尿素通道作為新型利尿藥靶點的研究進展

張順，楊寶學

（北京大學基礎醫(yī)學院藥理學系，天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京 100191）

利尿藥是臨床上常用藥物，主要用于治療高血壓、心衰和各種水腫性疾病等。其作用靶點在腎，通過增加尿量發(fā)揮利尿作用。但由于傳統(tǒng)利尿藥通過排鈉排水利尿，會導致電解質(zhì)平衡紊亂等副作用?？茖W家們一直在尋找新的利尿藥靶點，研發(fā)新型利尿藥。尿素通道（urea transports，UT）是一種新的利尿藥靶點，其抑制劑有望發(fā)展成為不引起電解質(zhì)平衡紊亂的新型利尿藥。本文擬總結UT為利尿藥靶點的理論基礎、UT 抑制劑的篩選和評價方法及目前已被發(fā)現(xiàn)的小分子UT 抑制劑，為后續(xù)的以UT為靶點的新型利尿藥研發(fā)提供參考。

1 尿素通道

UT 是一類選擇性通透尿素的膜通道蛋白，在維持腎內(nèi)尿素循環(huán)，建立腎髓質(zhì)組織尿素濃度梯度和尿濃縮機制中發(fā)揮重要作用［1-5］。YOU 等［6］于1993 年首先克隆第一個UT-A2 的cDNA。迄今已克隆的UT 分為UT-A 和UT-B 2 個亞家族。UT-A亞家族由Slc14a2基因編碼，包括6 個成員UTA1～UT-A6，其中UT-A1 和UT-A3 表達在內(nèi)髓集合管末段的上皮細胞［7-8］，UT-A2主要表達于髓袢降支細段［9］，UT-A4在內(nèi)髓集合管末段表達（只在大鼠發(fā)現(xiàn)）［7］，UT-A5 表達于睪丸間充質(zhì)細胞［10］，UT-A6 表達于人結腸黏膜上皮細胞［11］。UT-B 由Slc14a1基因編碼，廣泛表達于全身多個組織器官，在腎直小血管內(nèi)皮細胞、紅細胞、腦、心、脾、結腸、睪丸和膀胱等組織表達水平較高［12］。

1.1 尿素通道的作用

UT 在維持腎內(nèi)尿素循環(huán)和尿液濃縮中發(fā)揮重要作用。在腎集合管，精氨酸血管加壓素通過調(diào)節(jié)水通道蛋白2上膜，增加水的重吸收，而尿素因不能透過集合管近端大部分節(jié)段而不斷被濃縮，在內(nèi)髓集合管末端達較高濃度。UT-A1 和UT-A3 表達于內(nèi)髓集合管末端的上皮細胞，尿素通過UT-A1 和UT-A3進入內(nèi)髓間充質(zhì)組織，間充質(zhì)組織高濃度尿素通過內(nèi)皮細胞的微孔進入直小血管升支，隨血液向腎皮質(zhì)方向轉(zhuǎn)運，在血管內(nèi)外尿素濃度差的作用下，尿素從直小血管升支進入組織，通過UT-B進入直小血管降支，隨血流再返回內(nèi)髓，從而建立從腎外髓至內(nèi)髓的尿素濃度梯度，以維持從腎皮質(zhì)至腎髓質(zhì)的滲透壓梯度。因此，UT 在維持腎內(nèi)尿素循環(huán)和尿液濃縮機制中發(fā)揮重要作用［13-14］（圖1）。

1.2 UT-B晶體結構的解析

圖1 腎內(nèi)各尿素通道（UT）亞型的表達部位及腎內(nèi)尿素循環(huán)示意圖. DVR：直小血管降支；AVR：直小血管升支；?：尿素移動方向.

UT-B 晶體結構的解析為基于結構尋找及優(yōu)化UT抑制劑提供結構基礎。UT家族成員的氨基酸序列具有相似的結構特征，通常包含10 個跨膜螺旋，其中UT-A1 包括20 個跨膜螺旋，由2 個UT結構域串聯(lián)而成［15］。每個區(qū)域中前5 個跨膜螺旋與最后5 個跨膜螺旋具有明顯的同源性［16］。而UT 另一個明顯的結構特征是每5個跨膜螺旋都包含一個保守結構域，帶有LPXXTXPF 序列，該序列在選擇性通透尿素過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，每個UT每秒可以通透1×104～1×106個尿素分子。UT-B 對甲酰胺和乙酰胺等小分子尿素類似物也具有選擇性通透功能［17］。UT-B 的晶體結構已被解析，其以三聚體狀態(tài)存在于細胞膜，每一個UT-B 分子結構相當于2個結構相似的半圓柱狀結構域相向扣合而成的空心圓柱（圖2A）。UT-B分子圓柱狀結構的中心孔道可選擇性通透尿素和乙酰胺等小分子尿素類似物。這一通道的兩端分別稱為So位點（向細胞外側(cè)開口）和Si位點（向細胞內(nèi)側(cè)開口），孔道的中央稱為Sm位點，位于So和Si之間；2個由3個氧原子組成的線性陣列的側(cè)鏈被稱為氧梯。在結晶過程中加入金原子能影響側(cè)鏈在晶體結構中的位置［18］（圖2B、2C）。UT-B的三維結構使尿素分子部分脫水結合到孔道端口（So或Si位點），并可進一步徹底脫水移動到Sm位點，從而穿過孔道［19］。

2 尿素通道敲除小鼠模型

2.1 UT-B敲除小鼠模型

UT-B 功能性敲除導致尿素選擇性尿濃縮能力下降。2002年，YANG等［12］通過敲除Slc14a1基因的3～6 號外顯子建立了第一個UT-B 敲除小鼠模型。與野生型小鼠相比，UT-B 敲除小鼠的生長和發(fā)育無明顯差異，但尿量增加50%，同時使尿滲透壓降低25%［12］。UT-B敲除模型小鼠的腎內(nèi)髓組織尿素濃度和滲透壓降低，而鈉、鉀和氯等電解質(zhì)濃度正常，且尿濃縮能力下降并不影響其他腎功能和機體的電解質(zhì)平衡，提示UT 功能性缺失可提供阻斷腎內(nèi)尿素循環(huán)引起尿素選擇性利尿。UT-B 全身敲除會導致小鼠血尿素濃度升高［12］，尿素在海馬蓄積可引起抑郁樣行為［20-21］。UT-B 的敲除導致了尿素在睪丸的蓄積和雄性生殖系統(tǒng)早熟。此外，UT-B敲除可誘導膀胱尿路上皮細胞DNA 損傷和凋亡［22-23］。

2.2 UT-A敲除小鼠模型

圖2 脫硫弧菌尿素通道（dvUT）的晶體結構及氨基酸位點［18］. A：dvUT 三聚體結構，▲為晶體的3 次對稱軸；B：在N，N′-二甲基脲（DMU）與dvUT結合位點，金原子與dvUT發(fā)生共結晶；C：金原子影響氧梯側(cè)鏈在晶體結構中的位置.

UT-A1 在尿素選擇性尿濃縮機制中發(fā)揮重要作用。敲除Slc14a2基因10 號外顯子140 bp 大小的片段獲得UT-A1/A3雙敲除小鼠。與野生型小鼠相比，UT-A1/A3 敲除小鼠尿量增加2 倍，尿滲透壓降低70%。在UT-A1/A3 敲除小鼠中，血漿尿素濃度與正常小鼠無明顯差異，且除腎較小、睪丸較大外，未見其他明顯異常［24-25］。敲除Slc14a2基因位于第12內(nèi)含子的啟動子及部分13號外顯子的一個4 kb的基因片段，建立UT-A2敲除小鼠。在正常條件下或脫水條件下，UT-A2敲除小鼠與野生型小鼠相比，尿量及髓質(zhì)尿素濃度無明顯差異。而在低蛋白飲食（4%蛋白質(zhì)）的情況下，UT-A2 敲除小鼠最大尿滲透壓及內(nèi)髓尿素濃度顯著降低［26］。在UT-A1/A3 雙敲除小鼠轉(zhuǎn)入UT-A1 基因，獲得了腎集合管末段只缺失UT-A3基因的小鼠，該小鼠的基礎尿素通透性及尿濃縮能力達到正常水平，提示UT-A1在腎集合管末段的重要性遠大于UT-A3［27］。對UT-A1編碼基因Slc14a2的9號外顯子后的“gt”拼接信號進行同義突變，在不影響其他UT-A 成員轉(zhuǎn)錄和翻譯的同時，獲得UT-A1 特異性敲除小鼠。UT-A1敲除小鼠的尿量約為野生型小鼠尿量的3倍，其內(nèi)髓組織液尿素濃度明顯低于野生型小鼠，而Na+，K+和Cl-濃度與野生型小鼠相比無明顯差異。UT-A1敲除小鼠的生長發(fā)育、腎功能指標、血電解質(zhì)水平及腎組織結構方面均無明顯異常［28］。

2.3 全部尿素通道敲除小鼠模型

全部UT 敲除只降低尿濃縮能力，無明顯其他表型異常。JIANG 等［29］通過同時敲除Slc14a1和Slc14a2基因的大部分片段，成功構建了全部UT敲除小鼠模型。與野生型小鼠相比，模型小鼠日尿量增加近3.5 倍，尿滲透降低約75%。由于敲除了所有UT，尿素在內(nèi)髓集合管末端進入內(nèi)髓組織和通過直小血管進入內(nèi)髓組織減少，髓組織尿素濃度顯著低于野生型小鼠，而內(nèi)髓Na+，K+和Cl-濃度與野生型小鼠無明顯差異，證實UT 功能性敲除通過破壞腎內(nèi)尿素循環(huán)，減小內(nèi)髓組織尿素產(chǎn)生的滲透壓梯度，導致尿濃縮能力降低。

2.4 不同尿素通道敲除小鼠模型尿指標比較

UT 亞型功能缺失小鼠的相對尿量比較結果顯示，全部UT 敲除小鼠>UT-A1/A3 雙敲除小鼠≥UT-A1 敲除小鼠>UT-B 敲除小鼠>UT-A3 缺失小鼠>UT-A2 敲除小鼠≥野生型小鼠；相對尿滲透壓排序為：UT-A1/A3 雙敲除小鼠≤全部UT 敲除小鼠

3 尿素通道抑制劑的篩選方法

3.1 紅細胞裂解篩選模型

由于紅細胞較易獲得且天然高表達水通道蛋白1（aquaporin-1，AQP1）和UT-B，紅細胞裂解篩選模型適用于高通量篩選UT 抑制劑［31］。2007 年，VERKMAN 團隊［31］開發(fā)了一種應用紅細胞裂解高通量篩選UT-B 抑制劑的實驗模型，該模型的原理基于紅細胞膜上AQP1 對水的通透及UT-B對尿素的通透（圖3A）。該篩選模型操作簡單、方便。首先將紅細胞置于含2 mol·L-1尿素或尿素類似物乙酰胺的磷酸鹽緩沖溶液中孵育2 h，使紅細胞內(nèi)尿素濃度達到2 mol·L-1，再將紅細胞迅速置于等滲磷酸鹽緩沖溶液中。由于紅細胞內(nèi)外的滲透壓差的作用，水通過AQP1 快速進入紅細胞，使紅細胞體積膨脹。而尿素則在細胞內(nèi)外尿素濃度差的作用下，快速通過UT-B 轉(zhuǎn)移至細胞外，使紅細胞內(nèi)外的滲透壓迅速到達平衡，紅細胞體積恢復正常。如有UT 抑制劑存在，其將抑制尿素通過UT-B出細胞，細胞內(nèi)外保持高滲透壓差，促使水持續(xù)通過AQP1進入細胞，最終導致紅細胞脹破。通過檢測紅細胞破裂所產(chǎn)生的血紅蛋白的量，可發(fā)現(xiàn)對UT 有抑制作用的線索化合物。

3.2 停留實驗

停留實驗（stopped-flow）可用于研究溶液體系的毫秒級動力學過程，是驗證UT 抑制劑特異性和有效性的常用方法（圖3B）。將紅細胞懸液與高濃度尿素溶液在stopped-flow儀器混勻小室中快速接觸。細胞外高濃度尿素形成的高滲透壓促使細胞內(nèi)水通過AQP1快速流出，導致紅細胞皺縮，隨后尿素在細胞內(nèi)外濃度差的作用下進入細胞，使細胞內(nèi)外的滲透壓差發(fā)生逆轉(zhuǎn)，導致水回流入紅細胞中，使細胞膨脹。紅細胞的體積變化會影響穿過混勻小室的散射光的量，測量530 nm處90°散射光強度可定量分析細胞的體積變化，進而計算紅細胞細胞膜對尿素的通透性［32］。

3.3 細胞熒光指示法篩選模型

UT-A1 較UT-B 更適合作為利尿藥靶點，因此需要一種能高通量篩選UT-A1 抑制劑的細胞模型。FROHLICH 等［33］將UT-A1 基因克隆到pcDNA5/FRT 中，并轉(zhuǎn)染到具有完整翻轉(zhuǎn)酶（flippase，F(xiàn)lp）重組靶位點的Madin-Darby 犬腎細胞MDCK中。毛喉素和精氨酸血管加壓素可增加UT-A1的磷酸化，促進其從細胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜，介導尿素的跨膜通透。利用14C標記的尿素分子觀察穩(wěn)定表達UT-A1的MDCK細胞對尿素的通透速率，可檢測UT抑制劑對UT-A1的抑制作用?；陬愃频脑?，將黃色熒光蛋白YFP-H148Q/V163S，AQP1和UT-A1（或UT-B）基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入MDCK 細胞系，將MDCK細胞系培養(yǎng)于黑壁96孔培養(yǎng)板，對Cl-敏感的YFP-H148Q/V163S 能指示細胞體積的變化。減小細胞體積可使細胞內(nèi)Cl-濃度增加，從而導致YFP熒光降低（圖3C）。將細胞置于尿素溶液中，由于細胞外尿素濃度引起的滲透壓差變化會驅(qū)使水外流和細胞的皺縮，進而尿素和水進入細胞恢復細胞的正常體積?？赏ㄟ^檢測不同濃度的尿素濃度梯度下熒光信號強度變化，計算細胞體積的改變速率，分析細胞膜對尿素通透性，篩選和評價UT-A1抑制劑的作用［34］。

4 已發(fā)現(xiàn)的尿素通道抑制劑

4.1 尿素類似物

適合臨床的新型利尿藥還需進一步研究。1970 年，MACEY 和FARMER［35］研究發(fā)現(xiàn)，根皮素可在不顯著改變水滲透系數(shù)的情況下，抑制尿素的滲透系數(shù)。硫脲類等尿素類似物在50～100 mmol·L-1的濃度下可有效改變紅細胞對尿素的通透速率，也可抑制離體內(nèi)髓集合管對尿素的通透［31，36］。但這些UT 抑制劑的半數(shù)有效劑量過大，缺乏成藥性。2012 年，CIL 等［37］發(fā)現(xiàn)，使用尿素類似物二甲基硫脲（圖4A）對UT-A1和UT-B抑制作用的IC50值分別為6.6和3.9 mmol·L-1，可顯著增加尿量，降低尿滲透壓。二甲基硫脲作用迅速、持續(xù)和可逆，對低蛋白飲食的大鼠利尿作用較差，且對血漿Na+，K+和Cl-的水平無明顯影響，提示二甲基硫脲可用于確認UT作為利尿藥靶點，但有效劑量太高，不適于新型利尿藥的開發(fā)［31］。隨后，ESTEVA-FONT等［38］測量了36個硫脲類似物對UT-A1和UT-B抑制活性，發(fā)現(xiàn)3-硝基苯基-硫脲（圖4B）對UT-A1 和UT-B 的抑制作用的IC50均為0.2 mmol·L-1；而4-硝基-苯基硫脲是一種選擇性UT-A1 抑制劑，對UT-A1 和UT-B 抑制作用的IC50分別為1.3 和10 mmol·L-1。然而，以上化合物的藥理學特性較差，在臨床上不適合研發(fā)成為新型利尿藥。

4.2 UT-B小分子抑制劑

圖3 尿素通道抑制劑的篩選和藥效學評價實驗模型.A：紅細胞裂解模型；B：停留實驗（stopped-flow）模型；紅細胞懸液溶于等滲PBS溶液，而高濃度尿素溶于等滲PBS溶液制成高滲溶液；C：熒光指示方法篩選模型；RBC：紅細胞；AQP1：水通道蛋白1；YFP：黃色熒光蛋白；→：移動方向.

圖4 已發(fā)現(xiàn)的尿素通道抑制劑的化學結構.

UT-B 小分子抑制劑還需進一步改進。迄今，通過對不同小分子化合物庫的高通量篩選，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種具有明顯UT-B 抑制活性的小分子化合物［34］。利用紅細胞裂解篩選模型，VERKMAN 團隊［31］發(fā)現(xiàn)了近30種小分子UT-B抑制劑，主要包括苯磺酰唑類（圖4C）、苯磺酰胺類（圖4D）、氨基酞嗪類（圖4E）和氨基苯并咪唑類活性化合物（圖4F）。具有苯磺酰胺結構的化合物（ureainh）-201 對人UT-B 的抑制活性達微摩爾以下水平（IC50=0.3 μmol·L-1），但對小鼠和大鼠UT-B 的抑制作用弱，藥物濃度25 μmol·L-1仍未顯示出抑制作用，限制了其進一步的動物實驗研究［31］。氨基酞嗪類化合物PU1424，對人和小鼠UT-B 的IC50值分別為0.02和0.69 μmol·L-1，該化合物抑制作用部位在UT-B的So位點，對UT 通透尿素的抑制作用是可逆的［39］。但這些化合物在體內(nèi)均無利尿活性。隨后，YAO等［40］通過紅細胞裂解模型從10萬個化合物中發(fā)現(xiàn)三唑并噻吩并嘧啶類化合物具有明顯的UT-B抑制活性，其中抑制率最高的化合物為UTBinh-14（圖4G），該化合物對人UT-B和大鼠UT-B的IC50分別為10 和25 nmol·L-1，可完全可逆地抑制尿素的轉(zhuǎn)運。UTBinh-14通過作用于UT-B 通道的細胞內(nèi)位點，對尿素的轉(zhuǎn)運產(chǎn)生競爭性抑制作用。同時研究發(fā)現(xiàn)，UTBinh-14 對UT-B 具有高度選擇性，即使在較高濃度下，對UT-A1也無抑制作用。UTBinh-14由于其在肝微粒體中的快速代謝且對UT-A1 無活性而不適合作為臨床應用的利尿藥［34，41］。

4.3 UT-A1小分子抑制劑

已發(fā)現(xiàn)的UT-A1抑制劑雖具有體外抑制活性，但多數(shù)在體內(nèi)無明顯的利尿作用。ESTEVAFONT 等［34］使用YFP，UT-A1 和AQP1 共轉(zhuǎn)染的MDCK細胞高通量篩選UT-A1小分子抑制劑，發(fā)現(xiàn)了具有UT-A1選擇性或UT-A1/UT-B非選擇性抑制活性的小分子，包括8-羥基喹啉類（圖4H）、氨基噻唑啉類（圖4I）和［1，3，5］三嗪類（圖4J），其非競爭性地抑制對尿素通透。同時，它們對競爭性抑制尿素轉(zhuǎn)運功能的三唑并噻吩并嘧啶類化合物進行結構優(yōu)化后得到化合物UTA1inh-D1，對UT-A1有較高的選擇性，抑制UT-A1 和UT-B 的IC50值分別為3.8和15 μmol·L-1。同時，他們的研究結果表明，8-羥基喹啉類、氨基噻唑啉類抑制劑的結合位點位于細胞內(nèi)通透尿素的孔隙附近，而［1，3，5］-三嗪類藥物則位于細胞外通透尿素的孔隙附近。LEE 等［42］發(fā)現(xiàn)的2，7-雙取代芴酮（圖4K）是一種新型的UT-A和UT-B抑制劑，它們與UT-A1在胞質(zhì)的區(qū)域結合，可非競爭性地、可逆地抑制UT-A1活性。上述抑制劑雖具有體外抑制活性，但在體內(nèi)均無明顯的利尿作用。2018年，LEE等［43］通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)了強效的UT-A1 選擇性抑制劑1，2，4-三唑喹喔啉類化合物，其對UT-A1具有強效的抑制作用。其中活性最強的化合物8ay通過芳基醚連接1，2，4-三唑［4，3-α］喹喔啉與苯磺酰胺，以一種非競爭性機制快速、可逆地抑制UT-A1對尿素的通透，其對UT-A1的IC50約為150 nmol·L-1，對UT-B的IC50約為2 μmol·L-1。在8ay體外代謝實驗中發(fā)現(xiàn)，喹喔啉環(huán)氧化后產(chǎn)生一種代謝穩(wěn)定的7，8-二氟喹喔啉類似物8bl（圖4L），靜脈注射8bl 4 mg·kg-1可使小鼠尿量增加，尿滲透壓降低。

4.4 UT-A1和UT-B共同小分子抑制劑

UT-A1和UT-B共同小分子抑制劑的口服生物利用度有待提高。2013年，楊寶學課題組［32］通過高通量篩選發(fā)現(xiàn)，噻吩并喹啉類化合物PU21對UT-B和UT-A1 都有抑制作用。計算機分子對接分析提示，PU21 與UT-B 分子的ASN289 形成氫鍵，與LEU285 和ALA327 形成很強的范德華力和疏水作用，分子動力學模擬預測PU21 以鉚釘方式結合在UT-B 的功能對接基團，抑制UT-B 通透尿素，從而發(fā)揮其對UT-B的抑制作用［44］。LI等［45］對噻吩并喹啉類化合物的類似物進行篩選，并經(jīng)結構優(yōu)化后得到活性化合物PU14（圖4M），其對人、大鼠和小鼠的UT-B具有明顯的抑制活性。PU14對UT-B敲除小鼠紅細胞的尿素通透性無影響，說明PU14 對UT-B 介導的尿素通透性具有特異性的抑制作用。體內(nèi)藥效學結果表明，PU14 可劑量依賴性地增加大鼠尿量，降低尿滲透壓。PU14 可降低大鼠腎內(nèi)髓滲透壓及尿素濃度，而不影響非尿素溶質(zhì)的濃度，同時PU14 不影響血Na+，K+和Cl-的水平，說明PU14 在發(fā)揮利尿作用的同時不影響電解質(zhì)平衡［45］。REN 等［46］在對PU14 結構優(yōu)化后，得到對UT-B 和UT-A1 抑制活性更強的化合物PU48（圖4N）。大鼠皮下注射PU48 后，出現(xiàn)劑量依賴性地尿量增多，PU48在大鼠體內(nèi)快速吸收和消除，并迅速到達其消化道、肝、腎和膀胱等靶器官［47-48］。但因其溶解度差、生物利用度低和無口服利尿活性等限制了PU48的進一步開發(fā)。通過對噻吩并喹啉的結構修飾，ZHAO等［49］和LI等［50］獲得了新型特異性的UT 抑制劑噻吩并吡啶類化合物。通過結構優(yōu)化，得到化合物8NP（圖4O）和CB-20（圖4P），其對UT-A1和UT-B 的抑制活性幾乎相同，且對大鼠有良好的利尿活性，其水溶性明顯優(yōu)于噻吩并喹啉類UT 抑制劑。給動物皮下注射后，CB-20 產(chǎn)生了良好的利尿活性，血中Na+，K+和Cl-未發(fā)生明顯的改變。長期服用CB-20 可持續(xù)穩(wěn)定地增加尿量。同時，CB-20在大鼠體內(nèi)吸收良好且清除速率較快。但也因其口服生物利用度過低，不宜于進行藥物開發(fā)。

4.5 口服尿素通道小分子抑制劑

口服給藥是一種比較適于臨床長期治療的給藥方式，其具有給藥方式簡便快捷，由胃腸道吸收，不引起皮膚或黏膜損傷等優(yōu)點。為獲得具有口服活性的UT抑制劑，ZHANG等［51］根據(jù)藥物化學的原理篩選了1040 種具有疏水性結構的小分子尿素類似物，并發(fā)現(xiàn)具有二芳基酰胺母核的新型UT 抑制劑，其中化合物1H 是目前發(fā)現(xiàn)的第一個具有口服利尿作用的UT 抑制劑。灌胃給予100 mg·kg-1的1H 后，大鼠尿量明顯增加而尿滲透壓明顯降低，給藥后第0～2 小時出現(xiàn)顯著性差異，給藥后第2～4 小時差異最明顯，利尿效果可持續(xù)6 h，而非尿素溶質(zhì)的排泄量無明顯變化。而連續(xù)給藥的結果顯示，1H可持續(xù)性地增加大鼠尿量、降低尿滲透壓，不影響非尿素溶質(zhì)的排泄量。1H連續(xù)給藥后，大鼠腎內(nèi)髓組織滲透壓和尿素濃度明顯降低，而非尿素溶質(zhì)的濃度無明顯變化，說明1H 主要是通過影響內(nèi)髓組織尿素濃度影響腎內(nèi)髓組織滲透壓梯度。1H 對大鼠UT-A1的IC50（0.097 μmol·L-1）明顯低于對UT-B的IC50（0.64 μmol·L-1），是UT-A1高選擇性的UT抑制劑。分別灌胃給予UT-A1敲除小鼠和UT-B 敲除小鼠100 mg·kg-1的1H，發(fā)現(xiàn)UT-B敲除小鼠在給藥后尿量明顯增加，而UT-A1敲除小鼠的尿量無顯著變化，驗證了1H對UT-A1的選擇性。使用Caco-2細胞模型發(fā)現(xiàn)，1H具有良好的膜通透性，在人胃腸道中具有良好的吸收效果。大鼠體內(nèi)藥動學結果顯示，1H在大鼠胃腸中吸收良好，血藥濃度迅速達到有效水平。血清學指標檢測發(fā)現(xiàn)，1H不導致傳統(tǒng)利尿藥引起的低鉀血癥、低鈉血癥和高尿酸血癥等不良反應，也不影響正常腎功能及糖代謝、脂質(zhì)代謝等生理學過程。然而，1H的口服生物利用度為4.38%，需要通過改進劑型、結構優(yōu)化等方式進一步改善其成藥性。

5 結語

綜上所述，由于目前臨床上常用的利尿藥普遍存在電解質(zhì)失衡等不良反應，研究人員正試圖以UT 為新的利尿藥靶點研發(fā)新型利尿藥。然而目前尚無UT 抑制劑在臨床上用于患者的治療。對UT抑制劑的研發(fā)存在一定的困難：由于UT-B 和UT-A1 結構具有相似性，難以發(fā)現(xiàn)高選擇性抑制UT-A1 的UT 抑制劑；UT-A1 的晶體結構尚未被解析，阻礙了基于結構的UT 抑制劑的研發(fā)；肝硬化、心衰等低鈉性水腫疾病模型的造模方法穩(wěn)定性較差，阻礙了UT抑制劑在疾病模型中的研究；尋找一種口服活性較好且生物利用度高的UT抑制劑是新型利尿藥研發(fā)的瓶頸。具有口服利尿活性的化合物1H 的發(fā)現(xiàn)為UT 抑制劑在臨床的應用帶來了希望，然而1H仍存在血漿穩(wěn)定性差等缺點，尚需對其進行進一步的結構優(yōu)化。隨著對UT-A1 結構解析以及基于結構的藥物篩選方法、化合物結構優(yōu)化技術等不斷成熟，加之藥理學、藥物化學、藥動學和藥劑學等學科的不斷發(fā)展，必將會成功研發(fā)出以UT為靶點的新型利尿藥，其可用于治療充血性心衰、肝硬化腹水、腎病綜合征等低鈉性水腫相關疾病。