金銀花標準湯劑質(zhì)量標準研究

劉 濤，曾 立，謝 曉，高天賜，鄧 研，萬金霞

(1.成都大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106;2.成都大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 610106)

0 引 言

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1]，夏初花開放前采收并干燥，有清熱解毒與疏散風(fēng)熱的功效，表現(xiàn)出抗炎、抗菌及抗病毒等多種藥理學(xué)活性.據(jù)不完全統(tǒng)計，有500種以上的中藥制劑含有金銀花[2].現(xiàn)代藥理研究表明，綠原酸是金銀花的主要化學(xué)成分，也是金銀花主要有效成分之一，具有較強的藥理活性.

中藥標準湯劑是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下依據(jù)臨床湯劑煎煮方式規(guī)范化進行煎煮、固液分離、濃縮并干燥制得的，為衡量中藥配方顆粒與臨床湯劑是否基本一致的標準參照物.本研究選用15批金銀花飲片制成標準湯劑，以綠原酸含量為指標，對金銀花標準湯劑的質(zhì)量標準進行探討.

1 材 料

1.1 儀 器

TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；Ichrom5100高效液相色譜儀，大連依利特分析有限公司；TJ270-30A型傅里葉變換紅外光譜儀，天津拓普儀器有限公司；DZTW電子調(diào)溫電熱套，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；FA2004分析電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；HS-3120超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司.

1.2 試 藥

15批金銀花將其進行編號(JYH1～JYH15)，經(jīng)成都大學(xué)藥學(xué)院劉濤研究員鑒定，檢查項均符合文獻[1]中規(guī)定；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純；水為怡寶水.

2 方法與結(jié)果

2.1 方 法

據(jù)文獻[3]中相關(guān)要求，制定工藝流程，稱取金銀花飲片100 g，加12倍水，浸泡30 min，回流提取30 min，趁熱濾過，藥渣加10倍水回流提取20 min，趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮至密度1.1左右，冷凍干燥至粉末狀，即得.

2.2 結(jié) 果

2.2.1 出膏率測定

金銀花標準湯劑經(jīng)濃縮和冷凍干燥后精密稱定質(zhì)量，計算實際出膏率如表1所示.

表1 金銀花標準湯劑的出膏率及轉(zhuǎn)移率

2.2.2 金銀花標準湯劑凍干粉中綠原酸的測定

2.2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

采用Global Chromatography C18 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相為0.4%磷酸溶液-乙腈(87∶13)，檢測波長為327 nm，柱溫為30 ℃，體積流量為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，如圖1所示.

2.2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取金銀花標準湯劑凍干粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密移取50%甲醇50 mL后，密塞，稱重，超聲30 min，取出，放冷，稱重，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，濾過，精密移取5 mL續(xù)濾液于25 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，即得.

2.2.3 對照品溶液

取綠原酸對照品適宜，精密稱定，置棕色量瓶中，加50%甲醇制成質(zhì)量濃度為40 μg/mL的溶液，即得.

2.2.4 精密度考察

取金銀花標準湯劑凍干粉(JYH9)，按“2.2.2.2”項下方法制得供試品溶液，按“2.2.2.1”項下方法連續(xù)進樣6 次，測得綠原酸峰面積的相對標準偏差為0.70%，可知儀器精密度良好.

2.2.5 重復(fù)性考察

取金銀花標準湯劑凍干粉(JYH9)，按“2.2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.2.1”項下方法測定，結(jié)果顯示綠原酸平均含量相對標準偏差為4.39%，可知該方法重復(fù)性良好.

2.2.6 穩(wěn)定性考察

取金銀花標準湯劑凍干粉(JYH9)，按“2.2.2.2”項下方法制得供試品溶液后 0、2、4、8、12、24 h 時，按“2.2.2.1”項下條件測定，結(jié)果表明綠原酸峰面積的相對標準偏差為4.11%，可知供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.2.7 樣品測定

取15批金銀花標準湯劑及其凍干粉，按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并于“2.2.2.1”項下方法進行測定，計算綠原酸的轉(zhuǎn)移率，如表1所示.

3 指紋圖譜分析

3.1 金銀花標準湯劑凍干粉的HPLC指紋圖譜分析

3.1.1 HPLC指紋圖譜色譜條件

流動相為水(0.1%甲酸)A：乙腈(0.1%甲酸)B；0～8 min，B(10%～15%)；8～20 min，B(15%～20%)；20～25 min，B(20%～25%)；25～31 min，B(25%～29%)；31～36 min(29%～40%)；36～40 min，B(40%～60%);柱溫為30 ℃，體積流量為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長為280 nm.

3.1.2 方法學(xué)考察

取金銀花飲片標準湯劑(JYH13)，按“2.2.2.2”項下方法制得供試品，按“3.1.1”項下條件持續(xù)進樣6次，可得其相對時間相對標準偏差分別為0.25%、0.24%、0.19%、1.8%、1.5%及0.19%，相對峰面積相對標準偏差分別為3.77%、4.62%、3.33%、4.27%、4.54%及4.78%，表明儀器精密度良好.取金銀花飲片標準湯劑(JYH13)，按“2.2.2.2”項下方法平行制備6份供試品，按“3.1.1”項下條件測定，結(jié)果表明其平均含量相對保留時間相對標準偏差分別為0.28%、0.23%、0.24%、0.29%、0.25%及0.30%，平均含量相對峰相對標準偏差分別為3.75%、1.68%、0.88%、4.41%、2.28%及4.58%，可得該方法重復(fù)性良好.取金銀花飲片標準湯劑(JYH13)，按“2.2.2.2”項下方法制得供試品后0、2、4、6、8及12 h 時，按“3.1.1”項下條件進行測定，結(jié)果表明相對保留時間相對標準偏差為1.31%、0.25%、0.12%、0.47%、0.33%及0.43%，相對峰相對標準偏差分別為0.97%、3.86%、3.25%、4.19%、2.58%及3.08%，顯示供試品溶液在制備后12h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

3.2 金銀花標準湯劑凍干粉的紫外指紋圖譜分析

3.2.1 供試品溶液制備

稱取金銀花標準湯劑凍干粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取純凈水50 mL，超聲處理(功率100 W，頻率40 kHz)至溶解，冷卻后，稱重，用純凈水補重，搖勻，過濾，精密移取續(xù)濾液1 mL，置100 mL棕色容量瓶中，用純凈水定容，搖勻，即得.

3.2.2 光譜掃描條件

以純化水為空白對照，減少實驗誤差.光譜條件如下：光度模式為Abs，掃描范圍為 200～400 nm，速度為快，信息采集間隔為5.0 nm.

3.2.3 方法學(xué)考察

按“3.2.1”項所述方法取金銀花標準湯劑(JYH10)凍干粉制備供試品，按“3.2.2”項方式持續(xù)測定6次，得到紫外圖譜在325、305、240、275、255及290 nm 處吸光度值的相對標準偏差分別為0.11%、0%、0%、0.13%、0%及0%，可知儀器精密度良好.取同一批次金銀花標準湯劑(JYH10)，按照“3.2.1”項所述方法平行制備供試品 6 份，按“3.2.2”項條件測定紫外光譜圖，計算所得紫外譜圖在 325、305、240、275、255及290 nm 處平均含量的相對標準偏差分別為1.21%、1.13%、1.12%、1.16%、1.23%及1.06%，可得該方法重復(fù)性良好.取同一批次金銀花標準湯劑(JYH10)，按“3.2.1”項所述方法制備供試品后依次在 0、1、2、3、4、及5 h 按“3.2.2”項條件測定紫外光譜圖，計算所得紫外譜圖在325、305、240、275、255及290 nm 處A值的相對標準偏差分別為0.66%、0.98%、2.11%、3.05%、3.72%及1.35%，可得該方法在5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

3.2.4 金銀花標準湯劑凍干粉紫外指紋圖譜采集

按“3.2.1”項下方法精密稱取15批金銀花標準湯劑凍干粉，制備供試品，并按“3.2.2”項下條件進行測定，得其紫外指紋圖譜重疊圖如圖2所示.

3.2.5 紫外對照指紋圖譜的建立[4]

按“3.2.1”項下方法取10批(JYH1～JYH10)切合文獻[1]的金銀花飲片制備的金銀花標準湯劑凍干粉，制備供試品，并按“3.2.2”項下條件測定其紫外指紋圖譜，以各波長的A平均值作為紫外對照指紋圖譜的A值.紫外對照指紋圖譜如圖3所示.

3.2.6 相似度計算

應(yīng)用軟件“IBM SPSS statistics”中雙變量相關(guān)“Kendall’s tau-b”對10批金銀花標準湯劑的紫外指紋圖譜與紫外對照指紋圖譜進行相似度分析，并進行相似度測算[5]，所得結(jié)果為0.964、0.922、0.978、0.980、0.975、0.927、0.982、0.985、0.961及0.985，表明相關(guān)性顯著.

3.2.7A值

按“3.2.1”項下方法取10批(JYH1～JYH10)切合文獻[1]的金銀花飲片制備的金銀花標準湯劑凍干粉，制備供試品，按“3.2.2”項下條件進行測定，得紫外指紋圖譜，結(jié)果見表2.可見按照“3.2.1”項下方法所制備的供試品，按“3.2.2”項下條件進行測定得到紫外指紋圖譜的A值應(yīng)同時滿足240 nm(0.581～0.744)、255 nm(0.443～0.572)、275 nm(0.252～0.390)、290 nm(0.316～0.488)、305 nm(0.350～0.513)、325 nm(0.389～0.557).

表2 10批金銀花標準湯劑凍干粉紫外指紋圖譜A值

3.2.8 試驗驗證

另取5批(JYH11～JYH15)金銀花標準湯劑凍干粉，按照“3.2.1”項下方法制備的供試品，按“3.2.2”項下條件進行測定，得紫外指紋圖譜，將吸光度于“IBM SPSS statistics”中雙變量相關(guān)“Kendall’s tau-b”進行相似度分析，可得其紫外指紋圖譜相似度和A值均滿足范圍要求.

3.3 金銀花標準湯劑凍干粉的紅外指紋圖譜分析

3.3.1 供試品溶液制備

精密稱取金銀花標準湯劑凍干粉0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密移取50 mL純凈水，稱重，超聲30 min冷卻后稱重，純凈水補足重量.精密移取30 μL所制溶液，放于瑪瑙研缽中，使用吹風(fēng)機將其烘干，按1∶100和干燥KBr 粉末研磨混勻，在15 MPa真空環(huán)境中下壓片1 min，得待測樣品.

3.3.2 光譜掃描條件

掃描前已排除H2O和CO2的干擾，減小試驗誤差.按“3.3.1”項下方法制備的供試透明薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀中掃描測驗，掃描范圍為4 000～450 cm-1.

3.3.3 方法學(xué)考察

按“3.3.1”項下方法精密稱取金銀花標準湯劑樣品凍干粉(JYH9)，制備供試品，按“3.3.2”項下條件連續(xù)測定6次，得紅外圖譜，取圖譜中強吸收峰的10個對應(yīng)波數(shù)作為特征峰波數(shù)，計算特征峰波數(shù)值的相對標準偏差，結(jié)果顯示各特征峰波數(shù)值相對標準偏差均小于0.1%，故知該儀器精密度良好.按照“3.3.1”項下方法精密稱取金銀花標準湯劑樣品凍干粉(JYH9)，平行制備供試品6份，按“3.3.2”項下條件測定紅外光譜圖，計算特征峰波數(shù)值的相對標準偏差，結(jié)果顯示平均含量相對標準偏差均小于0.1%，故供試品制備方法與測定方法的重復(fù)性均良好.按“3.3.1”項下方法精密稱取金銀花標準湯劑樣品凍干粉(JYH9)后分別在0、1、2、3、4及5 h 按“3.3.2”項下條件掃描供試品，計算特征峰波數(shù)值的相對標準偏差，結(jié)果顯示各峰波數(shù)值相對標準偏差均小于0.1%，故樣品在制得后5 h內(nèi)穩(wěn)定.

3.4 金銀花標準湯劑凍干粉的物理指紋圖譜分析

3.4.1 金銀花標準湯劑凍干粉物理參數(shù)的確定

采用穩(wěn)定性、流動性、堆積性和可壓性作為金銀花標準湯劑物理指紋譜的一級指標，以松密度(Da)、振實密度(Dc)、休止角(α)、干燥失重(HR)、吸濕性(H)、豪斯納比(IH)、顆粒間空隙率(Ie)和卡爾指數(shù)(IC)作為二級指標.

1)松密度(Da)：稱8.0 g(w)待測粉末緩緩加至干燥潔凈的50 mL量筒中，記下待測粉末體積Va，Da=w/Va；

2)振實密度(Dc)：將上述盛有待測粉末的量筒以2s/次的頻率上下振動200次，記下待測粉末的體積Vc，Dc=w/Vc；

3)休止角(α)：固定串聯(lián)漏斗使其距離水平面2.2 cm，緩慢將粉末倒入漏斗中.當粉末的頂尖與漏斗的頂尖相接觸時停止，測量底部圓形堆積體半徑r，α=arctan(h/r)；

4)干燥失重(HR)：使用快速水分測定儀，稱取約 2.0 g 的待測粉末，在105 ℃下加熱10 min，記下失水率；

5)吸濕性(H)：將干燥蒸發(fā)皿放于恒溫干燥器(下部放置飽和氯化鈉溶液)，12 h后精密稱定質(zhì)量m，稱取約1.0 g待測粉末平鋪于上述蒸發(fā)皿中，精密稱定質(zhì)量m2，將蒸發(fā)皿放于上述恒溫恒濕的條件下，24 h后精密稱定質(zhì)量m3，H=(m3-m2)/(m2-m1)；

6)豪斯納比(IH)：IH=Dc/Da；

7)顆粒間空隙率(Ie)：Ie=(Dc-Da)/(Da×Dc)；

8)卡爾指數(shù)(IC)：IC=(Dc-Da)/Dc.

3.4.2 物理質(zhì)量指標的標準化轉(zhuǎn)換

便于分析，將實際測定值轉(zhuǎn)換至同一尺度，即0～10.標準化轉(zhuǎn)換方法及各物理質(zhì)量指標的可能數(shù)值范圍參考藥典標準和相關(guān)文獻方法[6].標準化轉(zhuǎn)換方法及轉(zhuǎn)換值范圍如表3所示.

表3 二級物理質(zhì)量指標標準化轉(zhuǎn)換方法及轉(zhuǎn)換值范圍

3.4.3 金銀花標準湯劑凍干粉物理指紋圖譜的構(gòu)建

按照“3.4.1”項下指標，測得10批金銀花標準湯劑凍干粉的8個物理常數(shù)數(shù)值，對數(shù)值標準化，如表4所示.以10批金銀花標準湯劑凍干粉的各個標準化參數(shù)值為半徑繪制雷達圖，并取參數(shù)值的平均值為半徑繪制物理對照指紋譜雷達圖，結(jié)果如圖4所示.

表4 金銀花標準湯劑凍干粉物理指紋譜相關(guān)指標值

3.4.4 相似度分析

采用“IBM SPSS statistics”中夾角余弦方法，對10批金銀花凍干粉的物理指紋圖譜與物理對照指紋圖譜進行分析，相似度分別為1.000、0.929、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、1.000、0.982及0.982，表明相似度顯著.

3.4.5 試驗驗證

取余下5批金銀花標準湯劑凍干粉，按照“3.4.1”項下指標進行測定并建立物理指紋圖譜，采用“IBM SPSS statistics”中夾角余弦方法與其物理對照指紋圖譜進行相似度分析，符合指標要求.

4 討 論

本研究從HPLC、紫外、紅外及物理指紋圖譜4個方面對金銀花標準湯劑質(zhì)量標準的建立進行了探討.結(jié)果表明：紫外、紅外指紋圖譜相似度顯著，但仍存在一定差異，有不穩(wěn)定的現(xiàn)象，與綠原酸熱敏度有關(guān)；HPLC指紋圖譜的7個共有峰可反映其指紋特征[7-8]；15批金銀花標準湯劑物理指紋圖譜表現(xiàn)為相關(guān)性顯著,主要是由于中藥浸膏粉末的粉體學(xué)性質(zhì)直接影響到制粒質(zhì)量[9-10]，標準湯劑為配方顆粒的基準，所以采用其物理指紋圖譜為配方顆粒的質(zhì)量標準提供參考.

目前大多數(shù)對標準湯劑的研究為HPLC指紋圖譜，很少從其他指紋圖譜方面進行考察.本研究解決了常規(guī)配方顆粒質(zhì)量標準的建立只采用HPLC指紋圖譜與含量測定方法的單一化問題，增加采用了紫外、紅外及物理指紋圖譜方法，為配方顆粒的質(zhì)量標準建立提供了更有效的支撐.

據(jù)文獻[3]提出的相關(guān)出膏率及轉(zhuǎn)移率指標范圍對本研究相關(guān)數(shù)據(jù)進行計算，得出膏率范圍為22.74%～42.22%，且每1 g含綠原酸為23.10～42.90 mg.據(jù)文獻[11]給出的金銀花配方顆粒出膏率范圍為24.00%～33.00%，但每1g含綠原酸為23.00～55.00 mg，其轉(zhuǎn)移率在給定范圍內(nèi)，出膏率范圍卻比給定范圍大.為此得出，如何獲得金銀花配方顆粒的最佳制備工藝參數(shù)，將是下一步的研究方向.