中，通過微生物降解土壤中的苯酚、DDT和多環(huán)芳烴類化合物已得到廣泛應(yīng)用（賀強(qiáng)禮等，2016;馮玉雪等，2018）。以生物降解的方式進(jìn)行有害物質(zhì)降解，一方面可避免物理化學(xué)處理過程中可能存在的二次污染問題，另一方面，微生物降解效率比常規(guī)方法高，而且更環(huán)保（周開勝，2017）。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，已有研究顯示，微生物能有效降解植物通過根系分泌到根際土壤中的自毒物質(zhì)，如苯甲酸、根皮苷、鄰苯二甲酸二異丁酯、丁二酸二異丁酯、棕櫚酸和2，2-（4-羥基苯基）丙烷等（黃園勇等，2013;趙東岳等，2013;劉紫英等，2018;聶園軍等，2018）。

假單胞菌屬（Pseudomonas）作為土壤及植物中廣泛存在的生防菌，在幫助植物抗病、促生，聯(lián)合固氮解鉀，降解植株內(nèi)的農(nóng)藥殘留和抵御重金屬脅迫等方面均具有顯著的效果（張暉等，2015;劉丹丹等，2016;張春花等，2017;代志和高俊明，2018）。袁蓮蓮等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，利用蒙氏假單胞菌對(duì)受TMV污染的煙草幼苗進(jìn)行生物鈍化，表現(xiàn)出明顯的效果;此外，蒙氏假單胞菌對(duì)煙草產(chǎn)生的煙堿也有明顯降解效果（李陽等，2015）。蒙氏假單胞菌作為五味子中的內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)人參銹腐菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗效果（徐麗等，2009）。

土壤環(huán)境復(fù)雜多變，土壤微生物多樣性豐富，再加之土壤微生物間復(fù)雜的相互作用組成了土壤環(huán)境復(fù)雜的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。已有研究表明，單一的微生物添加難以在復(fù)雜的土壤環(huán)境中定殖生存（Xu et al.， 2019）。微生物的相互作用關(guān)系復(fù)雜多樣，且微生物間存在代謝物相互利用的情況（Berendsen et al.， 2018）。因此，嘗試以多種微生物組合的形式添加到土壤中（Duran et al.， 2018），形成穩(wěn)定的微生物菌群，更能有效發(fā)揮有益微生物的作用。本研究后續(xù)將從菌群構(gòu)建的角度出發(fā)，以分離到的降解細(xì)菌為出發(fā)點(diǎn)，篩選出更多的高效降解微生物，并通過菌群組合的方式，提高微生物菌群的降解能力，進(jìn)一步緩解三七的連作障礙。

4 結(jié)論

從三七根際土壤分離獲得的蒙氏假單孢菌菌株P(guān)M-41既能有效降解三七皂苷類自毒物質(zhì)，對(duì)引起三七根腐的毀滅柱孢菌也具有較強(qiáng)抑制活性，具有防治三七銹腐病和緩解三七連作障礙的生防潛力。

參考文獻(xiàn)：

代志，高俊明. 2018. 兼具解磷解鉀功能生防菌分離鑒定及效果評(píng)價(jià)[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，46（4）;627-633. [Dai Z，Gao J M. 2018. Isolation， identification and effect evaluation of bio-control bacteria with phosphorus and potassium dissolving function[J]. Journal of Shanxi Agricultural Scien-ce，46（4）：627-633.]

東秀珠， 蔡妙英. 2001. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社. [Dong X Z，Cai M Y. 2001. Manual of systema-tic identification on common bacteria[M]. Beijing：Science Press.]

馮玉雪，毛縝，呂蒙蒙.? 2018. 一株DDT降解菌的篩選及其降解特性[J].中國環(huán)境科學(xué)，38（5）：1935-1942. [Feng Y X，Mao Z，Lü M M. 2018. Screening and degradation characteristics of a DDT-degrading bacteria[J]. China Environmental Science，38（5）：1935-1942.]

拱健婷，程新宇，孫萌，吳立潔，張子龍. 2015. 3種皂苷單體對(duì)三七種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，37（6）：988-993. [Gong J T，Cheng X Y，Sun M，Wu L J，Zhang Z L. 2015. Effects of three kind of saponins on seed germination and seedling growth of Panax notoginseng[J]. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis，37（6）：988-993.]

郭宏波，張躍進(jìn)，梁宗鎖，夏鵬國. 2017. 水旱輪作減輕三七連作障礙的潛勢分析[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），32（1）：161-169. [Guo H B， Zhang Y J， Liang Z S， Xia P G. 2017. The potential of alternative water logged and dryland conditions to relieve the continuous cropping obstacle of Panax notoginseng[J]. Journal of Yunnan Agricultural University（Natural Science），32（1）：161-169.]

何志剛，婁春榮，王秀娟，董環(huán)，趙穎. 2017. 番茄自毒物質(zhì)降解菌的篩選及其降解效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，45（5）：114-116. [He Z G， Lou C R， Wang X J， Dong H， Zhao Y. 2017. Screening and degradation effect of tomato autotoxic compounds-degrading bacteria[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，45（5）：114-116.]

賀強(qiáng)禮，劉文斌，楊海君，彭曉霞，關(guān)向杰，黃水娥. 2016. 一株苯酚降解菌的篩選鑒定及響應(yīng)面法優(yōu)化其降解[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，36（1）：112-123. [He Q L，Liu W B，Yang H J，Peng X X，Guan X J，Huang S E. 2016. Isolation，identification of a phenol-degradaing strain and optimization for phenol degradation using response surface metho-dology[J]. Acta Scientiae Circumstantiae，36（1）：112-123.]

黃園勇，周光明，尹國通，鞏云霏，張衛(wèi)衛(wèi)，劉愛華，袁麗杰. 2013. 植物根際放線菌分離方法初探及根皮苷降解活性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，44（1）：54-58. [Huang Y Y，Zhou G M，Yin G T，Gong Y F，Zhang W W，Liu A H，Yuan L J. 2013. Rhizosphere actinomycete isolation methods and phloridzin degradation activity analysis in plants[J]. Journal of Southern Agriculture，44（1）：54-58.]

李陽，楊振飛，馬婷婷，陳濤，龔傳清，李永輝，李曉華. 2015. 煙堿降解菌SCUEC2菌株的分離及其降解特性[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，54（7）：1586-1589. [Li Y，Yang Z F，Ma T T，Chen T，Gong C Q，Li Y H，Li X H. 2015. Isolation and degradation characteristics of a nicotine-degradation bacterium SCUEC2 strain[J]. Hubei Agricultural Sciences，54（7）：1586-1589.]

劉丹丹，李敏，劉潤進(jìn). 2016. 我國植物根圍促生細(xì)菌研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，35（3）：815-824. [Liu D D，Li M，Liu R J. 2016. Recent advances in the study of plant growth-promoting rhizobacteria in China[J]. Chinese Journal of Ecology，35（3）：815-824.]

劉紫英，黃磊，袁斌，劉小林，徐勝光，黃濤. 2018. 一株草莓連作自毒障礙主要物質(zhì)苯甲酸降解細(xì)菌的篩選及其降解效果研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，30（10）：1699-1704. [Liu Z Y，Huang L，Yuan B，Liu X L，Xu S G，Huang T. 2018. Study on screening degrading bacteria and its degradation effect on benzoic acid of autotoxic compounds in strawberry cropping obstacle[J]. Acta Agriculturae Zhe-jiangensis，30（10）：1699-1704.]

繆作清，李世東，劉杏忠，陳昱君，李云華，王勇，郭榮君，夏振遠(yuǎn)，張克勤. 2006. 三七根腐病病原研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，39（7）：1371-1378. [Liao Z Q，Li S D，Liu X Z，Chen Y J，Li Y H，Wang Y，Guo R J，Xia Z Y，Zhang K Q. 2006. The causal microorganisms of Panax notoginseng root rot disease[J]. Scientia Agricultura Sinica，39（7）：1371-1378.]

聶園軍，楊三維，趙佳，肖蓉，王媛，薄曉峰. 2018. 不同土壤處理方式對(duì)連作黃瓜生長的影響[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，46（12）：2018-2022. [Nie Y J，Yang S W，Zhao J，Xiao R，Wang Y，Bo X F. 2018. Effects of different soil treatments on continuous cropping cucumber growth[J]. Journal of Shanxi Agricultural Science，46（12）：2018-2022.]

祁國振，毛志泉，胡秀娜，杜秉海，葛科，楊倩倩，丁延芹. 2016. 蘋果根際自毒物質(zhì)降解菌的篩選鑒定及降解特性研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，43（2）：330-342. [Qi G Z，Mao Z Q，Hu X N，Du B H，Ge K，Yang Q Q，Ding Y Q. 2016. Isolation， identification and degradation characteristics of apple rhizosphere autotoxicitic compounds-degrading bacteria[J]. Microbiology China，43（2）：330-342.]

王志春，孫星星. 2018. 防治番茄土傳病害拮抗微生物的篩選與應(yīng)用效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，46（3）：86-88. [Wang Z C，Sun X X. 2018. Screening and application effect of antagonistic microorganisms against soil-borne tomato di-sease[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，46（3）：86-88.]

徐麗，嚴(yán)雪瑞，傅俊范，周如軍. 2009. 五味子內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定[J]. 植物保護(hù)，35（3）：47-50. [Xu L，Yan X R，F(xiàn)u J F，Zhou R J. 2009. Screening and identification of endophytic bacteria of Schisandra chinensis[J]. Plant Protection，35（3）： 47-50.]

許歡，李淵源，王菲，張麗，朱蓓，楊新杰，宋小妹. 2017. 珠子參皂苷類成分酸性條件下的熱轉(zhuǎn)化機(jī)制研究[J]. 西北藥學(xué)雜志， 32（5）：559-562. [Xu H，Li Y Y，Wang F，Zhang L，Zhu B，Yang X Y，Song X M. 2017. Study on the thermal conversion mechanism of saponins in Panacis majoris rhizoma under acidic condition[J]. Northwest Pharmaceutical Journal，32（5）：559-562.]

楊敏，梅馨月，鄭建芬，尹兆波，趙芝，張瀟丹，何霞紅，朱書生. 2014. 三七主要病原菌對(duì)皂苷的敏感性分析[J]. 植物保護(hù)，40（3）：76-81. [Yang M，Mei X Y，Zheng J F，Yin Z B，Zhao Z，Zhang X D，He X H，Zhu S S. 2014. Sensitivity of the pathogens of Panax notoginseng to ginsenosides[J]. Plant Protection，40（3）：76-81.]

游佩進(jìn). 2009. 連作三七土壤中自毒物質(zhì)的研究[D]. 北京：北京中醫(yī)藥大學(xué). [You P J. 2009. Study on autotoxicants in soil of Panax notoginseng after continuous cropping[D]. Beijing：Beijing University of Chinese Medicine.]

袁蓮蓮，王耀鋒，劉相甫，靳志偉，張靜，李偉，董石飛，趙存孝，黃明迪，王鳳龍，楊金廣. 2017. 蒙氏假單胞菌3A菌株對(duì)煙草漂浮育苗中TMV的鈍化效果[J]. 植物保護(hù)，43（2）：37-42. [Yuan L L，Wang Y F，Liu X F，Jin Z W，Zhang J，Li W，Dong S F，Zhao C X，Huang M D，Wang F L，Yang J G. 2017. Passivation effect of Pseudomonas monteilii 3A on tobacco mosaic virus in tobacco float seedlings[J]. Plant Protection，43（2）：37-42.]

張春花，單治國，蔣智林，王超，楊應(yīng)明，羅華元，饒智，滿紅平，成文章. 2017. 4種微生物對(duì)烤煙中代森錳鋅農(nóng)藥殘留及降解動(dòng)態(tài)的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，45（4）：79-84.[Zhang C H，Shan Z G，Jiang Z L，Wang C，Yang Y M，Luo H Y，Rao Z，Man H P，Cheng W Z. 2017. Pesticide residues and degradation dynamics of mancozeb in tobacco treated with four kinds of microbes[J]. Guizhou Agricultural Sciences，45（4）：79-84.]

張暉，宋圓圓，呂順，郭婧婧，曾任森. 2015. 香蕉根際促生菌的抑菌活性及對(duì)作物生長的促進(jìn)作用[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，36（3）：65-70. [Zhang H，Song Y Y，Lü S，Guo J J，Zeng R S. 2015. The antifungal activity and crop growth stimulation of growth-promoting rhizobacteria from banana rhizosphere soil[J]. Journal of South China Agricultural University， 36（3）： 65-70.]

張金燕，孫雪婷，陳軍文，張廣輝，孟珍貴，李龍根，楊生超，龍光強(qiáng). 2017. 連作三七根際土壤化感物質(zhì)檢測及其提取液對(duì)三種作物種子萌發(fā)的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，48（7）： 1178-1184. [Zhang J Y，Sun X T，Chen J W，Zhang G H，Meng Z G，Li L G，Yang S C，Long G Q. 2017. Allelochemical detection from rhizosphere soil of continuous cropping Panax notoginseng and effects of the extracts on seed germination of three crops[J]. Journal of Southern Agriculture， 48（7）：1178-1184.]

張曉玲，潘振剛，周曉鋒，倪吾鐘. 2007. 自毒作用與連作障礙[J]. 土壤通報(bào)，38（4）：781-784. [Zhang X L，Pan Z G，Zhou X F，Ni W Z. 2007. Autotoxicity and continuous cropping obstacles： A review[J]. Chinese Journal of Soil Science，38（4）：781-784.]

趙東岳，李勇，丁萬隆. 2013. 人參自毒物質(zhì)降解細(xì)菌的篩選及其降解特性研究[J]. 中國中藥雜志，38（11）：1703-1706. [Zhao D Y，Li Y，Ding W L. 2013. Isolation and characteristics of Panax ginseng autotoxin-degrading bacterial strains[J]. China Journal of Chinese Materia Medica，38（11）： 1703-1706.]

周開勝. 2017. 強(qiáng)還原處理改良西瓜連作土壤[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，29（6）：982-987. [Zhou K S. 2017. Improving qua-lity of watermelon continuous cropping soil by reductive soil disinfestation[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis，29（6）： 982-987.]

Berendsen L R，Vismans G，Yu K，Song Y，Jonge D R，Burgman W P，Burmolle M，Herschend J，Bakker A H M P. 2018. Disease-induced assemblage of a plant-beneficial bacterial consortium[J]. The ISME Journal，12（6）：1496-1507.

Chaparro J M，Badri D V，Vivanco J M. 2014. Rhizosphere microbiome assemblage is affected by plant development[J]. The ISME Journal，8（4）：790-803.

Duran P，Thiergart T，Garrido-Oter R，Agler M，Kemen E，Schulze-Lefert P，Hacquard S. 2018. Microbial interkingdom interactions in roots promote Arabidopsis survival[J]. Cell，175（4）：973-983.

Etalo D W，Jeon J S，Raaijmakers J M. 2018. Modulation of plant chemistry by beneficial root microbiota[J]. Nature Product Report，35（5）：398-409.

Singh H P，Batish D R，Kohli R K. 1999. Autotoxicity： Concept， organisms， and ecological significance[J].Critical Reviews in Plant Science，18（6）：757-772.

Xu X，Zarecki R，Medina S，Ofaim S，Liu X，Chen C，Hu S L，Brom D，Gat D，Porob S，Eizenberg H，Ronen Z，Jiang J D，F(xiàn)reilich S. 2019. Modeling microbial communities from atrazine contaminated soils promotes the development of biostimulation solutions[J]. The ISME Journal，13（2）：494-508.

Yang M，Chuan Y C ，Guo C W，Liao J J，Xu Y G，Mei X Y，Liu Y X，Huang H C，He X H，Zhu S S. 2018. Panax notoginseng root cell death caused by the autotoxic ginsenoside Rg1 is due to over-accumulation of ROS， as revealed by transcriptomic and cellular approaches[J]. Frontiers In Plant Science，9：264.

Yang M，Zhang X D，Xu Y G，Mei X Y，Jiang B B，Liao J J，Yin Z B，Zheng J F，Zhao Z，F(xiàn)an L M，He X H，Zhu S S. 2015. Autotoxic ginsenosides in the rhizosphere contri-bute to the replant failure of Panax notoginseng[J]. PLoS One，10（2）： e0118555.

Zhalnina K，Louie K B，Hao Z，Mansoori N，da Rocha U N，Shi S J，Cho H，Karaoz U，Loque D，Bowen B P，F(xiàn)irestone M K，Northen T R，Brodie E L. 2018. Dynamic root exudate chemistry and microbial substrate preferences drive patterns in rhizosphere microbial community assembly[J]. Nature Microbiology，3（4）：470-480.