加速溶劑萃取測定禽肉中FF及FFA方法研究

王波，趙霞，謝愷舟，張跟喜，張濤，戴國俊

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009；3.揚州大學動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009)

氟苯尼考(FF)為甲砜霉素(TAP)的單氟衍生物，抗菌機理與甲砜霉素相似，對多數(shù)革蘭氏陽性菌和陰性菌都有作用，屬于廣譜類抗生素[1].氟苯尼考作為新一代的氯霉素及甲砜霉素替代品，克服了氯霉素易產(chǎn)生耐藥性和造成再生障礙性貧血的問題，且抗菌活性強于氯霉素和甲砜霉素，具有抗菌譜廣，口服吸收好，體內分布廣泛，生物利用度高，應用安全等特點，廣泛用于畜牧生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中.然而繁殖毒性試驗表明，氟苯尼考及其代謝產(chǎn)物氟苯尼考胺(FFA)具有一定的胚胎毒性，近年來常有報道畜牧養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖中過度使用FF，導致FF和FFA殘留在動物性食品中，危害人體健康.因此對FF及FFA在畜禽、水產(chǎn)等動物性食品中的殘留檢測等研究開始受到重視[2-3].通常以氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量總和作為動物體內氟苯尼考的殘留標示物.歐盟、美國、中國農(nóng)業(yè)部規(guī)定了FF和FFA在家禽肌肉中的最大殘留量(MRL)為100 μg/kg[4-6].

目前，氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留檢測的方法主要包括：酶聯(lián)免疫法(ELISA)[7]、液相色譜法(LC)[8-12]、氣相色譜法(GC)[13-15]和液質聯(lián)用法(LC-MS/MS)[16-20].這些檢測方法中常見的提取方法包括液-液萃取(LLE)[8,16,18]、織物相吸附萃取法(FPSE)[11]、固相萃取(SPE)[15]、亞臨界流體萃取(SFE)[17,21].但是，LLE法耗時長和試劑消耗多，且可能存在操作上的誤差；FPSE法快速、試劑消耗少，但不適用于動物飼料等固體樣品；SPE法需要使用昂貴的固相小柱、提取時間長；SFE法操作復雜，萃取時間長.

加速溶劑萃取法(accelerated solvent extraction，ASE)是一種自動化、可替代傳統(tǒng)萃取方法的新型萃取技術，操作簡單、快速，適合批量處理樣品.目前，利用加速溶劑技術萃取動物源性食品中哌嗪[22]、二硝托胺及其代謝產(chǎn)物[23]等均有研究，但采用加速溶劑技術萃取禽肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺的研究還未見報道.本試驗以乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)為萃取溶劑，乙酸乙酯飽和的正己烷去脂，對禽肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺進行加速溶劑萃取，并采用超高效液相色譜-熒光檢測法對禽肉中氟苯尼考和氟苯尼考胺進行測定，確定最佳萃取條件，研究結果旨為動物源性食品中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留監(jiān)測提供技術支持.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY UPLCTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Waters ACQUITY FLD檢測器(美國Waters公司)；ASE350加速溶劑萃取儀(美國Thermofisher公司)；ScanSpeedVac40離心濃縮儀(丹麥Telstar公司)；5810R臺式高速冷凍離心機(德國Eppendof公司)；超純水制備儀Smart2-Pure(美國Thermo Scientific公司)；Mettler Toledo FE20 pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)；氟苯尼考標準品(純度為99.0%，德國Labor Dr.Ehrenstorfer Gmbh有限公司)；氟苯尼考胺標準品(純度為99.3%，德國WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof Gmbh有限公司)；乙腈(色譜純，德國EMD Millipore公司)；三乙胺(色譜純，純度99.0%，賽默飛世爾科技有限公司)；磷酸二氫鈉(純度≥99.0%)、磷酸(純度≥85.0%)、正己烷和氨水(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；十二烷基硫酸鈉(純度≥95.0%，分析純，北京索萊寶科技有限公司)；試驗用水為超純水.

1.2 主要溶液配制

1.2.1 標準儲備液配制 準確稱取氟苯尼考標準品4.0 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL容量瓶中，充分搖勻，配制成 400.0 mg/L標準貯備液.準確稱取氟苯尼考胺標準品1.0 mg，先用1 mL超純水溶解，再用乙腈定容至10 mL容量瓶中，充分搖勻，配制成 100.0 mg/L標準貯備液.將標準貯備液分裝，密封，置-70 ℃超低溫冰箱中，可穩(wěn)定保存5個月.

1.2.2 提取劑配制 用移液器吸取10 mL氨水，用量筒量取490 mL乙酸乙酯至500 mL容量瓶中，配制乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)溶液，混勻備用.由于氨水易揮發(fā)，該溶液宜現(xiàn)配現(xiàn)用.

1.2.3 凈化試劑配制 用量筒量取400 mL的正己烷至500 mL容量瓶中，加入適量的乙酸乙酯，混勻直至分層.

1.3 樣品前處理

將雞、鴨、鵝的胸肌肉分別通過勻漿機攪碎并充分混勻作為空白樣品，分裝，密封，置于-34 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?準確稱取2.0 g均質好的空白禽肉樣品放于研缽中，與適量硅藻土研磨均勻，為了達到最佳的萃取效率，將樣品與硅藻土研磨成粉末狀，裝入22 mL萃取池中(若池子留有空隙則用硅藻土填滿)，放在加速溶劑萃取儀的機械臂上進行萃取，選用優(yōu)化后的萃取劑乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)進行萃取，其萃取過程及參數(shù)如下：萃取壓力為10.34 MPa，萃取溫度為80 ℃，萃取時間為3 min，萃取溶劑用量約為40%的池體積，每個樣品之間自動沖洗1次，氮氣吹掃時間60 s，靜態(tài)循環(huán)萃取2次，最后收集萃取液.將萃取液轉移至50 mL離心管，置于50 ℃離心濃縮儀(轉速為2000×g)上吹至近干，加入1 mL純乙腈渦旋震蕩溶解殘渣，加入5 mL乙酸乙酯飽和的正己烷去脂，渦旋震蕩1 min后靜置5 min，棄去上層正己烷，然后將萃取液置于50 ℃離心濃縮儀上吹干.將濃縮干后的樣品用2.0 mL流動相復溶，渦旋1 min，以12 100×g離心15 min，過0.22 μm聚偏氟乙烯(PVDF)針式濾器，濾液供UPLC-FLD檢測.

1.4 UPLC-FLD分析條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，1.7 μm，100 mm×2.1 mm i.d.；流動相A：超純水(含0.005 mol/L的NaH2PO4溶液、0.003 mol/L十二烷基硫酸鈉和0.05%的三乙胺，用85% H3PO4調pH 至5.3±0.1)；流動相B：乙腈；等度洗脫：A∶B=65∶35(V/V)；檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長233 nm，發(fā)射波長284 nm；流速：0.2 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃.

1.5 方法參數(shù)驗證

1.5.1 標準曲線的繪制、檢測限和定量限的測定 用空白基質液稀釋每個混合標準工作溶液配制相應的濃度點(FF：LOQ、20.0、50.0、100.0、200.0、300.0、400.0 μg/kg；FFA：LOQ、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μg/kg)，將每個混合濃度點依次由低濃度到高濃度進行UPLC-FLD檢測分析.每個濃度點重復測定3次，取平均值.以FF和FFA在不同空白基質樣品(雞肉、鴨肉和鵝肉)中的濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)，繪制標準曲線，求出目標化合物在不同空白基質樣品中的線性回歸方程和相關系數(shù).空白基質液逐級稀釋FF和FFA的濃度進行UPLC-FLD分析，樣品檢測信噪比(S/N)為3和10時所對應的添加濃度分別作為FF和FFA在樣品中的檢測限和定量限.

1.5.2 樣品回收率和精密度的測定 準確稱取2.0 g均質好的空白禽肉樣品，向其添加4個濃度點的FF和FFA(LOQ、0.5 MRL、1.0 MRL和2.0 MRL)，根據(jù)ASE前處理方法提取、凈化樣品，每個濃度點設置6個平行，取10 μL進樣進行UPLC-FLD檢測.將測定FF和FFA的峰面積分別代入到不同基質的標準曲線中去，計算出分析物的濃度來評估方法的回收率.將回收率檢測剩余的樣品按4個添加濃度在同一天內相隔6 h后用同一標準曲線及同一儀器重復測定6次，求平均值，計算日內精密度.在測定回收率后相隔一天用同一儀器不同標準曲線重復測定6次，求平均值，計算日間精密度.

2 結果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

2.1.1 ASE參數(shù)優(yōu)化 ASE使用的壓力遠高于將溶劑保持在其液態(tài)所需的閾值，改變壓力對分析物回收率的影響很小，因此不需要進行壓力調節(jié)，壓力一般在10.34 MPa[24].本試驗在10.34 MPa壓力條件下，考察了不同萃取溫度(40、60、80、100、120 ℃)和提取時間(1、2、3 、5 、8 min)對萃取效率的影響.

圖1 溫度對ASE萃取效果的影響Figure 1 Effect of temperature on ASE extraction

圖2 時間對ASE萃取效果的影響Figure 2 Effect of time on ASE extraction

由圖1、圖2可知，80 ℃是最佳的萃取溫度，3 min為最佳靜態(tài)萃取時間，在此條件下可保證FF和FFA均有較高的響應值.

2.1.2 萃取劑的選擇 在ASE提取條件下，比較了不同的提取劑乙腈∶氨水(98∶2，V/V)、乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)和乙酸乙酯∶乙腈∶氨水(49∶49∶2，V/V))對樣品回收率的影響.當乙腈∶氨水(98∶2，V/V)作為提取劑時，由于乙腈的極性比較大，從肌肉基質中提取的內源性極性物質較多，對目標化合物檢測干擾大，即使調節(jié)流動相比例，目標化合物與雜質無法分離，因此需要通過SPE小柱凈化才能實現(xiàn)目標化合物與雜質分離.然而SPE小柱的選擇與方法的開發(fā)過程使樣品的前處理過程變得更加繁瑣，且耗時、耗力、耗成本.當乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)和乙酸乙酯∶乙腈∶氨水(49∶49∶2，V/V)作為提取劑時，兩種提取劑均能很好地提取目標化合物(表1)，但是相比添加乙腈的提取劑，乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)提取出來的雜質更少，對于目標物的檢測干擾更小，同時乙酸乙酯很快就可濃縮干，而乙腈濃縮干所用時間是乙酸乙酯的3倍多，延長了前處理的時間，檢測效率降低.因此，本試驗最終采用了ASE方法，乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)作為提取劑，節(jié)約了前處理時間，適合批量萃取禽肉中FF和FFA殘留.

表1 不同提取試劑對50.0 μg/kg氟苯尼考和氟苯尼考胺提取回收率的影響

2.2 UPLC-FLD的優(yōu)化

2.2.1 激發(fā)波長和發(fā)射波長的確定 將添加濃度50 μg/kg FF和FFA的雞肉、鴨肉和鵝肉樣品基質液通過熒光掃描，進一步優(yōu)化目標物質的檢測波長，確定在本試驗條件下的目標物質的最佳檢測波長.最終選擇激發(fā)波長233 nm，發(fā)射波長284 nm，在此波長下既保證了目標物的高響應值，又保證無雜質的干擾.

2.2.2 超高效液相色譜條件的優(yōu)化 色譜分析中，色譜柱和流動相的選擇與優(yōu)化是實現(xiàn)目標物良好分離效果的關鍵.在已報道的文獻中[8-12]，氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺在C18柱上均有良好的分離效果，因此本試驗采用了Waters ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm).Xie K 等[8]的報道，以乙腈∶NaH2PO4溶液(0.01 mol/L，含0.005 mol/L十二烷基硫酸鈉和0.10%三乙胺，用85%H3PO4調pH 至4.5)32∶68(V/V)為流動相，能夠很好地分離雞蛋中TAP、FF和FFA.在先前的研究基礎上，本試驗對離子試劑(十二烷基硫酸鈉)、緩沖體系(磷酸鹽-磷酸)、三乙胺的用量和pH進行進一步的優(yōu)化.試驗過程中比較了1、3、5和10 mmol/L十二烷基硫酸鈉的用量，0、3、5、10和20 mmol/L的NaH2PO4的用量，0.01%、0.03%、0.05%和0.1%的三乙胺用量和不同的pH值對目標物所產(chǎn)生的影響.研究發(fā)現(xiàn)，隨十二烷基硫酸鈉用量的增加，F(xiàn)FA出峰時間后延，3 mmol/L的用量即可保證FFA出峰時間提前；隨NaH2PO4用量的增加，F(xiàn)FA出峰時間也略有提前，但鹽的使用對儀器有一定的影響，而且易造成色譜柱的阻塞，在兼顧FFA出峰時間在前面和維護儀器的條件下，選用5 mmol/L的用量；三乙胺的用量也會影響FFA的出峰時間，0.01%的用量可改善峰拖尾的現(xiàn)象，但隨其用量的增加，F(xiàn)FA出峰時間提前，綜合考慮，最終確定三乙胺用量為0.05%；pH對于FFA的響應值和出峰時間均有影響，在中性pH條件下，F(xiàn)FA出峰時間靠前，但FFA的響應值隨著pH的降低逐漸增強、出峰時間逐漸后延，當pH為5.4時，F(xiàn)FA的響應值達到最高，再降低pH對其響應值影響不大，但出峰時間太靠后，延長檢測時間，降低檢測效率，因此，最終確定pH為(5.3±0.1).上述所有條件的改變對FF的影響不大.因此本試驗最終選用水(含5 mmol/L磷酸二氫鈉，3 mmol/L十二烷基硫酸鈉，0.05%的三乙胺，調pH為5.3±0.1)∶乙腈=65∶35(V/V)作為流動相，等度洗脫能夠很好的分離禽肉中FF和FFA.

圖3 50.0 μg/kg FF和FFA標準品、空白雞肉和空白雞肉樣品添加50.0 μg/kg FF和FFA色譜圖Figure 3 Chromatogram of 50.0 μg/kg FF and FFA standards,blank chicken muscle and blank chicken muscle samples spiked at 50.0 μg/kg FF and FFA

2.2.3 色譜分離 在優(yōu)化好的UPLC-FLD條件下，測定雞肉中FF和FFA的保留時間分別為2.195和4.181 min，鴨肉中FF和FFA的保留時間分別為2.188和4.170 min，鵝肉中FF和FFA的保留時間分別為2.194和4.181 min，峰形好，且空白樣品在此時間無干擾峰出現(xiàn).以雞肉色譜圖為例，圖3為50.0 μg/kg FF和FFA標準品、空白雞肉、空白雞肉樣品添加50.0 μg/kg FF和FFA的色譜圖.

2.3 標準曲線

在線性范圍內，F(xiàn)F和FFA的線性關系良好，決定系數(shù)均大于或等于0.9992.FF在禽肉中的檢測限和定量限分別在3.6 ～ 4.2 μg/kg和10.2～11.4 μg/kg之間；FFA在禽肉中的檢測限和定量限分別在1.0 ～ 1.4 μg/kg和3.0～ 3.5 μg/kg之間.方法靈敏度高，可用于檢測禽肉中FF和FFA殘留分析.禽肉中FF和FFA的檢測限、定量限、回歸方程、決定系數(shù)和線性范圍見表2.

表2 雞、鴨和鵝肉中FF和FFA檢測限、定量限、回歸方程、決定系數(shù)和線性范圍

2.4 添加回收率和精密度

禽肉樣品通過上述樣品前處理方法提取、凈化后，按照1.5.2方法進行UPLC-FLD測定禽肉中FF和FFA的添加回收率和精密度.表3和表4分別是禽肉中FF和FFA的添加回收率和精密度.禽肉中FF的回收率為84.17%～98.42%，相對標準偏差均低于3.70%，日內精密度均低于4.41%，日間精密度均低于4.98%；禽肉中FFA的回收率為83.76%～97.49%，相對標準偏差均低于3.94%，日內精密度均低于4.91%，日間精密度均低于5.89%.

表3 雞、鴨和鵝肉中FF的添加回收率和精密度(n=6)

*.最高殘留限量.

*.Maximum residue limits.

*.最高殘留限量.

*.Maximum residue limits.

謝愷舟等[25]報道了高效液相色譜熒光檢測法測定雞肉中的氟苯尼考及氟苯尼考胺殘留，添加濃度在5～500 μg/kg，F(xiàn)F和FFA的添加回收率分別在79.3%～82.5%、80.5%～85.6%之間，相對標準偏差均低于9.5%，日內、日間精密度分別低于7.4%、11%.與謝愷舟等[25]報道的方法相比較，加速溶劑萃取技術提取禽肉中FF和FFA的回收率和精密度高，同時超高效液相色譜減少流動相的使用，大大縮短了檢測時間.ASE/UPLC-FLD檢測禽肉的FF和FFA方法的建立，適用于快速檢測動物源性食品中FF和FFA殘留.

3 結論

本試驗首次采用加速溶劑萃取前處理方法對禽肉樣品進行提取FF和FFA，建立了ASE/UPLC-FLD方法檢測禽肉中FF和FFA殘留，為動物源性食品中氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留檢測提供了新的技術手段.該方法靈敏、快速，滿足歐盟、美國和中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對氟苯尼考及代謝物氟苯尼考胺殘留檢測的要求.