腦微透析技術(shù)在毒品領(lǐng)域中的應(yīng)用及展望

李鋒，魏佳韻，陳園園，喬艷玲，3，李香豫，王優(yōu)美，3，徐鵬，3，狄斌

（1.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210009；2.國(guó)家禁毒委員會(huì)辦公室-中國(guó)藥科大學(xué)禁毒關(guān)鍵技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.公安部禁毒情報(bào)技術(shù)中心毒品監(jiān)測(cè)管控與禁毒關(guān)鍵技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

腦微透析（brain microdialysis，B-MD）技術(shù)是一種以透析原理為基礎(chǔ)，并結(jié)合灌流取樣的腦部微量采樣技術(shù)，通過與高靈敏度分析技術(shù)結(jié)合，即可對(duì)腦細(xì)胞外液物質(zhì)（包括內(nèi)源性和外源性）進(jìn)行快速有效的定量分析，具有活體采樣、采樣量小、動(dòng)態(tài)觀察、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和定量分析等特點(diǎn)［1-2］。美國(guó)DELGADO等［3］在1972 年首次采用B-MD 技術(shù)分析恒河猴腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）的釋放，開啟了微透析技術(shù)在腦研究領(lǐng)域應(yīng)用的大門。20世紀(jì)90年代以來，B-MD技術(shù)已在藥物研究、神經(jīng)科學(xué)和腫瘤研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［4-6］，并不斷發(fā)展和完善。2005 年，CMA600 微透析分析儀獲得美國(guó)FDA 批準(zhǔn)用于臨床。此后，隨著B-MD技術(shù)在腦膠質(zhì)瘤研究方面應(yīng)用越發(fā)成熟，國(guó)外社區(qū)醫(yī)院已可以開展患者的常規(guī)B-MD監(jiān)測(cè)［7］。目前，B-MD技術(shù)已應(yīng)用于毒品研究領(lǐng)域，并取得了一些探索性的成果。

1 B-MD技術(shù)基本原理和特點(diǎn)

B-MD技術(shù)是一種在活體腦內(nèi)進(jìn)行生化微量采樣的技術(shù)，可用于分析和監(jiān)測(cè)腦內(nèi)藥物及其代謝物、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子和能量代謝產(chǎn)物等物質(zhì)，從而研究與待測(cè)物質(zhì)相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展、病理過程、治療方法和治療效果等。在非平衡條件下，當(dāng)腦組織液中待測(cè)物質(zhì)的濃度較高時(shí)，這些小分子物質(zhì)會(huì)擴(kuò)散至埋植在腦組織中的微透析探針中，從而進(jìn)入透析液。透析管內(nèi)液體不斷流動(dòng)并通過半透膜進(jìn)入待測(cè)組織，使得半透膜兩側(cè)跨膜濃度差一直存在，小分子物質(zhì)會(huì)不斷從腦細(xì)胞外液擴(kuò)散至透析管中，再以一定的時(shí)間間隔使用微量收集管收集透析液，擴(kuò)散出的小分子物質(zhì)被收集后進(jìn)行化學(xué)成分分析，以監(jiān)測(cè)和分析腦細(xì)胞外液中各種待測(cè)物質(zhì)的含量變化和釋放形式，是研究腦細(xì)胞外液中待測(cè)物質(zhì)濃度-時(shí)間變化的一種重要方法。

B-MD 系統(tǒng)由透析液、探針、微量注射泵、微量收集管及連接管等組成（圖1）。透析液應(yīng)與腦細(xì)胞外液滲透壓相等，常用的有林格液、人工腦脊液、生理鹽水和其他液體，目前實(shí)驗(yàn)常用的是林格液。探針是B-MD系統(tǒng)的核心部件，包括透析膜、進(jìn)液管和出液管。根據(jù)探針的形態(tài)可分為同心圓型、水平型、Ⅰ型和U型。同心圓型探針是目前應(yīng)用最廣泛的，也是B-MD 適用的探針類型。微透析系統(tǒng)與分析系統(tǒng)的聯(lián)用即可實(shí)現(xiàn)B-MD 在線分析監(jiān)測(cè)的目的。常用的分析儀器有高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)器（high performance liquid chromatography with electrochemical detector，HPLC-ECD）、高效液相色譜-熒光檢測(cè)器（HPLC with fluorescence detector，HPLC-FLD）、液相-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography with mass spectrometry，LC-MS）、高效毛細(xì)管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）等。生產(chǎn)微透析設(shè)備的公司主要有美國(guó)的BAS公司、瑞典的CMA公司和日本的EICOM公司。

圖1 腦微透析系統(tǒng)示意圖.

目前，可用于研究腦內(nèi)藥物濃度和神經(jīng)遞質(zhì)變化的技術(shù)還有正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)和磁共振波譜分析技術(shù)［8-9］。相比這2種技術(shù)，B-MD技術(shù)具有無需標(biāo)記、時(shí)間分辨率高、空間分辨率高、操作較簡(jiǎn)單和成本較低等優(yōu)勢(shì)［10］，因而愈發(fā)受到研究人員的關(guān)注，應(yīng)用范圍得到不斷地拓展。但B-MD 技術(shù)也存在一定的缺點(diǎn)，如手術(shù)對(duì)腦組織有一定損傷性、采樣量少和待測(cè)物質(zhì)濃度低等。

2 B-MD技術(shù)在毒品領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.1 B-MD技術(shù)在毒品腦局部藥動(dòng)學(xué)研究中的應(yīng)用

毒品腦局部藥動(dòng)學(xué)（pharmacokinetics，PK）是研究毒品在生物體腦內(nèi)的過程，定量分析毒品在腦內(nèi)所發(fā)生的變化及變化規(guī)律，是毒品研究的重要組成部分。傳統(tǒng)腦局部PK研究通常是按一定時(shí)間間隔將動(dòng)物處死后取腦組織勻漿進(jìn)行處理分析，這種技術(shù)只能得到固定時(shí)間點(diǎn)的腦組織中待測(cè)物質(zhì)濃度，且消耗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多、誤差大。B-MD技術(shù)可快速實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腦細(xì)胞外液中待測(cè)物質(zhì)，并可減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，克服動(dòng)物個(gè)體差異造成的實(shí)驗(yàn)誤差，在腦局部PK研究中發(fā)揮越來越大的作用［11］。海洛因被認(rèn)為是最易成癮的濫用毒品之一，由于海洛因與μ 阿片受體結(jié)合力低而被認(rèn)為是前藥，其產(chǎn)生主要藥效的代謝產(chǎn)物是嗎啡還是6-單乙酰嗎啡（6-monoacetylmorphine，6-MAM）存在很大爭(zhēng)議。GOTTAS等［12］通過微透析（包括B-MD技術(shù)）分析了大鼠的血液和腦細(xì)胞外液中海洛因及其代謝物的濃度。大鼠靜脈注射0.1 mL海洛因（12.8 g·L-1）后，血液和腦細(xì)胞外液中的海洛因含量快速下降，分別在18和10 min后無法檢測(cè)到；6-MAM含量迅速升高，分別在2.0和4.3 min后達(dá)到最大濃度；嗎啡含量的升高非常緩慢，分別在12.6和21.3 min后才達(dá)到最高水平，僅為6-MAM 最高濃度的1/6，并且嗎啡濃度在大鼠注射海洛因30 min 后才超過6-MAM 濃度。因此，6-MAM可能介導(dǎo)了海洛因產(chǎn)生的大多數(shù)效應(yīng)。

苯丙胺類毒品是一類被廣泛濫用的中樞神經(jīng)興奮劑，這類毒品的獎(jiǎng)賞和強(qiáng)化作用可能是由改變轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能從而增加細(xì)胞外DA 水平所介導(dǎo)的。VAN GAALEN 等［13］開發(fā)了一種基于微透析技術(shù)（包括B-MD 技術(shù)）的PK 和藥效學(xué)（pharmacodynamics，PD）模型，用群體分析法研究了D-苯丙胺在大鼠和食蟹猴血漿、腦細(xì)胞外液和腦脊液中的PK，然后將該P(yáng)K 模型與B-MD 測(cè)量紋狀體細(xì)胞外DA 的PD 模型相關(guān)聯(lián)。通過B-MD 技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠和食蟹猴腦中，D-苯丙胺通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白誘導(dǎo)DA 外流（反向轉(zhuǎn)運(yùn)）是導(dǎo)致DA 劑量依賴性增加的主要原因，且2物種之間的PK/PD 模型結(jié)構(gòu)是一致的。這種基于微透析技術(shù)的PK/PD 模型在指導(dǎo)苯丙胺類物質(zhì)成癮的治療方法篩選中具有更大的價(jià)值。N-乙戊酮（N-ethylpentylone，NEP）是世界上繳獲最多的合成卡西酮類物質(zhì)之一，其PK還不清楚。LIN 等［14］通過B-MD 評(píng)估了大鼠伏隔核（nucleus accumbens，NAc）中NEP 的PK，同時(shí)監(jiān)測(cè)了NEP的血漿濃度。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NEP迅速通過血腦屏障，并在給藥后約40 min達(dá)到最大濃度（Cmax）。血漿中約4%NEP分布到NAc，考慮到大腦的均勻分布，血漿中超過90%NEP可能分布到了大腦。

2.2 B-MD技術(shù)在毒品成癮機(jī)制研究中的應(yīng)用

毒品成癮是一種涉及腦部獎(jiǎng)賞、動(dòng)機(jī)和學(xué)習(xí)記憶的慢性復(fù)發(fā)性腦部疾病，與腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的功能紊亂密切相關(guān)［15］。DA系統(tǒng)的改變是毒品成癮的重要生物學(xué)基礎(chǔ)，但近年來，5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素、谷氨酸和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）等神經(jīng)遞質(zhì)也開始受到研究者關(guān)注［16-19］。以往對(duì)腦內(nèi)遞質(zhì)含量的檢測(cè)多采用腦組織勻漿結(jié)合分析化學(xué)方法，其存在無法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)且不能直接反映腦內(nèi)遞質(zhì)含量等問題。B-MD 技術(shù)可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)遞質(zhì)濃度，并能實(shí)時(shí)反映腦內(nèi)的遞質(zhì)含量［20］。Shati/Nat8I 是甲基苯丙胺（methamphetamine，Meth）誘導(dǎo)產(chǎn)生的新型N-乙?；D(zhuǎn)移酶，在前額葉皮質(zhì)的表達(dá)水平明顯高于其他腦區(qū)。HADDAR 等［21］研究顯示，內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)（medial prefrontal cortex，mPFC）中Shati/Nat8l 過表達(dá)使Meth 誘導(dǎo)的條件性位置偏愛（conditioned place preference，CPP）有所減弱，通過B-MD 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，Shati/Nat8I 的過表達(dá)降低NAc細(xì)胞外DA的水平，并抑制Meth誘導(dǎo)的NAc中DA 的增加。上述結(jié)果表明，mPFC 中的Shati/Nat8I過表達(dá)通過降低NAc中的細(xì)胞外DA濃度而減弱了Meth誘導(dǎo)的CPP。

已知3，4-亞甲二氧基甲基苯丙胺（3，4-methylenedioxymethamphetamine，MDMA）可誘導(dǎo)人類產(chǎn)生依賴性，而腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）參與中腦多巴胺能神經(jīng)元的突觸可塑性和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)。MOURI 等［22］發(fā)現(xiàn)，小鼠MDMA 重復(fù)給藥7 d 可誘導(dǎo)海馬和紋狀體中BDNFmRNA表達(dá)，而在BDNF基因缺失的小鼠中，MDMA誘導(dǎo)的CPP、行為敏化均被減弱，并通過B-MD 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)MDMA 誘導(dǎo)NAc 細(xì)胞外5-HT和DA水平增加也均被減弱。這些結(jié)果表明，BDNF通過激活中腦5-HT能神經(jīng)元和DA能神經(jīng)元促進(jìn)了MDMA誘導(dǎo)的依賴性。合成大麻素JWH-018是大麻素受體（cannabinoid receptor，CB）激動(dòng)劑，與CB1和CB2的親和力比四氫大麻酚更高，但關(guān)于其獎(jiǎng)賞效應(yīng)和濫用潛力的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制的數(shù)據(jù)卻很少。DE LUCA等［23］通過B-MD技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠靜脈注射JWH-018 0.25 mg·kg-1增加了NAc 殼部中DA 釋放，但不增加NAc 核心部和mPFC 中DA釋放，這些作用被CB1拮抗劑（SR-141716A和AM 251）阻斷，JWH-018 20 和30 mg·kg-1分別誘導(dǎo)了大鼠和小鼠的自身給藥行為?？傊?，JWH-018與大麻活性成分四氫大麻酚相似，都是通過激活CB1和誘導(dǎo)DA 釋放發(fā)揮作用。甲卡西酮（methcathinone，MC）和3-氟甲卡西酮（3-fluoromethcathinone，3-FMC）均是合成卡西酮類物質(zhì)，MC和3-FMC是否影響紋狀體中神經(jīng)遞質(zhì)水平尚不清楚。WOJCIESZAK等［24］研究顯示，MC 和3-FMC 均劑量依賴性增加小鼠水平運(yùn)動(dòng)，并通過B-MD 技術(shù)發(fā)現(xiàn)它們也均能劑量依賴性升高小鼠紋狀體中細(xì)胞外DA 和5-HT水平，而選擇性多巴胺D1受體拮抗劑SCH23390 可消除這2 個(gè)藥物的作用。因此推斷，MC和3-FMC誘導(dǎo)的自發(fā)活動(dòng)是通過DA能神經(jīng)元的激活介導(dǎo)的。

2.3 B-MD技術(shù)在戒癮治療方法研究中的應(yīng)用

毒品成癮機(jī)制非常復(fù)雜，目前多數(shù)毒品成癮機(jī)制尚不明確，也缺乏理想的戒癮治療方法。利用B-MD 技術(shù)監(jiān)測(cè)藥物和神經(jīng)遞質(zhì)的含量及變化，可評(píng)估藥物和其他治療方法在腦內(nèi)的作用機(jī)制及治療效果，為優(yōu)化治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。大劑量美沙酮維持療法可有效減少阿片類藥物成癮患者的可卡因?yàn)E用，但尚不清楚是由于美沙酮抑制了可卡因的作用還是影響了成癮患者對(duì)可卡因的渴求。LERI 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，大劑量美沙酮維持療法（每天30 mg·kg-1，sc）可明顯抑制大鼠可卡因自身給藥行為，但通過B-MD 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)會(huì)增強(qiáng)可卡因誘導(dǎo)的紋狀體細(xì)胞外DA含量的升高。這表明大劑量美沙酮可減少阿片類藥物成癮患者的可卡因?yàn)E用，并可能在可卡因戒毒治療中發(fā)揮重要作用。

pseudoginsenoside-F11（PF11）是從西洋參中分離得到的一種三萜皂苷，對(duì)Meth 成癮的作用及機(jī)制尚不清楚。FU 等［26］研究發(fā)現(xiàn)，PF11（每天8 mg·kg-1，po）減弱Meth（1 mg·kg-1，sc）誘導(dǎo)小鼠的自發(fā)活動(dòng)和CPP。通過B-MD 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，PF11 和Meth 聯(lián)合使用，可降低Meth 誘導(dǎo)的NAc細(xì)胞外DA 的增加，并能增加NAc 細(xì)胞外GABA 水平。上述結(jié)果表明，PF11通過調(diào)節(jié)DA能神經(jīng)元和GABA 能神經(jīng)元抑制Meth誘導(dǎo)的成癮行為。胃饑餓素已被證明在食物獎(jiǎng)賞、酒精攝入和幾種興奮劑獎(jiǎng)賞中起關(guān)鍵作用。SUSTKOVA-FISEROVA等［27］通過B-MD技術(shù)研究顯示，胃饑餓素拮抗劑JMV2959預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)芬太尼（30 mg·kg-1，sc）誘導(dǎo)的NAc中大麻素的增加，增強(qiáng)芬太尼誘導(dǎo)的2-花生四烯酰甘油水平，顯著降低芬太尼引起的NAc 細(xì)胞外GABA 外排，并同時(shí)抑制芬太尼誘導(dǎo)的成癮行為。胃饑餓素拮抗劑是否可預(yù)防阿片類藥物的成癮還需進(jìn)一步研究。針灸已被證明是一種治療藥物成癮的有效干預(yù)手段。JIN等［28］評(píng)估了神門穴（HT7）針灸對(duì)大鼠可卡因自身給藥行為和VTA 中GABA能神經(jīng)元活性的影響，并利用B-MD 技術(shù)測(cè)定了中腦腹側(cè)被蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA）中GABA 和NAc 中DA 含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HT7 針灸可顯著逆轉(zhuǎn)可卡因抑制大鼠VTA 中GABA 釋放和GABA 能神經(jīng)元放電速率，并抑制可卡因誘導(dǎo)的大鼠自身給藥行為和VTA 中DA 釋放。上述結(jié)果表明，針灸可通過激活VTA 中GABA 能神經(jīng)元，抑制可卡因誘導(dǎo)大鼠NAc 中DA 的釋放以及自身給藥行為。

3 結(jié)語

毒品成癮涉及腦部獎(jiǎng)賞、動(dòng)機(jī)和學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)，其機(jī)制非常復(fù)雜，相關(guān)研究還不夠深入，也缺乏理想的戒癮治療方法。B-MD技術(shù)具有活體采樣、動(dòng)態(tài)觀察、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和定量分析等特點(diǎn)，隨著B-MD技術(shù)和商業(yè)化大分子截留透析膜（100 ku～300 Mu）的發(fā)展，以及多位點(diǎn)微透析技術(shù)在毒品研究中的應(yīng)用，為進(jìn)一步開展毒品腦內(nèi)PK、成癮機(jī)制和成癮治療等研究提供了更多可能［29-30］?；贐-MD技術(shù)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)及其在其他領(lǐng)域的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，B-MD技術(shù)將在以下毒品研究中得到廣泛應(yīng)用：①檢測(cè)與成癮相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，探討神經(jīng)遞質(zhì)與不同毒品成癮性的關(guān)系，并進(jìn)行量化，為不同種類毒品的依賴性折算提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；②毒品在腦內(nèi)的有效活性成分和生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)及監(jiān)測(cè)；③吸毒成癮患者腦內(nèi)微環(huán)境代謝變化及其機(jī)制研究；④毒品在體內(nèi)時(shí)效滯后現(xiàn)象及不同腦區(qū)的轉(zhuǎn)運(yùn)情況研究；⑤多位點(diǎn)微透析技術(shù)連續(xù)監(jiān)測(cè)多個(gè)腦區(qū)的不同神經(jīng)遞質(zhì)，探索不同腦區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)變化以及腦內(nèi)各種神經(jīng)遞質(zhì)之間的關(guān)系等。

綜上，B-MD技術(shù)結(jié)合分析系統(tǒng)，如HPLC-ECD，HPLC-FLD，LC-MS 和HPCE，或非侵入性成像技術(shù)，如正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)和磁共振波譜分析技術(shù)，以及生化分析儀和免疫組化染色儀等，可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腦細(xì)胞外液物質(zhì)，為研究腦內(nèi)特定部位的藥物濃度、神經(jīng)遞質(zhì)和細(xì)胞因子的變化、能量代謝產(chǎn)物等提供了有效的技術(shù)手段。雖然B-MD技術(shù)存在手術(shù)對(duì)腦組織有一定損傷性、相對(duì)回收率低、透析液量少和待測(cè)成分的分離與檢測(cè)較為困難等問題，導(dǎo)致該技術(shù)的應(yīng)用也存在一定的局限性，但隨著探針回收率的不斷提高、高靈敏分析儀器的不斷發(fā)展以及聯(lián)用技術(shù)的不斷完善，B-MD技術(shù)憑借其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在毒品研究中的應(yīng)用前景會(huì)越來越廣闊。