SCN1A基因突變特點(diǎn)及相關(guān)癲癇的臨床特征

吳計(jì)劃，楊廣娥，何遠(yuǎn)知，葉小飛，江亮亮，楊 斌

SCN1A基因位于2號(hào)染色體2q24.3上，編碼在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能中起重要作用的Ⅰ型鈉通道(Nav1.1)α亞基[1]。SCN1A基因的突變可導(dǎo)致γ氨基丁酸(GABA)能抑制性中間神經(jīng)元的鈉電流顯著減少，從而損害GABA抑制功能，導(dǎo)致神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)過度興奮性和癲癇發(fā)作[2]。這些降低的鈉電流能進(jìn)一步損害浦肯野細(xì)胞，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)障礙[3]，也可導(dǎo)致行為問題和認(rèn)知障礙[4]。目前發(fā)現(xiàn)有超過1 440個(gè)SCN1A基因突變，可導(dǎo)致各種不同的癲癇表型。本文總結(jié)了19例SCN1A基因突變特點(diǎn)及相關(guān)癲癇的臨床特征，現(xiàn)作報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集我科2016年7月至2019年8月診治的癲癇患兒，入組標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)二代基因測序(next-generation sequence，NGS)證實(shí)為SCN1A基因陽性突變者，對每位入選的患兒進(jìn)行詳細(xì)的臨床資料登記，通過門診復(fù)診或電話隨訪患兒病情發(fā)展情況，總結(jié)分析患兒臨床特點(diǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 在知情同意的前提下，采集先證者及其家系成員(父、母)各自全血2 mL(EDTA抗凝血) 進(jìn)行基因分析。使用BloodGen Midi Kit (CWBIO,China) 提取患兒全基因組DNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行；本研究基因測序及分析由北京全譜醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司完成。

1.2.2 高通量測序 外顯子捕獲：應(yīng)用IDT xGen Exome Research Panel捕獲探針進(jìn)行目標(biāo)基因全外顯子捕獲；文庫制備：應(yīng)用Cavoris 儀打斷至200 bp左右；片段化DNA在Klenow Fragment，T4 DNA polymerase和T4PNK的作用下進(jìn)行末端補(bǔ)平修復(fù)；在聚合酶體系下，使上一步得到的修復(fù)產(chǎn)物在3′末端加上A堿基，為下一步連接做好準(zhǔn)備；配置T4DNA連接酶反應(yīng)體系，在Thermo mixer中適溫反應(yīng)一定時(shí)間使adapter和加“A”產(chǎn)物連接；連接產(chǎn)物經(jīng)4～6輪LM-PCR擴(kuò)增；文庫與探針混于雜交體系中65 ℃，60～68 h雜交；使用鏈霉素磁珠，與雜交樣本孵育后洗脫液洗脫；洗脫產(chǎn)物經(jīng)10輪LM-PCR擴(kuò)增；Illumina平臺(tái)測序：測序，Illumina Novaseq6000平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)化上機(jī)測序操作流程；測序得到圖像原始數(shù)據(jù)，Illumina官方basecall分析軟件BclToFastq得到原始數(shù)據(jù)(raw data)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 原始數(shù)據(jù)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)：去接頭污染，去低質(zhì)量的數(shù)據(jù)；與參考序列對比：數(shù)據(jù)與參考序列比對統(tǒng)計(jì)(比對軟件BWA)，參考基因組為 hg19基因組；SNP檢測與注釋：分析軟件 samtools；InDel變異檢測與注釋：分析軟件 pindel；變異的假陽性過濾：根據(jù)測序深度和變異位點(diǎn)數(shù)據(jù)質(zhì)量，對檢測得到的SNP和InDel變異進(jìn)行過濾篩選，得到高質(zhì)量可靠的突變；變異注釋：SNP和Indel根據(jù)在基因上的位置，分析得到的氨基酸變化的影響，對mRNA剪切的影響，UTR及內(nèi)含子突變影響等；變異對蛋白功能影響的預(yù)測：應(yīng)用Provean軟件預(yù)測特定變異對蛋白質(zhì)的影響；變異對mRNA剪切影響的預(yù)測：應(yīng)用Maxent軟件預(yù)測特定變異對mRNA剪切的影響。

1.2.4 Sanger測序驗(yàn)證陽性位點(diǎn) 經(jīng)高通量測序，結(jié)合先證者各變異位點(diǎn)的攜帶情況與病例表型信息，篩選出基因變異與病人疾病高度相關(guān)，應(yīng)用Sanger測序技術(shù)對該位點(diǎn)在先證者及其家系成員(父、母)中的攜帶情況進(jìn)行檢測和驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 SCN1A基因突變結(jié)果 共收集19例SCN1A基因突變陽性患兒，其中錯(cuò)義突變8例，無義突變7例，移碼突變1例，剪切點(diǎn)突變2例，非移碼缺失1例。所有病例中，遺傳性突變3例，新生突變16例。遺傳性自父源2例，來自母源1例(見表1)。有14個(gè)變異為新發(fā)現(xiàn)的致病位點(diǎn)，Pubmed、萬方、知網(wǎng)、Human Gene Mutation Database等數(shù)據(jù)庫均未收錄。

2.2 臨床特點(diǎn) 所有患兒癲癇起病年齡范圍為新生兒期至9月齡，其中平均發(fā)病年齡為4.8月，起病年齡<6月者17例，6～12月起病者2例。癲癇發(fā)作形式為局灶性發(fā)作5例，全面性發(fā)作7例，兩種發(fā)作形式均有7例，有癲癇持續(xù)狀態(tài)16例；有叢集性特點(diǎn)14例；有熱敏感15例；有不同程度的智力、運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后14例。有抽搐家族史5例。診斷為Dravet綜合征(Dravet Syndrome,DS)11例。所有患兒均進(jìn)行頭顱MRI檢查，病例3及12顯示為大腦半球溝回增深。病例8顯示為額頂顳部白質(zhì)信號(hào)稍高，髓鞘化未成熟。病例2顯示為幕上腦室擴(kuò)張，腦橋背側(cè)T2WI和DWI略高信號(hào)。病例16顯示為腦發(fā)育不全。所有患兒均進(jìn)行視頻腦電監(jiān)測，腦電圖正常4例，腦電圖提示背景活動(dòng)偏慢6例，局灶性癇樣放電5例，多灶性癇樣放電5例(見表2、3)。

續(xù)表2

病例特點(diǎn) 構(gòu)成比預(yù)后 無效5(26.3) 無發(fā)作3(15.8) 發(fā)作減少≥50%8(42.1) 發(fā)作減少<50%1(5.3) 死亡1(5.3) 失訪1(5.3) 確診DS11(57.9)基因突變類型 錯(cuò)義8(42.1) 無義7(36.8) 剪切位點(diǎn)2(10.5) 移碼1(5.3) 非移碼缺失1(5.3) 新生突變16(84.2) 遺傳3(15.8)

2.3 治療及隨訪情況 本組患兒末次隨訪年齡為12月至144月，其中藥物治療無效5例，未再發(fā)作3例，發(fā)作次數(shù)減少≥50%8例，<50%1例，死亡1例，失訪1例。單藥治療1例，使用兩種抗癲癇藥物(AED)9例(丙戊酸鈉和托吡酯聯(lián)合5例，左乙拉西坦和托吡酯聯(lián)合2例，丙戊酸鈉和拉莫三嗪1例，左乙拉西坦和拉莫三嗪1例)，使用三種及三種以上AED 6例(丙戊酸鈉、左乙拉西坦、托吡酯聯(lián)合5例，丙戊酸鈉、左乙拉西坦、托吡酯、氯硝西泮聯(lián)合1例)。病例10和15患兒嘗試生酮飲食治療，前者發(fā)作次數(shù)減少，后者抽搐無明顯改變。

3 討論

SCN1A基因編碼的Nav1.1的α亞基，由85 kb的基因區(qū)域內(nèi)的26個(gè)編碼外顯子組成。近年來有關(guān)SCN1A基因突變的文獻(xiàn)報(bào)道逐漸增多，已報(bào)道多種SCN1A基因突變類型，包括錯(cuò)義突變、無義突變、移碼突變、框內(nèi)堿基缺失或插入突變、剪切位點(diǎn)突變，其中錯(cuò)義突變最常見。在SCN1A突變中，新生突變占突變的90%～95%，其余為遺傳性突變[5-6]。本組19例患兒攜帶的SCN1A基因突變各不相同，無明顯熱點(diǎn)突變，其中錯(cuò)義突變占42.1%，基因突變位點(diǎn)已有文獻(xiàn)報(bào)道者5例，其余突變位點(diǎn)均為首次發(fā)現(xiàn)的新生變異。

SCN1A突變引起的疾病范圍從輕度表型到稱為DS的嚴(yán)重表型，以及一些罕見表型包括West綜合征和Panayiotopoulos綜合征[7-11]。SCN1A與DS臨床表型密切相關(guān)，文獻(xiàn)[12]報(bào)道，DS中SCN1A突變陽性率在70%左右，本組患兒共19例SCN1A基因突變陽性，其中確診DS患兒11例，與文獻(xiàn)報(bào)道相符。SCN1A突變中導(dǎo)致鈉通道功能完全喪失的致病變異與嚴(yán)重表型相關(guān)，而通道功能中較輕微的干擾通常導(dǎo)致溫和的臨床表型[6]。臨床上首次發(fā)作一般很難區(qū)分哪種類型，早期識(shí)別較嚴(yán)重表型并及時(shí)治療，可能有助于改善認(rèn)知障礙，甚至阻止癲癇性腦病的進(jìn)展。DE LANGE等[13]認(rèn)為，癲癇首次發(fā)作年齡是SCN1A突變病人演變成DS的重要預(yù)測因子，CETICA等[14]也發(fā)現(xiàn)在SCN1A突變的個(gè)體中首次發(fā)作時(shí)的年齡比突變位置及突變類型更能預(yù)測癲癇的結(jié)局，他們認(rèn)為SCN1A突變個(gè)體中6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)癲癇發(fā)作者幾乎都有規(guī)律的進(jìn)展為癲癇性腦病。我們的病例中診斷為DS的大多數(shù)在6月齡之前發(fā)病，也支持這一觀點(diǎn)。FANG等[5]認(rèn)為SCN1A突變者中有復(fù)雜性發(fā)作的兒童，90%最終發(fā)展為DS或癲癇性腦病。本研究19例患兒中首次發(fā)病表現(xiàn)為復(fù)雜性熱性驚厥5例，發(fā)展成DS有4例，疑診1例，5例病人均表現(xiàn)不同程度的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)遲緩，與文獻(xiàn)結(jié)果類似。具有SCN1A突變的DS患兒往往在1歲之前出現(xiàn)與發(fā)熱相關(guān)的癲癇持續(xù)狀態(tài)[15]，本組11例診斷為DS患兒均在1歲前出現(xiàn)過發(fā)熱相關(guān)的癲癇持續(xù)狀態(tài)。

表3 病例資料

CFS：復(fù)雜性熱性驚厥；GTCS：全面強(qiáng)直陣攣發(fā)作；SFS：單純性熱性驚厥；FS：局灶性發(fā)作；VPA：丙戊酸鈉；LEV：左乙拉西坦；TPM：托吡酯；LTG：拉莫三嗪；KD：生酮飲食；CLB：氯巴占

SCN1A突變除引起癲癇的易感性外，還可以導(dǎo)致認(rèn)知及行為障礙，臨床上發(fā)育遲緩是由癲癇性腦病引起還是遺傳改變本身所致，或是二者共同導(dǎo)致，目前存在爭議。研究發(fā)現(xiàn)SCN1A表達(dá)降低導(dǎo)致前腦GABA能神經(jīng)元功能障礙，從而影響發(fā)作前的認(rèn)知[16]，本組患兒雖然均有不同程度的發(fā)育落后，但大多數(shù)均在癲癇發(fā)作出現(xiàn)后被發(fā)現(xiàn)。SCN1A突變病人往往不會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的腦結(jié)構(gòu)異常，個(gè)別表現(xiàn)為腦萎縮、海馬硬化、皮質(zhì)發(fā)育不良[17]，我們的病例中14例頭顱MRI檢查結(jié)果正常，5例存在異常，且均為非特異性表現(xiàn)。癲癇患兒早期腦電圖異?？赡茴A(yù)示不良的臨床結(jié)局，但在SCN1A突變組中，近一半發(fā)作間期腦電圖記錄正常[18]，我們也發(fā)現(xiàn)一半患兒早期腦電圖正常或僅表現(xiàn)為背景活動(dòng)偏慢的非特異性表現(xiàn)。

SCN1A突變病人的治療結(jié)果與臨床表型存在相關(guān)性，對于較溫和的表型治療效果好，而嚴(yán)重表型如DS或癲癇性腦病，大多數(shù)AED治療效果較差。然而，KWAN等[19]認(rèn)為47%的初診癲癇病人在首次單藥治療后即可達(dá)到無癲癇發(fā)作狀態(tài)，只有3%的病人需聯(lián)合用藥才能達(dá)到無癲癇發(fā)作。4種及更多的AED聯(lián)合治療，其療效并不比單藥治療效果更好，故對于SCN1A突變的癲癇患兒選擇適當(dāng)?shù)腁ED非常重要。最常用的藥物是丙戊酸鈉、左乙拉西坦、托吡酯、氯硝西泮，可有效減少癲癇發(fā)作頻率[5,20-21]，本組患兒主要以這幾種藥物為主，完全控制占15.8%，發(fā)作次數(shù)減少>50%占42.1%。有研究[1]表明對SCN1A突變病人，使用鈉通道阻斷劑如卡馬西平、奧卡西平?jīng)]有抗癲癇作用，甚至可能增加發(fā)作頻率，本組研究中1例死亡患兒曾在外院應(yīng)用奧卡西平抗癲癇治療，該患兒死亡原因可能為癲癇猝死。

AED治療效果不好的患兒可嘗試生酮飲食(KD)，研究[22]表明KD可用于治療難治性癲癇，TIAN等[23]認(rèn)為KD對超過一半的DS病人有效，KO等[24]發(fā)現(xiàn)在進(jìn)展性癲癇性腦病的致病性突變中KD對SCN1A突變者有效，有效率達(dá)77.8%。KD能有效減少癲癇長時(shí)間發(fā)作和癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)生頻率[25]，同時(shí)改善病人的認(rèn)知發(fā)展和行為障礙。KD開始治療的時(shí)間越早，其抗癲癇作用越明顯，早期KD可減少AED的聯(lián)合應(yīng)用[26]，研究發(fā)現(xiàn)KD在患癲癇嬰兒中有效且安全[27]，因此筆者認(rèn)為在SCN1A突變所致嚴(yán)重表型的癲癇患兒中，可早期應(yīng)用KD，而不是僅僅作為最后的選擇。

SCN1A基因突變包括新生突變和遺傳性突變，其導(dǎo)致的癲癇多在嬰兒早期起病，癲癇表型譜較廣，其中較嚴(yán)重的為DS，而DS多數(shù)預(yù)后不良，伴有智力損害，癲癇猝死發(fā)生率高。本研究通過總結(jié)19例SCN1A突變的患兒基因及臨床資料，擴(kuò)大了該基因的變異譜，也為其他的SCN1A致病變異病人提供了臨床表型參考。對疑似病例及時(shí)進(jìn)行基因檢測，有利于早期診斷，指導(dǎo)選擇合適的治療方案。

(感謝北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心王亞健老師在實(shí)驗(yàn)技術(shù)及基因分析方面的幫助。)