肺癌病人EGFR基因突變與相關病理和臨床特征分析

張 輝，胡懷遠

肺癌是全球范圍內惡性腫瘤相關死亡首位原因[1]。據相關調查[2-4]，全世界每年新發(fā)病例約180萬，病死病例約159萬，我國新發(fā)與病死病例分別占65萬、59萬，是危害國民生命健康重要疾病類型。肺癌早期確診病人通過手術治療可獲得良好預后，但75%以上病人確診時處于疾病晚期，即使接受規(guī)范化放化療，5年生存率仍低于15%，預后較差[5-6]。表皮生長因子受體(EGFR)是首個于肺癌中篩查出的重要驅動因子，其下游通路參與腫瘤細胞的侵襲、增殖與轉移[7]。近年來隨著肺癌驅動基因學發(fā)展，針對EGFR酪氨酸激酶抑制劑分子靶向技術已成為不能手術EGFR基因突變肺癌一線治療手段，眾多病人受益于此，疾病控制率得到提高，但由于個體差異，存在部分病人EGFR基因突變檢測無法實施，不能為藥物靶向治療提供指導[8-9]。本研究選取70例晚期或局部晚期不能手術肺癌病人，分析EGFR基因突變與臨床病理特征關系，以期為不能獲取組織標本進行檢測病人合理應用靶向藥物提供理論依據?，F(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年7月我院收治的70例晚期或局部晚期不能手術肺癌病人，其中男37例，女33例，年齡43～91歲；吸煙史34例；肺穿刺活檢組織標本29例，支氣管鏡活檢組織標本41例；鱗癌34例，腺癌36例；未分化10例，低分化16例，中分化23例，高分化21例。本研究經我院倫理委員會審核通過，符合《世界醫(yī)學會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 納入及排除標準 (1)納入標準：符合肺癌診斷標準[10]；腫瘤TNM分期Ⅳ期病人；入組前4周未接受過相關治療；自愿簽署知情同意書；無白血病。(2)排除標準：正在參與其他研究者；合并休克病人；認知功能、精神異常者；預估生存期<3個月者；依從性較差者；伴有自身免疫類疾病者；不能耐受活檢者；臨床資料不完整者；不能獲得足夠組織標本者。

1.3 方法

1.3.1 EGFR基因突變檢測方法

1.3.1.1 主要儀器 耐高溫塑料染色架(福州邁新，RAK-2001)；實時熒光定量PCR儀(Roche，Cobas Z480)；基因分析儀ABI3100型(美國ABI公司)；核酸蛋白定量儀(NanoDrop 2000)；電熱恒溫水箱CU600型(海門市其林貝兒公司)；RM2135型石蠟組織切片機、ST5020型染色機、EG1140H型包埋機、DM1000型顯微鏡、PELORISⅡ型脫水機，均購于德國Leica。

1.3.1.2 主要試劑 血清/血漿游離DNA試劑盒(武漢海吉力生物科技有限公司)；EGFR基因突變檢測試劑盒(武漢海吉力生物科技有限公司)；石蠟標本組織DNA提取試劑盒(杭州迅捷生物技術有限公司)；蘇木精、中性樹膠、伊紅(北京索萊寶科技有限公司)；枸櫞酸組織抗原修復液(福州邁新MVS-0100/0101，0.01 mol/L，pH=6.0±0.01)；Taq DNA聚合酶與陽性質控品(南京歐凱生物)。

1.3.1.3 外周血標本采集、DNA提取、檢測 采集病人10 mL外周靜脈血標本，置于抗凝管中，2 h內按照兩級離心法離心，以血清/血漿游離DNA試劑盒抽提DNA，以核酸蛋白定量儀測定抽提DNA濃度，OD260/OD230>2.0，OD260/OD280：1.8～2.0。以EGFR基因突變檢測試劑盒檢測EGFR基因突變情況。

1.3.1.4 病理學切片制作 活檢組織標本切片應用乙醇進行脫水，石蠟包埋，切片，厚度控制在4～5 μm，中性樹膠封片。

1.3.1.5 DNA提取 取10片石蠟切片，按臨床樣品基因組DNA小量提取試劑盒提取DNA，應用分光光度計測量濃度，要求DNA樣本濃度>20 ng/mL，總量>200 ng。

1.3.1.6 PCR擴增與檢測 (1)取出Taq DNA聚合酶與陽性質控品，震蕩混勻待用；(2)取42.3 μL待測DNA樣品，加入42.3 μL純化水、2.7 μL Taq DNA聚合酶、42.3 μL陽性質控品，漩渦器混勻，快速離心15 s；(3)取5 μL混勻的DNA樣品，靠PCR管上管壁加入8聯(lián)反應條中，蓋好管蓋，離心處理；(4)置于實時熒光定量PCR儀，若不能及時上機，可在4 ℃冰箱或冰水混合物中保存PCR反應條，12 h內上機；(5)應用套式PCR擴增EGFR基因第19、21號外顯子，第19號外顯子上下游外、上下游內引物序列分別為：5′-AAT ATC AGC CTT AGG TGC G-3′、5′-CCA GTA ATT GCC TGT TTC C-3′、5′-CTG GGC AGC ATG TGG CA-3′、5′-ATG TGG AGA TGA GCA GGG TCT-3；第21號上下游外、上下游內引物序列分別為：5′-GTT CGC CAG CCA TAA GTC C-3′、5′-TCA TTC ACT GTC CCA GCA AG-3′、5′-TTC CCA TGA TGA TCT GTC CCT C-3′、5′-CAG CCT GGT CCC TGG TGT C-3′。第1～3階段擴增條件分別為：1個循環(huán)、95 ℃ 5 min；15個循環(huán)、72 ℃ 20 s、95 ℃ 25 s、64 ℃ 20 s；31個循環(huán)、60 ℃ 35 s、93 ℃ 25 s、72 ℃ 20 s。第三階段60 ℃時收集HEX、FAM熒光信號，反應結束實時熒光定量PCR儀自動輸出擴增結果。

1.3.1.7 質控 每次檢測最多30個樣本，均加入EGFR陰性對照與突變對照，兩者均有效則運行有效，若其一與工作液反應結果無效，整輪結果均視為無效，重新進行檢測。

1.3.1.8 結果判讀 分為在EGFR檢測區(qū)域存在突變與無突變2種結果(見表1)。

表1 結果判讀

-示不適用b

1.3.2 治療方法 所有入組病人均給予尼妥珠單抗與多西紫杉醇+順鉑化療聯(lián)合治療：(1)75 mg/m2多西紫杉醇(廣東星昊藥業(yè)有限公司，國藥準字H20178012)與500 mL 5%葡萄糖混合后靜滴3 h左右，d1、d8；75 mg/m2順鉑(廣東嶺南制藥有限公司，國藥準字H20143124)與250 mL 0.9%氯化鈉溶液混合后靜滴1 h左右，d1～3。(2)化療同期予以尼妥珠單抗(百泰生物藥業(yè)有限公司，國藥準字S20080001)，第1～6周為1次/周靜滴，第7周起2次/周靜滴，劑量均為200毫克/次，3周為1個周期。2組均為2個治療周期。

1.4 療效評價 治療后根據實體瘤療效評價標準劃分療效為完全緩解(病灶完全消失，CR)、部分緩解(病灶縮小>30%，PR)、穩(wěn)定(病灶縮小≤30%或增大<20%，SD)、進展(病灶增大≥20%，PD)。疾病控制率(DCR)=(SD例數(shù)+PR例數(shù)+CR例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.5 觀察指標 (1)EGFR基因突變情況。(2)根據EGFR基因突變情況分為突變組、無突變組，分析2組年齡、性別、吸煙史、分化程度、組織學分型、淋巴結轉移、腫瘤直徑等特征信息。(3)比較2組DCR。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用χ2檢驗、秩和檢驗和logistic回歸分析。

2 結果

2.1 EGFR基因突變情況 外周血與活檢組織標本均檢測到EGFR基因突變30例，兩者EGFR基因突變率均為42.86%(30/70)，具有良好一致性。其中活檢組織標本檢測發(fā)現(xiàn)15例第19號外顯子突變，17例第21號外顯子突變，第19與21號外顯子均存在突變2例。

2.2 EGFR基因突變與相關病理 突變組與無突變組在年齡、性別、吸煙史、分化程度、組織學分型分布方面差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，在淋巴結轉移、腫瘤直徑分布方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。年齡>50歲肺癌病人EGFR基因突變率高于≤50歲者(P<0.01)；女性肺癌病人EGFR基因突變率高于男性(P<0.01)；無吸煙史肺癌病人EGFR基因突變率高于有吸煙史者(P<0.01)；無分化、低中分化、高分化肺癌病人EGFR基因突變率差異明顯，且分化程度越高，突變率越高(P<0.01)；腺鱗癌、腺癌肺癌病人EGFR基因突變率高于大細胞癌、鱗癌(P<0.01)。

表2 EGFR基因突變與相關病理[n；百分率(%)]

續(xù)表2

變量 突變組 (n=30) 無突變組 (n=40)χ2P組織學分型 大細胞癌2(6.67)12(30.00) 鱗癌 腺鱗癌1(3.33)14(46.67)20(50.00)5(12.50)11.69<0.01 腺癌13(43.33)3(7.50)淋巴結轉移 有 無3(10.00)27(90.00)7(17.50)33(82.50)0.29>0.05腫瘤直徑/cm ≥3 <3 5(16.67)25(83.33)14(35.00)26(65.00)2.91>0.05

2.3 多因素分析 以單因素分析差異有統(tǒng)計學意義的變量為自變量進行多因素logistic回歸分析，結果顯示，EGFR基因突變與分化程度、組織學分型獨立相關(P<0.05和P<0.01)(見表3)。

表3 預測EGFR基因突變的多因素分析

2.4 臨床療效 EGFR突變組療效明顯優(yōu)于無突變組(P<0.01)(見表4)。

表4 2組臨床療效比較[n；百分率(%)]

3 討論

EGFR位于7號染色體上，基因長約110 kb，屬于人EGFR家族中一個跨膜酪氨酸激酶受體，其編碼分為3個區(qū)域：細胞內、跨膜區(qū)酪氨酸激酶活性區(qū)、細胞外配體結合區(qū)[11-12]。EGFR與細胞外配體于結合區(qū)結合后，可激活下游一系列信號通路，從而促進細胞分化、生長，對正常細胞存活與功能發(fā)揮具有重要調控作用[13]。但既往研究[14-15]發(fā)現(xiàn)，肺癌病人體內存在EGFR過表達現(xiàn)象，且與EGFR基因突變有關。而EGFR共有26個外顯子，目前已發(fā)現(xiàn)18～21外顯子為主要基因突變點：18外顯子突變，19外顯子缺失堿基，20外顯子堿基插入或突變，21外顯子突變[16]。突變可造成EGFR下游信號通路異常，細胞增殖、轉移、凋亡失去調控，最終發(fā)生腫瘤[17-18]。ANTONICELLI等[19]研究指出，EGFR基因突變90%左右發(fā)生于第19、21外顯子上。楊長紹等[20]研究顯示，第18、20號外顯子突變發(fā)生率較低，分別為3.2%、2.2%。本研究結果顯示，30例EGFR基因突變均發(fā)生于第19號、21號外顯子，與以上報道主要基因突變點相符。且本研究還發(fā)現(xiàn)，外周血與活檢組織標本檢測到EGFR基因變率均為42.86%，均有良好一致性，這可為晚期不能耐受組織活檢病人EGFR基因突變的檢測提供一種思路。

影響EGFR基因突變因素較多，如吸煙史、年齡、組織分型、性別等，國內外學者對此進行了大量研究。如DASGUPTA等[21]報道顯示，從未吸煙肺癌病人EGFR基因突變率較高。LI等[22]對中國208例肺癌病人進行調查發(fā)現(xiàn)，女性、非吸煙者、腺癌病人EGFR基因突變率較高。張著學等[23-24]報道指出，高分化程度肺癌病人EGFR基因突變率高于未分化或低分化病人。本研究結果顯示，年齡>50歲、女性、無吸煙史、分化程度較高肺癌病人EGFR基因突變率較高，與以上研究結果相符。在惡性腫瘤生物學行為方面，組織病理學研究較分子生物學研究經濟性高，且更有效率，因此EGFR基因突變與組織學分型關系始終是臨床研究熱點。丁昊等[25]報道顯示，EGFR基因突變多見于腺鱗癌。楊寧等[26]研究指出，肺腺癌EGFR基因突變率高于其他類型肺癌。SHOLL等[27]指出，EGFR基因突變多見于微乳頭腺癌，浸潤性黏液腺癌、實體狀腺癌較低。本研究結果顯示腺鱗癌EGFR基因突變率最高。推測不同組織學分型肺癌可能受基因突變機制影響而存在異質性。梁穎等[28]研究對此進行進一步探討，發(fā)現(xiàn)肺癌病人EGFR基因突變不一致率較高。因此臨床進行EGFR基因突變檢測時，應盡量避免應用含有實性或黏液成分較多腺癌標本，以提高EGFR基因突變檢出率。以往大多學者研究多局限于此，本研究在此基礎上進行深入分析發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變與年齡、性別、吸煙史無明顯相關性，而與分化程度、組織學分型獨立相關(P<0.05)，提示肺癌病人腫瘤分化程度、組織學分型才為預測EGFR基因突變有價值參考指標。

此外，以往研究[29]表明，EGFR絡氨酸激酶抑制劑對EGFR基因突變病人有效，而對EGFR未突變病人基本無效，這是臨床制定靶向性治療方案重要依據。劉冰等[30]研究發(fā)現(xiàn)，肺癌病人應用EGFR-TKI類藥物治療時，突變陽性者DCR明顯優(yōu)于突變陰性者，其原因與EGFR基因突變對酪氨酸激酶抑制劑敏感性較高有關。本研究結果顯示，突變組DCR(93.33%)高于無突變組(55.00%)(P<0.05)，提示以EGFR基因突變?yōu)橐罁?，選用針對性EGFR絡氨酸激酶抑制劑能提高疾病控制率。但EGFR表達在預測靶向治療對病人生存率方面的價值仍存在爭議。張旭剛等[31]研究指出，EGFR基因突變是肺腺癌病人遠期生存率獨立影響因素。張童童等[32]對比了肺癌常見驅動基因指導下靶向治療的效果，發(fā)現(xiàn)靶向治療對EGFR基因突變病人無進展生存期無顯著影響。目前普遍認同的是，EGFR基因突變是EGFR絡氨酸激酶抑制劑應用指征，能提高短期療效，但對疾病長遠影響尚需長期隨訪進行驗證。另臨床確診肺癌病人TNM可分為Ⅰ～Ⅳ期，Ⅰ～Ⅲ期常采用以手術為主綜合治療方案，Ⅳ期主要采用保守治療方法，故本研究僅探析TNM Ⅳ期肺癌病人EGFR基因突變相關情況，而TNM Ⅰ～Ⅲ期病人是否存在此規(guī)律，有待擴大樣本量深入分析。

綜上所述，EGFR基因突變多發(fā)于第19號、21號外顯子，且多見于年齡>50歲、女性、無吸煙史、分化程度較高、腺鱗癌、腺癌肺癌病人，腫瘤分化程度、組織學分型與EGFR基因突變獨立相關，存在EGFR基因突變病人DCR較高，有利于臨床靶向治療的篩選。