雙靶向配體化力達(dá)霉素的急性和亞急性毒性

曹睿，秦秀軍，魏錦萍，葉程，宋文憑，李亮，邵榮光

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050；2.華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山 063020；3.中國(guó)輻射防護(hù)研究院，山西太原 030006）

雙靶向配體化力達(dá)霉素（dual targeting ligandbased lidamycin，DTLL）是由我所自主研發(fā)的一種類似于抗體藥物偶聯(lián)物（antibody-drug conjugate，ADC）功能的免疫融合蛋白，既能發(fā)揮抗體靶向作用，又具有藥物的腫瘤細(xì)胞毒性。DTLL 是由烯二炔類抗生素力達(dá)霉素的發(fā)色團(tuán)和靶向表皮生長(zhǎng)因子受體1/2（epithelial growth factor receptor 1/2，EGFR 1/2）的融合蛋白（包括針對(duì)EGFR1/ 2 的靶向肽與力達(dá)霉素輔基蛋白）經(jīng)過(guò)體外分子重建而獲得［1］。其中，作為細(xì)胞毒效應(yīng)部分的力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)，極易發(fā)生芳構(gòu)化而失活。因此，在構(gòu)建融合蛋白時(shí)，包含了具有穩(wěn)定發(fā)色團(tuán)作用的輔基蛋白。不同于傳統(tǒng)的ADC藥物設(shè)計(jì)思路，DTLL中的靶向肽采用特異性靶向EGFR的配體EGF中C環(huán)的22個(gè)氨基酸殘基和抗人EGFR2（HER-2）單鏈抗體C6.5重鏈的CDR3 區(qū)，即完全實(shí)現(xiàn)了抗體藥物的小型化，使其更容易穿透組織，又能夠攜帶具高效細(xì)胞毒性的力達(dá)霉素發(fā)色團(tuán)到達(dá)腫瘤實(shí)質(zhì)部位發(fā)揮療效。DTLL 作為新型ADC 類藥物，其體外抗腫瘤作用機(jī)制主要為與EGFR/HER-2 高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合，內(nèi)吞入細(xì)胞后引起特定序列的DNA雙鏈斷裂并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，具有強(qiáng)烈的殺傷作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，其明顯抑制卵巢癌［2］、食管癌［3］、乳腺癌和胰腺癌等異種移植瘤的生長(zhǎng)，有望成為一種新型的抗腫瘤藥物。

為促進(jìn)該藥的臨床應(yīng)用，評(píng)價(jià)DTLL 的毒副作用和安全性，并估算其半數(shù)致死濃度（LD50）和最大耐受劑量，本研究通過(guò)急性毒性試驗(yàn)和亞急性毒性試驗(yàn)觀察該藥物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的中毒反應(yīng)及其嚴(yán)重程度［4］，同時(shí)探討其毒性作用可能的靶器官，確定毒性劑量效應(yīng)關(guān)系，為DTLL 進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床安全用藥的劑量設(shè)計(jì)和毒副反應(yīng)監(jiān)測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥物、試劑和儀器

昆明小鼠60 只，雌雄各半，4～5 周齡，SPF 級(jí)；SD 大鼠120 只，雌雄各半，6～7 周齡，SPF 級(jí)；均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，生產(chǎn)許可稱號(hào)SCXK-（京）2014-0013，動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)輻射防護(hù)研究院藥物安全評(píng)價(jià)中心，許可證號(hào)SYXK（晉）2013-0002，由獲得資格認(rèn)證的人員按照動(dòng)物房常規(guī)以標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠內(nèi)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)室溫度為20.3～21.7℃，濕度為46.5%～48.7%，12/12 h 明暗交替，每籠5 只，每周換籠2次；動(dòng)物飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司〔SCXK-（京）2014-0010〕；動(dòng)物墊料，江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司（DB32/T 2129-2012）。DTLL 凍干粉針（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，相對(duì)分子質(zhì)量為1.8×104，純度>95%，批號(hào)：P10327 和P20327）；氯化鈉注射液（石家莊鵬海制藥有限公司）。Histocentre 3 石蠟包埋機(jī)、Finesse 325 石蠟切片機(jī)和Excelsior 全自動(dòng)組織脫水機(jī)（英國(guó)Shandon）；BX53 熒光顯微成像系統(tǒng)（日本Olympus）；HEMAVET 950 全自動(dòng)五分類動(dòng)物血液分析儀（美國(guó)Drew Scientific 公司）；AC9900 電解質(zhì)分析儀（江蘇奧迪康醫(yī)學(xué)科技有限公司）；Konelab PRIME 30 全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）；H-100尿液分析儀（長(zhǎng)春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司）。

1.2 急性毒性試驗(yàn)小鼠分組、給藥和體質(zhì)量測(cè)定

給藥前將小鼠稱重，根據(jù)小鼠體質(zhì)量按分段均衡隨機(jī)分組法分別進(jìn)行分組，每組10只，共6組，分別為正常對(duì)照組及DTLL 1.44，2.05，2.93，4.19 和5.99 mg·m-2組，每組均雌雄各半［5］。與臨床擬用途徑一致，小鼠經(jīng)尾靜脈注射給藥。給藥體積為33.3 mL·m-2，給藥頻次為24 h內(nèi)給藥1次［6］。分別于給藥前及給藥后第3，7和14天（給藥前為第0天，給藥當(dāng)天為第1天）測(cè)體質(zhì)量。

1.3 亞急性毒性試驗(yàn)小鼠分組、給藥及體質(zhì)量和攝食量測(cè)定

給藥前SD 大鼠稱重，根據(jù)大鼠體質(zhì)量按分段均衡隨機(jī)分組法分別進(jìn)行分組，每組30只，共4組，分別為正常對(duì)照組及DTLL 61，122和245 μg·m-2組，每組均雌雄各半［5］。與臨床擬用途徑一致，大鼠經(jīng)尾靜脈注射給藥。給藥體積為34 mL·m-2，每周給藥1 次，連續(xù)給藥4 周，此為給藥期（給藥當(dāng)天為第1 天，第1～28 天為給藥期）；隨繼續(xù)觀察4 周，此為恢復(fù)期（第29～56 天為恢復(fù)期）；共56 d。給藥第1 天測(cè)量大鼠體質(zhì)量和攝食量，每周1 次。每周攝食量（g）=〔每周投放飼料量（g）-每周剩余飼料量（g）〕/每籠大鼠數(shù)。

1.4 生存狀態(tài)的監(jiān)測(cè)

給藥后2～3 h 內(nèi)嚴(yán)密觀察動(dòng)物的毒性反應(yīng)（中毒癥狀、中毒發(fā)生時(shí)間、持續(xù)時(shí)間和恢復(fù)期等）以及動(dòng)物的死亡情況（死亡時(shí)間和瀕死前反應(yīng)等）。記錄所有動(dòng)物的死亡情況和出現(xiàn)的癥狀，以及癥狀的起始時(shí)間、嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間等。實(shí)驗(yàn)期間每天觀察1次，觀察內(nèi)容為動(dòng)物外觀、神經(jīng)系統(tǒng)（行為及反應(yīng)、異常運(yùn)動(dòng)、對(duì)刺激的反應(yīng)和神經(jīng)反射）、呼吸系統(tǒng)（呼吸及其頻率和分泌物）、胃腸系統(tǒng)（糞便性狀和腹部形態(tài)）、泌尿生殖系統(tǒng)（會(huì)陰部污穢和外生殖器腫脹）和眼（眼瞼下垂、眼球突出和震顫等）［7-8］。

1.5 大體解剖檢查

急性毒性試驗(yàn)期間，昆明小鼠中若有死亡立即尸檢，結(jié)束時(shí)所有存活小鼠均進(jìn)行大體解剖檢查。亞急性毒性試驗(yàn)中，在給藥結(jié)束后（第28天）和恢復(fù)期結(jié)束后（第56天）均進(jìn)行解剖學(xué)監(jiān)測(cè)，觀察大鼠是否有外傷、出血、浮腫和腫瘤等，口、鼻、肛門(mén)、陰道等有無(wú)異常分泌物、滲出物及黏膜有無(wú)出血。動(dòng)物處死后進(jìn)行解剖檢查，觀察胸腹部皮下有無(wú)出血、感染等；檢查腹部或胸腔主要組織和臟器的位置、顏色、大小、質(zhì)地等有無(wú)異常，腹腔或胸腔有無(wú)積液及積液的性質(zhì)和量等；檢查咽頸部和腦有無(wú)出血及炎性滲出物，主要組織及臟器有無(wú)異常等［9］。

1.6 組織病理學(xué)檢查

急性毒性試驗(yàn)和亞急性毒性試驗(yàn)中對(duì)各組小鼠或大鼠臟器組織取材，摘取的臟器置4%甲醛中固定24 h 后棄甲醛，重新加4%甲醛繼續(xù)固定48 h 以上，進(jìn)行組織選塊。其中肝組織取2塊，腎組織包括腎皮質(zhì)、髓質(zhì)和腎盂，其他組織各取1塊進(jìn)行組織學(xué)檢查。組織切塊經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后封片，光鏡下進(jìn)行組織病理檢查［10］。

1.7 大鼠血液和尿液指標(biāo)檢查

亞急性毒性試驗(yàn)期間，SD 大鼠給藥結(jié)束后次日（第29天），每組雌雄大鼠各取10只，ip給予戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）麻醉。經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，EDTA-2K 抗凝后采用HEMAVET 950 全自動(dòng)五分類動(dòng)物血液分析儀測(cè)定一般血液學(xué)指標(biāo)，其余分離血清后用相關(guān)儀器測(cè)定生化指標(biāo)。在取血前12～16 h 大鼠禁食?；謴?fù)期結(jié)束次日（第57 天）取全部剩余大鼠，按上述方法取血處死，測(cè)相應(yīng)指標(biāo)。尿液檢查：動(dòng)物用代謝籠采尿，采用試紙條法，使用H-100 尿液分析儀測(cè)定尿液的葡萄糖（glucose，Glu）、膽紅素（bilirubin，Bil）、酮體（ketone body，KET）、尿比重（specific gravity，SG）、潛血（occult blood，BLD）、pH 值、蛋白（protein，PRO）、尿膽素原（urobilinogen，UBG）、亞硝酸鹽（nitrite，NIT）和尿白細(xì)胞（leukocyte，LEU）。尿外觀（顏色、濁度）由肉眼進(jìn)行觀察記錄。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用表示。實(shí)驗(yàn)中SD 大鼠的體質(zhì)量、攝食量、血液學(xué)和生化指標(biāo)數(shù)據(jù)，采用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析法（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。死亡動(dòng)物分布情況采用DAS 1.0統(tǒng)計(jì)軟件以正規(guī)Bliss 法計(jì)算。尿液檢查結(jié)果采用秩和檢驗(yàn)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DTLL急性毒性

2.1.1 DTLL對(duì)小鼠存活的影響

急性毒性試驗(yàn)中，正常對(duì)照組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間全部存活，無(wú)死亡。各實(shí)驗(yàn)組小鼠死亡時(shí)間分布在給藥后第4～12天。其中DTLL 2.05 mg·m-2組雄鼠死亡1 只，DTLL 2.93 mg·m-2組死亡9 只（雌鼠4 只，雄鼠5只），DTLL 4.19和5.99 mg·m-2組雌性小鼠全部死亡（圖1）。經(jīng)Bliss法計(jì)算，DTLL的LD50為2.45 mg·m-2，小鼠存活情況與性別無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。

2.1.2 DTLL對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

試驗(yàn)期間，昆明小鼠未見(jiàn)由于藥物以外原因引起的異常。給藥后第3天，DTLL 4.19和5.99 mg·m-2組體質(zhì)量與正常對(duì)照組相比顯著降低（P<0.01）。給藥后第7 天，DTLL 1.44，2.05 和2.93 mg·m-2組雌鼠體質(zhì)量均顯著低于正常對(duì)照組（P<0.01），4.19 和5.99 mg·m-2組雄鼠體質(zhì)量與正常對(duì)照組相比也明顯降低（P<0.01）。給藥后第14 天，DTLL 1.44 和2.05 mg·m-2組雌、雄小鼠體質(zhì)量均顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05）（圖2A 和B）。表明DTLL 1.44～5.99 mg·m-2劑量范圍內(nèi)可導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量降低，但該影響與性別無(wú)顯著相關(guān)性。

Fig.1 Survival curve of KM mice treated with dual targeting ligand-based lidamycin（DTLL）in acute toxicity test. KM mice were randomly divided into normal control and DTLL 1.44，2.05，2.93，4.19 and 5.99 mg·m-2 groups.DTLL was injected via tail vein once within 24 h.The number of surviving mice was observed every day for additional 14 d.n=10.

Fig.2 Effect of DTLL on body mass of KM mice in acute toxicity. See Fig.1 for the mouse treatment.Mouse body mass was measured before treatment and on the 3rd，7th and 14th day after administration for additional 14 d. ，n=5.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with normal control group.

2.1.3 DTLL對(duì)小鼠生存狀態(tài)的影響

給藥后前3 d，各給藥組昆明小鼠均未觀察到明顯異常癥狀。第4天，DTLL 4.19和5.99 mg·m-2組部分小鼠出現(xiàn)被毛不光滑、行動(dòng)遲緩、眼瞼閉合等癥狀，并有小鼠開(kāi)始陸續(xù)死亡；第8天，DTLL 2.93 mg·m-2組部分小鼠也出現(xiàn)上述癥狀，并開(kāi)始陸續(xù)死亡；第10 天，DTLL 2.05 mg·m-2組1 只雄鼠死亡；第14天，DTLL 2.05 mg·m-2組部分小鼠出現(xiàn)被毛不光滑癥狀，DTLL 2.93 mg·m-2組存活小鼠仍有被毛不光滑、行動(dòng)遲緩等癥狀。正常對(duì)照組和DTLL 1.44 mg·m-2組小鼠未觀察到明顯異常癥狀。小鼠癥狀出現(xiàn)時(shí)間和死亡時(shí)間、死亡數(shù)量均有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示DTLL可能有延遲性毒性。

2.1.4 DTLL對(duì)小鼠臟器的影響

試驗(yàn)期間正常對(duì)照組小鼠解剖觀察無(wú)任何異常。死亡小鼠主要集中在DTLL 2.93，4.19 和5.99 mg·m-2組，其主要病變?yōu)槠は?、胃和腸淺黃色或黃色，腸出血，肝、脾和腎灰白色等。觀察14 d結(jié)束后的存活小鼠：DTLL 2.05 mg·m-2組小鼠主要病變?yōu)楦顾?，胃腸局部出血，肝、脾和腎顏色變淺；DTLL 2.93 mg·m-2組小鼠主要病變?yōu)楦魏推㈩伾儨\；DTLL 1.44 mg·m-2組小鼠未觀察到明顯異常。

2.1.5 DTLL對(duì)小鼠臟器病理變化的影響

DTLL 2.05，2.93，4.19和5.99 mg·m-2組小鼠給藥后脾出現(xiàn)萎縮，邊緣區(qū)消失，甚至白髓消失，隨后出現(xiàn)不同程度的紅系、粒系、巨核系的髓外造血，以及腸不同程度的急性出血，提示DTLL 可能引起造血功能的障礙，同時(shí)也出現(xiàn)淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞增生，提示其可能引起免疫抑制。DTLL 對(duì)于肝的影響主要表現(xiàn)為大劑量組出現(xiàn)肝細(xì)胞嗜酸性病變、核皺縮，多發(fā)灶狀肝細(xì)胞壞死，以及后期出現(xiàn)的肝細(xì)胞再生等病理變化，表明其可引起明顯的肝毒性。而對(duì)腎的影響主要表現(xiàn)為不同程度的腎小管上皮細(xì)胞腫脹，且部分腎的局部腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落，在后期病變程度明顯減輕，提示藥物可能會(huì)引起輕度的腎損傷［11］（圖3）。

2.2 DTLL亞急性毒性

2.2.1 DTLL對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

試驗(yàn)期間（給藥期+恢復(fù)期）未見(jiàn)正常對(duì)照組大鼠死亡。給藥第1 天開(kāi)始測(cè)量大鼠體質(zhì)量，每周1次。各給藥組雌性大鼠體質(zhì)量與正常對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從給藥第8天開(kāi)始至給藥期結(jié)束，各給藥組雄性大鼠體質(zhì)量均低于正常對(duì)照組（P<0.01），且有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系（P<0.01，r=0.98）。至恢復(fù)期末，DTLL 122 和245 μg·m-2組體質(zhì)量與正常對(duì)照組的差距逐漸增大。其中，在給藥期1 周后和恢復(fù)期的7 次體質(zhì)量測(cè)量，DTLL 245 μg·m-2組雄性大鼠均顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05；P<0.01）；在給藥期1 周后和恢復(fù)期2 周后的5 次體質(zhì)量測(cè)量中，與正常對(duì)照組比，DTLL 122 μg·m-2組顯著下降（P<0.05；P<0.01）；而DTLL 61 μg·m-2組雄性大鼠體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖4A 和B）。以上結(jié)果表明，DTLL對(duì)雌性大鼠體質(zhì)量影響不大，但大劑量對(duì)雄性大鼠體質(zhì)量有明顯影響，提示DTLL 對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響可能與性別有關(guān)。

Fig.3 Histopathological examination of various organs of KM mice treated with DTLL in acute toxicity test（HE staining）.See Fig.1 for the mouse treatment.The black arrows show extramedullary hematopoiesis，shrinking spleens，small intestinal bleeding and cellular necrosis in livers and kidneys.

Fig.4 Effect of DTLL on body mass of SD rats in subacute toxicity test.SD rats were randomly divided into normal control and DTLL 61，122 and 245 μg·m-2 groups，respectively.DTLL was administered by injection in rat tail vein，once a week for 4 weeks before the rats were left recovering for 4 weeks after drug withdrawal.Body mass of rats was measured every week during experiments. ，n=15.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with normal control group.

2.2.2 DTLL對(duì)大鼠攝食量的影響

給藥第5 天開(kāi)始測(cè)量大鼠攝食量，每周1 次。各給藥組雌性大鼠攝食量與正常對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從給藥第12天開(kāi)始至恢復(fù)期結(jié)束，各給藥組雄性大鼠攝食量均低于正常對(duì)照組（P<0.05），且與劑量有關(guān)（P<0.05，r=0.95）。其中，給藥第2，3和4周，DTLL 245 μg·m-2組雄性大鼠攝食量顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05）；給藥第2 周，DTLL 122 μg·m-2組雄性大鼠攝食量與正常對(duì)照組比較也顯著減少（P<0.05）；但給藥期間，DTLL 61 μg·m-2組雄性大鼠的攝食量與正常對(duì)照組比均無(wú)差異；恢復(fù)期期間，各組例數(shù)較少而未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（圖5）。結(jié)果表明，DTLL 61，122和245 μg·m-2對(duì)雌性大鼠攝食量影響不大，但122 和245 μg·m-2對(duì)雄性大鼠的攝食量有影響，提示其對(duì)大鼠攝食量的影響也與性別有關(guān)。

2.2.3 DTLL對(duì)大鼠生存狀態(tài)的影響

給藥前，實(shí)驗(yàn)大鼠行為活動(dòng)正常，外觀體征無(wú)異常，糞便顏色和形狀均正常。給藥期間，各給藥組均未觀察到明顯異常癥狀?；謴?fù)期第4 周，DTLL 122 μg·m-2組有2 只雄性大鼠出現(xiàn)消瘦、被毛不光滑癥狀；DTLL 245 μg·m-2組有2 只雌性大鼠死亡，1只雄性大鼠出現(xiàn)明顯的消瘦癥狀。

Fig.5 Food consumption of SD rats treated with DTLL in subacute toxicity test.See Fig.4 for the rat treatment.Food intake of SD rats was measured every week during experiments.，n=15.＊P<0.05，compared with normal control group.

2.2.4 DTLL對(duì)大鼠臟器的影響

給藥結(jié)束后，各給藥組SD 大鼠可見(jiàn)肝表面灶狀暗紅色，呈淤血狀，胃壁及腸壁血管擴(kuò)張、充盈、呈淤血狀等變化?；謴?fù)期結(jié)束時(shí)，DTLL 61 μg·m-2組可見(jiàn)肝體積增大和雙腎淤血偏深紅，其余未見(jiàn)異常。DTLL 122 μg·m-2組可見(jiàn)輕度腹水，脾體積增大；肝色灰白；雙側(cè)腎體積增大。DTLL 245 μg·m-2組主要可見(jiàn)胸或腹腔積液，肝體積增大，色深紅或黑色，肺局部或全肺呈深紅色、淤血狀，脾體積增大，雙側(cè)腎體積增大等。

2.2.5 DTLL對(duì)大鼠臟器組織病理變化的影響

給藥結(jié)束時(shí)，各劑量組的個(gè)別SD 大鼠心臟出現(xiàn)心肌炎、心肌間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)以及心肌纖維溶解。脾主要為生發(fā)中心增大、邊緣區(qū)變窄或消失等。此外，DTLL 61和122 μg·m-2組脾還有白髓數(shù)量減少、血管充血、出血等變化。骨髓的主要組織病理學(xué)變化為成熟粒細(xì)胞增加、粒系細(xì)胞減少、嗜酸性粒細(xì)胞增多等，并且病變主要集中在DTLL 122和245 μg·m-2組。

恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，DTLL 122和245 μg.m-2組個(gè)別大鼠出現(xiàn)心肌纖維溶解、心肌纖維化、心肌炎、小動(dòng)脈管壁增厚和玻璃樣病變。肝組織病理變化主要出現(xiàn)在恢復(fù)期結(jié)束，表現(xiàn)為纖維組織增生、肝竇擴(kuò)張、充血、出血、肝細(xì)胞萎縮、肝細(xì)胞水樣變、肝細(xì)胞脂肪變等，其中以DTLL 245 μg·m-2組表現(xiàn)較為明顯。脾組織病理變化在DTLL 122 μg·m-2組，主要為生發(fā)中心增大、髓外造血、白髓數(shù)量減少、紅髓充血、出血等；DTLL 245 μg·m-2組主要為白髓淋巴細(xì)胞減少、邊緣區(qū)變窄/消失、髓外造血。肺組織病理變化主要為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡腔或間質(zhì)水腫、肺泡壁或血管充血等。腎組織病理變化也主要出現(xiàn)在恢復(fù)期，表現(xiàn)為腎小球節(jié)段性壞死、腎小管嗜堿性變、管型、腎小管上皮細(xì)胞腫脹或水樣變等，且病變主要集中在大劑量組。骨髓病理變化在DTLL 122 μg·m-2組，主要表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞增多、粒系細(xì)胞減少、紅系細(xì)胞增多、脂肪細(xì)胞增多；DTLL 245 μg·m-2組骨髓變化主要表現(xiàn)為巨核細(xì)胞增多、有核細(xì)胞減少（圖6）。

2.2.6 DTLL對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

Fig.6 Effect of DTLL on histopathological changes of various organs of SD rats treated with DTLL in subacute toxicity test（HE staining）.See Fig.4 for the rat treatment.On the 56th day，the pathological changes were detected.The black arrows show inflammation of myocardial cells，hepatocyte lesion，enlargement in the splenic germinal center，infiltration of pulmonary inflammatory cells in the lung，renal tubular eosinophilic lesion and bone marrow eosinophilia in rats，respectively.

給藥結(jié)束后，與正常對(duì)照組相比，DTLL 245 μg·m-2組雌性大鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)（white blood cell count，WBC）、紅細(xì)胞分布寬度（red blood cell volume distribution width，RDW）和血小板計(jì)數(shù)（platelet，PLT）顯著增高（P<0.05，P<0.01），雄性大鼠WBC顯著升高（P<0.05）；其余血液學(xué)指標(biāo)中，各給藥組與正常對(duì)照組比較無(wú)差異?；謴?fù)期結(jié)束后（第56天），DTLL 245 μg·m-2組雌性大鼠的WBC、紅細(xì)胞壓積（hematocrit，HCT）、平均紅細(xì)胞體積（mean corpuscular volume，MCV）和平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（mean corpsular hemoglobin，MCH）與正常對(duì)照組相比顯著升高，其雄性大鼠WBC 仍顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05，P<0.01）；122 μg·m-2組雄性大鼠紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（red blood cell count，RBC）和血紅蛋白（hemoglobin，Hb）則顯著低于正常對(duì)照組（P<0.05，P<0.01）（表1和表2）。提示DTLL 245 μg·m-2主要引起WBC升高及雌性大鼠RDW和PLT升高，停藥后WBC 和RDW 未見(jiàn)恢復(fù)；停藥后DTLL 122 μg·m-2組雄性大鼠RBC和Hb降低。其余指標(biāo)與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（數(shù)據(jù)略）。

2.2.7 DTLL對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

給藥結(jié)束后，各給藥組雌性大鼠血清生化指標(biāo)與正常對(duì)照組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表3）。122 μg·m-2組雄性大鼠血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）低于正常對(duì)照組（P<0.05，P<0.01），DTLL 245 μg·m-2組雄性大鼠血清總膽固醇（total cholesterol，TCHO）顯著高于正常對(duì)照組（P<0.05）（表3）?；謴?fù)期結(jié)束后，DTLL 245 μg·m-2組雌鼠和雄鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamate pyruvate transaminase，GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，GOT）水平顯著高于正常對(duì)照組（P<0.01，P<0.05），尿素氮（urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，CREA）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、TCHO、甘油三酯（triglyceride，TG）、尿酸（uric acid，UA）、CK 和LDH 水平無(wú)明顯變化（表4）。提示DTLL 245 μg·m-2可使大鼠在恢復(fù)期GPT和GOT顯著升高，對(duì)其他指標(biāo)無(wú)明顯影響（數(shù)據(jù)略）。

2.2.8 DTLL對(duì)大鼠尿液指標(biāo)的影響

給藥結(jié)束后，DTLL 245 μg·m-2組雄性大鼠尿PRO 和LEU 與正常對(duì)照組比較顯著升高（P<0.01），雄雌性大鼠的尿SG與正常對(duì)照組比較也顯著增大（P<0.05，P<0.01）（表5）?；謴?fù)期結(jié)束后，DTLL 245 μg·m-2組雌性和雄性大鼠尿PRO 和LEU 與正常對(duì)照組比較仍有升高（P<0.05）；同時(shí)DTLL 122 μg·m-2組雄性大鼠的BLD，PRO，LEU和pH 值與正常對(duì)照組比較亦顯著升高（P<0.05）。由此表明，DTLL 245 μg·m-2可使大鼠尿液PRO 和LEU 異常，停藥后未見(jiàn)恢復(fù)。DTLL 122 μg·m-2停藥后還可引起雄性大鼠出現(xiàn)BLD，PRO，LEU和pH值等升高（P<0.05）（表6）。其余指標(biāo)與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯變化（數(shù)據(jù)略）。

Tab.1 Effect of DTLL on hematological indexes of SD rats during administration period

Tab.2 Effect of DTLL on hematological paramenters of SD rats during convalescence period

Tab.3 Effect of DTLL on blood biochemical indexes of SD rats during administration period

Tab.4 Effect of DTLL on blood biochemical indexes of SD rats during convalescence period

Tab.5 Effect of DTLL on urine indexes of SD rats during administration period

Tab.6 Effect of DTLL on urine indexes of SD rats during convalescence period

3 討論

DTLL 是一種新型抗體偶聯(lián)藥物，在體外可特異性與高表達(dá)EGFR/HER-2的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞后引起特定序列的DNA雙鏈斷裂，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)烈殺傷作用，對(duì)多種裸鼠的人體移植腫瘤也都有顯著療效（4，9）。但必須慎重關(guān)注DTLL 可能產(chǎn)生的毒副反應(yīng)，以便安全合理用藥。

本研究急性毒性試驗(yàn)中，根據(jù)各組小鼠死亡情況，計(jì)算得出DTLL的LD50為2.45 μg·m-2。尾靜脈注射給予DTLL后，小鼠癥狀出現(xiàn)時(shí)間和死亡時(shí)間、死亡數(shù)量均有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，DTLL>2.05 mg·m-2劑量的給藥組顯示延遲性毒性，可引起免疫抑制，造血功能障礙及肝、腎毒性。亞急性毒性實(shí)驗(yàn)中，給藥期間各給藥組SD 大鼠均無(wú)明顯的異常癥狀，停藥后第4 周，各劑量組出現(xiàn)死亡和其他明顯癥狀。結(jié)合恢復(fù)期大鼠體質(zhì)量和攝食量的變化，也提示DTLL存在延遲性毒性［11］。此外，給予不同劑量的DTLL 會(huì)引起SD 大鼠WBC，RDW，PLT，GPT，GOT，TCHO和TG不同程度的變化，還發(fā)現(xiàn)肝、腎、脾和肺均會(huì)出現(xiàn)不同程度的組織病變，提示DTLL具有肝、腎毒性［12］，同時(shí)脾和肺也是DTLL作用的靶器官。本研究還發(fā)現(xiàn)，DTLL 122 和245 mg·m-2組大鼠CK和LDH在給藥結(jié)束以及恢復(fù)期結(jié)束期間都有一定程度的降低，組織病理學(xué)檢查可見(jiàn)個(gè)別大鼠有心肌炎、心肌纖維溶解等變化，但病變均為散在分布，還不能判定DTLL具有心臟毒性。

力達(dá)霉素中的發(fā)色團(tuán)屬于細(xì)胞周期非特異性的細(xì)胞毒性藥物，它與DNA小溝相互作用并造成特定序列的DNA 斷裂，同時(shí)還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。關(guān)于這一類細(xì)胞毒性藥物，對(duì)于骨髓造血細(xì)胞的毒性通常表現(xiàn)為骨髓抑制、造血功能障礙和免疫抑制等。同時(shí)，由于其作用沒(méi)有靶向性和特異性，也會(huì)對(duì)一些正常的實(shí)質(zhì)性器官造成損傷。故本研究在急性毒性和亞急性毒性實(shí)驗(yàn)中均可發(fā)現(xiàn)，DTLL所引起的造血功能障礙和免疫抑制以及肝、腎、脾、肺的毒性，這些結(jié)果并不令人意外。眾所周知，EGFR和HER-2廣泛分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面，DTLL中抗EGFR/HER-2 的靶向肽活性可能產(chǎn)生對(duì)下游通路的阻斷作用，從而導(dǎo)致系統(tǒng)性毒副作用；并能減少其發(fā)色團(tuán)部分的細(xì)胞毒活性在正常組織器官中的蓄積，減緩發(fā)色團(tuán)對(duì)肺和腎的強(qiáng)烈毒性損傷；而由于靶向肽的存在，DTLL 與力達(dá)霉素單獨(dú)給藥相比其半衰期增加，可能延長(zhǎng)了其體內(nèi)滯留時(shí)間，表現(xiàn)出延遲性毒性反應(yīng)，故而使DTLL 僅表現(xiàn)為較為耐受的輕微損傷。同時(shí)，與傳統(tǒng)ADC 藥物相比，盡管DTLL 的靶向性稍弱于完整單抗偶聯(lián)而成的ADC，但其半衰期較短，可通過(guò)多次重復(fù)給藥而保持其療效較好地發(fā)揮。這也體現(xiàn)了DTLL作為新型ADC類藥物增效減毒的特性。當(dāng)然，在后續(xù)臨床試驗(yàn)中，還應(yīng)密切實(shí)時(shí)地關(guān)注DTLL治療后對(duì)各臟器、各項(xiàng)生化指標(biāo)的影響，預(yù)防延遲毒性的發(fā)生。

此外，本研究還存在一些局限性。在急性毒性試驗(yàn)中，由于各給藥組小鼠數(shù)量較少且大劑量組死亡較多，未發(fā)現(xiàn)各個(gè)檢測(cè)指標(biāo)與小鼠性別的相關(guān)性。但當(dāng)亞急性毒性試驗(yàn)中大鼠數(shù)量較多時(shí)，發(fā)現(xiàn)雄性大鼠在體質(zhì)量和攝食量方面對(duì)DTLL的敏感程度大于雌性大鼠，而對(duì)其他檢測(cè)指標(biāo)而言，并未發(fā)現(xiàn)指標(biāo)變化與大鼠性別的聯(lián)系，這有待進(jìn)行后續(xù)研究，以確定藥物毒性反應(yīng)與動(dòng)物性別間的相關(guān)系。

綜上所述，DTLL 作為一種雙特異性靶向腫瘤的新型抗體偶聯(lián)藥物，治療劑量時(shí)具有強(qiáng)效抗腫瘤作用，但在毒性劑量時(shí)也存在著一定的毒副反應(yīng)和延遲性毒性，且治療劑量與毒性劑量差異較小，提示其治療窗口較窄，在給藥過(guò)程中一定要控制好DTLL 的給藥劑量和時(shí)間，在確保療效的同時(shí)盡可能地規(guī)避不良反應(yīng)［13］。本研究結(jié)果為推進(jìn)DTLL的臨床研究提供了理論依據(jù)。