牡丹花粉口含片的制備工藝及抗氧化活性

李志，李琳，石曉峰，范彬

(1.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

牡丹(Paeoniasuffrutcosa)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan)多年生落葉灌木，別名鹿韭，鼠姑[1]，是一種重要的觀賞藥用植物.牡丹在我國已有2000 多年的藥用歷史，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，在歷版《中華人民共和國藥典》中均有收載，具有清熱涼血、活血化瘀的功能[2]，其花、籽、根、花粉、葉亦均有很高的食藥價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3].牡丹花粉是牡丹花雄蕊上的孢子，其粗蛋白含量為38.85%，人體必須氨基酸總含量達(dá)130.6 mg/g[4]；含18種脂肪酸，不飽和脂肪酸占脂肪酸總量的50.45%～73.55%[5]；還含有水溶性糖、半纖維素、果膠、維生素、微量元素以及其他天然活性物質(zhì)，包括酶、黃酮類化合物、激素、核酸和有機(jī)酸等[6-8].目前，牡丹花粉已被開發(fā)成口服液[9]，以及作為保健面條、酸奶、啤酒等的原料[10-12]，但迄今未見相關(guān)產(chǎn)品上市，究其原因可能是牡丹花粉尚未列入新食品資源.為了牡丹花粉的開發(fā)利用，本研究在牡丹花粉新食品資源研究申報(bào)的同時(shí)，以破壁的牡丹花粉為原料，采用濕法制粒壓片，通過考察口含片的外觀、口感、硬度、崩解時(shí)限，確定牡丹花粉口含片的最佳處方和制備工藝，并通過測定其模擬體內(nèi)消化產(chǎn)物對DPPH·和ABTS·的清除能力，評價(jià)牡丹花粉口含片的抗氧化能力，以期為牡丹花粉的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器與設(shè)備 LWF6-TBI低溫細(xì)胞壁破壁超微粉粹機(jī)(濟(jì)南龍威制藥設(shè)備有限公司)；YK160 搖擺式顆粒機(jī)(上海天祥健臺(tái)制藥機(jī)械有限公司)；TDP-1.5型單沖壓片機(jī)(上海綠翊機(jī)械制造有限公司)；YD-20KZ片劑硬度儀(天大天發(fā)科技有限公司)；ZB-ID智能崩解儀(天河醫(yī)療儀器有限公司)；AE260 型萬分之一電子天平(瑞士Mettle Toledo公司)；UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);SHZ-82恒溫震蕩器(常州國華電器公司).

1.1.2 材料與試劑 牡丹花粉于2015年5月采自蘭州新區(qū)中川牡丹園，其原植物經(jīng)蘭州牡丹園藝開發(fā)公司趙潛龍高級工程師鑒定為Paeoniarockii(S.G.Haw et L.A.Lauener)T.Hong et J.J.Li.

甘露醇(青島明月海藻集團(tuán)有限公司)；乳糖(鎮(zhèn)江市富康生物工程有限公司)；阿斯巴甜(江蘇漢光甜味劑有限公司)；檸檬酸(西安化學(xué)試劑廠)；硬脂酸鎂(安徽山河藥用輔料有限公司)；DPPH·、ABTS·以及膽酸鈉均購自美國Sigma公司，抗壞血酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；α-淀粉酶(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；胃蛋白酶()；胰蛋白酶(上海中秦化學(xué)試劑有限公司)；95%乙醇(寧波萬隆食用酒精有限公司)；其它試劑均為分析純.

1.2 研究方法

1.2.1 牡丹花粉的破壁

1.2.1.1 破壁率的測定 稱取等量的破壁前后的牡丹花粉，分別加等量蒸餾水使成混懸液，攪拌均勻，制片，在電子顯微鏡下進(jìn)行鏡檢，記錄花粉總數(shù)和完整花粉數(shù)，按公式：破壁率(%)=花粉總數(shù)-完整花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%，計(jì)算牡丹花粉的破壁率.

1.2.1.2 牡丹花粉的破壁工藝 將牡丹花粉均勻鋪在白色瓷盤上面，厚度不超過0.5 cm，蓋上一塊白布，置于日光充足地方曬干或低溫烘干，直至花粉中水分降至5%以下，過120目篩除雜，得到精選的牡丹花粉；然后將其裝入低溫細(xì)胞壁破壁超微粉碎機(jī)料斗中，啟動(dòng)儀器粉碎20～25 min，取出，輻照滅菌，測定其破壁率，即得破壁牡丹花粉成品.

1.2.2 單因素試驗(yàn) 依據(jù)濕法制粒的特點(diǎn)和藥物的性質(zhì)，參考文獻(xiàn)方法[13-15]，選取多種藥用輔料的不同配比進(jìn)行制粒和壓片，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇甘露醇-乳糖為填充劑，阿斯巴甜-檸檬酸為矯味劑，乙醇為潤濕劑，硬脂酸鎂為潤滑劑，以口含片的外觀、口感、硬度、崩解時(shí)限為考察指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)篩選原輔料的配比.

1.2.2.1 評價(jià)指標(biāo) 將6片口含片放置燈光下以肉眼進(jìn)行外觀觀察，根據(jù)口含片表面的光潔程度和色澤給予評分；招募志愿者10名采用雙盲法口嘗，根據(jù)口感酸甜程度給予評分；取6片口含片，利用片劑硬度儀測定硬度，取其平均值，按硬度值的大小范圍給予評分；根據(jù)2015版中國藥典四部通則[0921]項(xiàng)下崩解時(shí)限檢查法，取6片口含片置于吊籃中，調(diào)節(jié)水溫為(37±1) ℃，啟動(dòng)崩解儀并記錄含片完全崩解的時(shí)間，取其平均值，按崩解時(shí)限的大小范圍給予評分.具體指標(biāo)及評分標(biāo)準(zhǔn)見表1.

表1 牡丹花粉口含片的評分標(biāo)準(zhǔn)

每個(gè)指標(biāo)最高分值為9分，總分36分.

1.2.2.2 牡丹花粉口含片的制備 稱取適量過80 目篩的牡丹花粉、甘露醇-乳糖和阿斯巴甜-檸檬酸，花粉+輔料=100%，混合均勻后，加入一定質(zhì)量濃度的乙醇，經(jīng)濕法制軟材，過18目篩，制得顆粒，于50 ℃烘干后，經(jīng)30 目篩整粒，制成干顆粒，加入適量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓片，即得.

1.2.2.3 花粉用量的考察 固定阿斯巴甜-檸檬酸(1∶1)的用量為13%，考察花粉的用量，甘露醇-乳糖(1∶2)的用量隨牡丹花粉用量(34%、30%、26%、22%、18%)的變化而變化，原輔料混合均勻后，按“1.2.2.2”項(xiàng)下操作，以70%乙醇為潤濕劑、1%硬脂酸鎂為潤滑劑，制得牡丹花粉口含片，對其外觀、口感、硬度、崩解時(shí)限進(jìn)行評價(jià).

1.2.2.4 填充劑甘露醇-乳糖比例的考察 固定花粉用量為22%、阿斯巴甜-檸檬酸(1∶1)的用量為13%，對用量為65%的甘露醇-乳糖的配比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)進(jìn)行篩選，原輔料混合均勻后，按“1.2.2.2”項(xiàng)下操作，以70%乙醇為潤濕劑、2%硬脂酸鎂為潤滑劑，制得牡丹花粉口含片，對其外觀、口感、硬度、崩解時(shí)限進(jìn)行評價(jià).

1.2.2.5 矯味劑阿斯巴甜-檸檬酸用量的考察 固定花粉用量22%，考察矯味劑的用量，矯味劑甘露醇-乳糖(1∶2)用量隨阿斯巴甜-檸檬酸(1∶1)的用量(5%、7%、9%、11%、13%)的變化而變化，原輔料混合均勻后，按“1.2.2.2”項(xiàng)下操作，以70%乙醇為潤濕劑、2%硬脂酸鎂為潤滑劑，制得牡丹花粉口含片，對其外觀、口感、硬度、崩解時(shí)限進(jìn)行評價(jià).

1.2.2.6 矯味劑阿斯巴甜-檸檬酸比例的考察 固定花粉用量為22%、甘露醇-乳糖(1∶2)的用量為67%，對用量為11%的阿斯巴甜-檸檬酸的比例(2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)進(jìn)行篩選，原輔料混合均勻后，按“1.2.2.2”項(xiàng)下操作，以70%乙醇為潤濕劑、2%硬脂酸鎂為潤滑劑，制得牡丹花粉口含片，對其外觀、口感、硬度、崩解時(shí)限進(jìn)行評價(jià).

1.2.2.7 潤濕劑乙醇濃度的考察 固定花粉用量為22%、甘露醇-乳糖(1∶2)的用量為67%、阿斯巴甜-檸檬酸(1∶2)的用量為11%，原輔料混合均勻后，加入不同質(zhì)量濃度的乙醇(65%、70%、75%、80%、85%)，經(jīng)濕法制軟材，按“1.2.2.2”操作制得牡丹花粉口含片，對其外觀、口感、硬度、崩解時(shí)限進(jìn)行評價(jià).

1.2.2.8 潤滑劑硬脂酸鎂用量的考察 固定花粉用量為22%、甘露醇-乳糖(1∶2)的用量為67%、阿斯巴甜-檸檬酸(1∶2)的用量為11%，原輔料混合均勻后，加入70%乙醇經(jīng)濕法制軟材，按“1.2.2.2”操作制得干顆粒，加入不同比例(1%、1.5%、2%、2.5%、3%)的硬脂酸鎂，混合均勻，測定休止角，壓片，對其外觀進(jìn)行評價(jià).

1.2.3 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的結(jié)果上，采用正交試驗(yàn)L9(34)設(shè)計(jì)，對影響制劑品質(zhì)的花粉用量、矯味劑比例和影響制粒質(zhì)量的乙醇濃度進(jìn)行優(yōu)選，評價(jià)指標(biāo)參照文獻(xiàn)[16]設(shè)置的“權(quán)重系數(shù)”，按公式：綜合總分=外觀評分×0.2+口感評分×0.3+硬度評分×0.2+崩解時(shí)限評分×0.3進(jìn)行計(jì)算.

1.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按最佳處方配比和工藝制備3批口含片，對其外觀、硬度、崩解時(shí)限和重量差異進(jìn)行評價(jià)，驗(yàn)證工藝的合理性.

1.2.5 牡丹花粉口含片的抗氧化活性試驗(yàn)

1.2.5.1 模擬體內(nèi)消化樣品的制備 模擬唾液的配制[17]：分別稱取0.238 g Na2HPO4、0.019 g KH2PO4以及0.8 g NaCl ，加純凈水溶解，用0.1 mol/L的鹽酸溶液將pH值調(diào)至6.75，加入5 g α-淀粉酶混勻使溶液的酶活力達(dá)到200 U/mL，置于100 mL棕色容量瓶中定容，即得.

表2 因素水平表

模擬胃液的配制[18]：稱取0.2 g NaCl用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解，并用純凈水將pH值調(diào)至1.2，加入0.32 g胃蛋白酶混勻使溶液的酶活力達(dá)到2 000 U/mL，即得.

模擬腸液的配制：稱取1.36 g KH2PO4加純凈水溶解，并用0.1 mol U/mL NaOH溶液將pH值調(diào)至6.8，加入0.05 g胰蛋白酶和2.50 g膽酸鈉混勻，使溶液的酶活力達(dá)到75 U/mL.

1.2.5.2 模擬人體消化的樣品制備[19-20]取牡丹花粉口含片研缽研細(xì)，精密稱定2 g，3 份，置于錐形瓶中，分別加入模擬唾液、模擬胃液和模擬腸液各25 mL，以封口膜封口，置于搖床上，在37 ℃、180 r/min條件下，模擬唾液樣品孵育10 min、模擬胃液和模擬腸液各孵育2 h，然后分別置于沸水浴滅酶10 min，快速冷卻，加入25 mL無水乙醇，離心15 min(4 000 r/min)，取上清液以純凈水定容至50 mL容量瓶中，即得模擬唾液、模擬胃液和模擬腸液各自的消化樣品.

另精密稱取牡丹花粉口含片粉末2 g，置于錐形瓶中，加入25 mL模擬唾液，以封口膜封口，置于搖床上，在37 ℃、180 r/min條件下孵育10 min后，用5 mol/L鹽酸溶液將pH值迅速調(diào)至1.2，加入0.08 g胃蛋白酶，以同樣條件繼續(xù)孵育2 h后，用1 mol/L NaOH溶液將pH值迅速調(diào)至6.8，加入0.0125 g胰蛋白酶和0.625 g膽酸鈉，以同樣條件繼續(xù)孵育2 h，消化完畢后，置于沸水浴中滅酶10 min，快速冷卻，加入25 mL無水乙醇，離心15 min(4 000 r/min)，取上清液以純凈水定容至50 mL容量瓶中，即得累加消化樣品.

1.2.5.3 抗氧化活性測定[21-23]將各模擬消化樣品及對照品Vc溶液分別稀釋成系列濃度2、4、6、8、10、12 mg/mL溶液，分別精密吸取上述系列濃度溶液各1 mL，分別置于10 mL比色管中，各加入0.2 mmol/L的DPPH·溶液2 mL，再加入純凈水2 mL，搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min后，于517 nm處測定吸光度值A(chǔ)1，同時(shí)以無水乙醇為參比測定DPPH·空白溶液吸光度值A(chǔ)0，按公式DPPH·清除率(%)=(A0-A1)/A0×100% ，計(jì)算各消化樣品的DPPH·清除率，以牡丹花粉口含片各模擬消化樣品質(zhì)量濃度(X，mg/mL)對DPPH·清除率(Y，%)進(jìn)行回歸，得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和IC50.

將各模擬消化樣品及對照品VC溶液稀釋成系列濃度0.1、1、2、3、4、5 mg/mL溶液.分別精密吸取上述系列濃度溶液各1 mL，分別置于10 mL比色管中，各加入ABTS工作液(將35 mol/L的ABTS溶液和25 mol/L的過硫酸鉀溶液按2∶1的體積比混勻，用無水乙醇稀釋至吸光度為0.6±0.1)3 mL，再加入純凈水1 mL，搖勻，室溫避光反應(yīng)30 min后，于734 nm處測定吸光度值A(chǔ)1，同時(shí)以水為參比測定ABTS·空白溶液吸光度值A(chǔ)0，按公式ABTS·清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%，計(jì)算各消化樣品的ABTS·清除率，以牡丹花粉口含片各模擬消化樣品質(zhì)量濃度(X，mg/mL)對ABTS·清除率(Y，%)進(jìn)行回歸，得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和IC50.

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹花粉的破壁率

牡丹花粉近低溫細(xì)胞壁破壁超微粉碎機(jī)破壁后，其破壁率>97%.

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 花粉用量對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響 由圖1可見，當(dāng)花粉的用量為22%時(shí)，口含片外觀表面光滑、色澤均勻，硬度適中，崩解時(shí)限最優(yōu)，故暫定牡丹花粉口含片的花粉用量為22%.

圖1 花粉用量對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響Figure 1 Effect of pollen dosage on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.2 甘露醇-乳糖的比例對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響 由圖2可見，隨著乳糖比例的逐漸增大，牡丹花粉口含片的硬度和崩解時(shí)限明顯增大，當(dāng)甘露醇-乳糖比例為1∶2時(shí)，牡丹花粉口含片的外觀、口感最佳，硬度和崩解時(shí)限符合藥典要求，故將填充劑甘露醇-乳糖的比例定為1∶2.

圖2 甘露醇-乳糖比例對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響Figure 2 Effect of mannitol-lactose proportion on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.3 矯味劑用量對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響 由圖3可見，隨矯味劑阿斯巴甜-檸檬酸用量的增大，牡丹花粉口含片的各項(xiàng)指標(biāo)均增大，當(dāng)矯味劑用量為11%和13%時(shí)，其口含片的外觀均表面光滑、色澤均勻，雖然矯味劑用量為13%時(shí)口含片的硬度和崩解時(shí)限最優(yōu)，當(dāng)考慮到矯味劑用量為11%時(shí)口含片的口感最佳，故暫定矯味劑用量為11%.

圖3 矯味劑用量對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響Figure 3 Effect of corrigent dosage on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.4 阿斯巴甜-檸檬酸的比例對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響 由圖4可見，當(dāng)阿斯巴甜-檸檬酸的比例為1∶1～1∶3時(shí)，牡丹花粉口含片的外觀均表面光滑、色澤均勻，硬度相當(dāng)，當(dāng)阿斯巴甜-檸檬酸比例為1∶2時(shí)，牡丹花粉口含片口感最佳、崩解時(shí)限最優(yōu)，故確定矯味劑阿斯巴甜-檸檬酸的比例為1∶2.

圖4 矯味劑比例對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響Figure 4 Effect of aspartame-citric acid proportion on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.5 乙醇濃度對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響 由圖5可見，當(dāng)乙醇濃度為65%～75%時(shí)，牡丹花粉口含片的外觀、硬度均較佳，以70%乙醇的崩解時(shí)限最優(yōu)；當(dāng)乙醇濃度超過75%時(shí)，牡丹花口含片的硬度下降出現(xiàn)松片裂片現(xiàn)象.綜合考慮選擇70%乙醇為潤濕劑.

圖5 乙醇濃度對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響Figure 5 Effect of ethanol concentration on quality of peony pollen buccal tablet

2.2.6 硬脂酸鎂對顆粒流動(dòng)性和壓片效果的影響 由表3可見，當(dāng)硬脂酸鎂用量為1.5%時(shí)顆粒的流動(dòng)性和口含片的外觀最好，故確定硬脂酸鎂用量為1.5%.

2.3 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，方差分析結(jié)果見表5.由正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，影響牡丹花粉口含片綜合評分的因素依次為：A>B>C，即花粉用量>矯味劑比例>潤濕劑；方差分析結(jié)果表明，花粉用量和矯味劑比例對牡丹花粉口含片質(zhì)量的影響具有顯著性意義(P<0.05)；最優(yōu)水平組合為A3B2C2，即花粉用量為22%，矯味劑比例為1∶1.5，潤濕劑為70%乙醇.

表3 硬脂酸鎂對顆粒流動(dòng)性和可壓性的影響

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 方差分析結(jié)果

F0.05(2,2)=19.000.

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)選得到的處方和工藝為牡丹花粉22%、甘露醇-乳糖(1∶2)67%、阿斯巴甜-檸檬酸(1∶1.5) 11%，混合均勻，用70% 乙醇濕法制粒，烘干，整粒，加入1.5% 硬脂酸鎂，壓片，即得.按上述最佳處方配比和工藝制備了3批口含片進(jìn)行驗(yàn)證，觀察到口含片外表光潔、色澤均勻；3批牡丹花粉口含片的硬度控制在37.8～48.3 N，崩解時(shí)限為11.30 min左右，平均片質(zhì)量為0.400 6 g，質(zhì)量差異小于±5%，結(jié)果見表6.以上結(jié)果均符合藥典規(guī)定.表明優(yōu)選的處方及工藝穩(wěn)定可靠，合理可行.

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.5 牡丹花粉口含片的抗氧化活性

2.5.1 模擬消化樣品清除DPPH·的能力 由圖6可見，牡丹花粉口含片各模擬消化樣品均表現(xiàn)出一定的清除DPPH·的活性.由表7可知，各模擬消化樣品在質(zhì)量濃度2～12 mg/mL范圍內(nèi)與DPPH·的清除率呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.966 7～0.995 5；牡丹花粉口含片不同消化樣品對DPPH·的IC50依次為腸液消化樣品>唾液消化樣品>胃液消化樣品，提示抗DPPH·活性成分主要在腸液和唾液消化，其累加消化樣品對DPPH·清除率的IC50為(4.722±0.112)mg/mL.

2.5.2 模擬消化產(chǎn)物清除ABTS·的能力 由圖7可見，牡丹花粉口含片各模擬消化樣品均表現(xiàn)出一定的清除ABTS·活性.由表8可知，各模擬消化樣品在質(zhì)量濃度0.1～3 mg/mL范圍內(nèi)與ABTS·清除率呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.984 4～0.989 7；牡丹花粉口含片不同消化樣品對ABTS·的的半數(shù)清除率率IC50依次為胃液消化樣品>腸液消化樣品>唾液消化樣品，提示抗ABTS·活性成分主要在胃液消化，其累加消化樣品對DPPH自由基清除率的IC50為(0.540±0.048) mg/mL.

表7 模擬消化樣品對DPPH自由基的清除率的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和半數(shù)清除率

表8 模擬消化樣品對ABTS自由基的清除率的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和半數(shù)清除率

圖6 模擬消化樣品及VC對DPPH自由基的清除能力Figure 6 DPPH free radical scavenging activity of simulation digestion samples and VC

圖7 模擬消化樣品及VC對ABTS自由基的清除能力Figure 7 ABTS free radical scavenging activity of simulation digestion samples and VC

3 結(jié)論

1) 本試驗(yàn)通過單因素和正交試驗(yàn)確定的牡丹花粉口含片的最佳處方和制備工藝為牡丹花粉用量22%，甘露醇-乳糖(1∶2)用量為67%，阿斯巴甜-檸檬酸(1∶1.5)用量為11%，原輔料混合均勻，加入70%乙醇經(jīng)濕法制軟材，過18目篩，制得顆粒，于50 ℃烘干后，經(jīng)30 目篩整粒，制成干顆粒，加入1.5%硬脂酸鎂，混合均勻，壓片.該工藝經(jīng)驗(yàn)證，制得的口含片均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，表明該工藝穩(wěn)定可行，操作簡便，適合于工業(yè)化生產(chǎn).

2) 本試驗(yàn)通過測定牡丹花粉口含片模擬體內(nèi)消化產(chǎn)物對DPPH和ABTS自由基的清除能力，評價(jià)牡丹花粉口含片抗氧化活性.結(jié)果顯示，腸液消化樣品對DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)，而胃液消化樣品對ABTS自由基的清除能力較強(qiáng)，累加消化液對DPPH、ABTS自由基的半數(shù)清除率(IC50)分別為(4.722±0.112)(0.540±0.048) mg/mL.