閩南常見榕屬湯料植物提取物的斑馬魚急性毒性研究

王 可，吳意紅 ,劉順治，范世明，丘鷹昆*

(1.廈門大學(xué)藥學(xué)院福建省藥物新靶點(diǎn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361105；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122)

桑科植物資源豐富，有構(gòu)屬(Broussonetia)、桑屬(Morus)、榕屬(Ficus)等，我國(guó)共 11 屬 150 余種[1]。研究發(fā)現(xiàn)榕屬植物具有降血糖、鎮(zhèn)痛抗炎、抗菌、提高免疫等功效[2]。粗葉榕(Ficus hirta)、天仙果(F.erectavar.beecheyana)、薜荔(F.pumila)、變?nèi)~榕(F.variolosa)常作為閩南地區(qū)藥食同源的藥材，粗葉榕根能治療肺癆咳嗽、脾虛浮腫、風(fēng)濕痹痛，具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用[3]；天仙果根有祛風(fēng)除濕的功效[4]；薜荔葉具有祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、消腫解毒等功效[5]；變?nèi)~榕根具有祛風(fēng)除濕、活血止痛、催乳的功能[6]。這四種植物在閩南地區(qū)分布廣泛，《福建藥物志》中亦記載其藥用功效。

斑馬魚(Brachydanio rerio)具有繁殖能力強(qiáng)，胚胎發(fā)育迅速，胚胎透明、容易觀察且與人類有高度相關(guān)性等優(yōu)點(diǎn)[7]。目前，斑馬魚急性毒性實(shí)驗(yàn)的高通量篩選在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)研究粗葉榕、天仙果、薜荔、變?nèi)~榕不同部位水提取物和醇提取物對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性，以期為閩南榕屬湯料植物的安全應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型AB 系斑馬魚，由廈門大學(xué)藥學(xué)院李明玉實(shí)驗(yàn)室提供。

?？崎艑僦参锎秩~榕、天仙果、薜荔、變?nèi)~榕采自廈門市翔安區(qū)，經(jīng)廈門大學(xué)藥學(xué)院丘鷹昆副教授鑒定，標(biāo)本保存于廈門大學(xué)藥學(xué)院，標(biāo)本號(hào)分別為 ：粗 葉 榕 (350213LY0120)、天 仙 果(350213LY0168)、薜荔(350213LY0123)、變?nèi)~榕(350213LY0107)。干燥粗葉榕、天仙果的根、莖、葉，薜荔莖、葉、果及變?nèi)~榕莖、葉，研磨成粗粉，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

全自動(dòng)性光照培養(yǎng)箱(韶關(guān)市醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)LRH-250-G)，萊卡體視顯微鏡(德國(guó)，型號(hào)M205)，Thermo 移液槍(賽默飛世爾科技有限公司，中國(guó))，24 孔板(Cosmo 公司，美國(guó))，DMSO(生物級(jí)，Sigma，美國(guó))。

1.3 提取物制備

分別稱取干燥的藥材粉末，加入10 倍量超純水，加熱回流提取2 次，每次30 min，合并兩次濾液，濃縮、干燥得到實(shí)驗(yàn)用水提取物。

醇提取物的制備方法同上，提取溶劑為95%乙醇(V/V)。

1.4 提取物溶液配制

水提取物、醇提取物分別用超純水、生物級(jí)二甲基亞砜配制為200 mg·mL-1母液，用于斑馬魚胚胎急性毒性實(shí)驗(yàn)時(shí)，將母液稀釋至終濃度200 μg·mL-1、100 μg·mL-1，保存于4 ℃冰箱備用。

1.5 急性毒性實(shí)驗(yàn)

采用靜水實(shí)驗(yàn)法[8]，以受精后5 d 為一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，取受精后1 d 發(fā)育健康的斑馬魚胚胎，置于24孔板中，每孔20 個(gè)左右胚胎，用滴管將孔中的水移去，分別暴露于不同濃度的水提取物和醇提取物中，每孔1.5 mL 溶液，同時(shí)以斑馬魚培養(yǎng)液作為空白對(duì)照組。每天挑出死亡的幼魚，記錄魚死亡數(shù)量，并拍照，連續(xù)觀察4 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 含水率與提取物得率

粗葉榕、天仙果、薜荔、變?nèi)~榕不同部位干燥樣品水提物、醇提取物的得率如表1 所示，天仙果和變?nèi)~榕不同部位的水提取物、醇提取物的得率差異較大。

表1 四種榕屬植物不同部位的干燥樣品水提物、醇提取物得率(%)Table 1 The yields of aqueous extracts and alcohol extracts of dried samples from different parts of four Ficus plants (%)

2.2 四種榕屬植物不同部位水提取物的急性毒性

粗葉榕、天仙果、薜荔、變?nèi)~榕不同部位水提物急性毒性實(shí)驗(yàn)，給藥200 μg·mL-1，48 h 時(shí)，胚胎發(fā)育正常，與空白組相比，榕屬湯料植物的主要藥用部位水提取物能加速斑馬魚胚胎發(fā)育，并顯著提高胚胎存活率(圖1)。給藥96 h 后，與空白組對(duì)照相比，除天仙果莖水提取物組死亡率接近空白組外，其余處理組的斑馬魚胚胎死亡數(shù)量明顯低于空白組，表明其水提物增加了斑馬魚胚胎的存活率(圖2:A)，體視顯微鏡觀察表明，上述提取物對(duì)胚胎生長(zhǎng)沒有負(fù)面影響，未表現(xiàn)出畸形等毒理學(xué)病變(圖2:B,C)，說明這四種湯料植物有利于提高斑馬魚的存活率，且未表現(xiàn)出急性毒性(圖2:C)。

圖1 榕屬不同藥用部位水提取物給藥200 μg·mL-1 斑馬魚胚胎48 h 死亡情況Fig.1 Mortality of zebrafish embryos after 48 h treated with aqueous extracts of different medicinal parts of Ficus spp.(dosage 200 μg·mL-1)

2.3 四種榕屬植物不同部位醇提取物的急性毒性

粗葉榕、天仙果、薜荔、變?nèi)~榕不同部位醇提物，給藥200 μg·mL-1，96 h 后斑馬魚死亡率均低于35%(圖3:A)，與空白組無明顯差異。在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，部分醇提取物在試驗(yàn)周期最后2 d，出現(xiàn)斑馬魚胚胎畸形加劇的情況，可能由于給藥3～4 d 后發(fā)生累積毒性效應(yīng)，導(dǎo)致急性毒性效應(yīng)。體視顯微鏡下觀察顯示，天仙果莖、葉及變?nèi)~榕葉醇提物處理的斑馬魚出現(xiàn)尾部畸形(圖3:B,C,E)；薜荔葉、果醇提取物處理出現(xiàn)明顯心包水腫(圖3:F)，說明上述醇提取物在高濃度下對(duì)斑馬魚胚胎心臟和脊柱發(fā)育有影響，可能是肝毒性、腎毒性、心臟毒性的綜合表現(xiàn)。

圖3 榕屬不同藥用部位醇提取物處理96 h 斑馬魚胚胎死亡率及形態(tài)Fig.3 Mortality and morphology of zebrafish embryos after 96 h treated with alcohol extracts from different medicinal parts of Ficus spp.

3 討論

粗葉榕、天仙果、薜荔、變?nèi)~榕在閩南地區(qū)常作為涼茶、佐料配伍水煮飲用，具有一定的藥用價(jià)值。斑馬魚基因與人類基因相似度高達(dá)87%，是毒理學(xué)評(píng)價(jià)中的重要?jiǎng)游锬Ｐ?。為進(jìn)一步了解閩南常見榕屬湯料植物的急性毒性，作者進(jìn)行了斑馬魚急性毒性模型實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明榕屬(粗葉榕根、天仙果根、葉，薜荔果，變?nèi)~榕莖、葉)不同藥用部位水提取物對(duì)斑馬魚的LC50均大于200 μg·mL-1。根據(jù)魚類急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T21281-2207)，LC50≤1 mg·L-1為極高毒；LC501～10 mg·L-1為高毒；LC5010～100 mg·L-1為中毒；LC50＞100 mg·L-1為低毒。可見，粗葉榕、天仙果、薜荔、變?nèi)~榕不同部位水提取物、醇提物是低毒至無毒的。但其中部分醇提取物在高濃度時(shí)對(duì)斑馬魚胚胎表現(xiàn)出發(fā)育毒性，斑馬魚出現(xiàn)尾部畸形、心包水腫等現(xiàn)象，需要進(jìn)一步對(duì)其毒性成分進(jìn)行分析。目前從桑科榕屬植物中分離得到的化合物有三萜化合物、黃酮類化合物、倍半萜、香豆素、生物堿、甾醇等[9—10]，其中佛手柑內(nèi)酯等香豆素成分具有細(xì)胞毒性，該類成分脂溶性較強(qiáng)，在較高的劑量下可能與毒性效應(yīng)有關(guān)[11—13]。

此外，上述植物水提取物及天仙果、粗葉榕的醇提取物能促進(jìn)胚胎生長(zhǎng)，提高斑馬魚存活率，其有益功效的物質(zhì)基礎(chǔ)值得深入研究；而部分醇提取物在高濃度條件下表現(xiàn)出一定的胚胎毒性，但對(duì)胚胎存活率未產(chǎn)生顯著影響。粗葉榕、天仙果、薜荔、變?nèi)~榕作為湯料應(yīng)用，其毒性低，安全性高，上述植物較少用作藥酒原料，但也應(yīng)當(dāng)考慮醇提取物在較高攝入量情況下可能導(dǎo)致的毒性效應(yīng)。值得注意的是，傳統(tǒng)應(yīng)用所選取的藥用部位，如粗葉榕根、天仙果根、變?nèi)~榕根、薜荔莖，在實(shí)驗(yàn)中均未表現(xiàn)出不良毒性效應(yīng)，說明其藥用部位選材的合理性，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)注意參考。綜上，本實(shí)驗(yàn)為閩南常見桑科榕屬湯料植物的使用提供安全性評(píng)價(jià)依據(jù)。