通過型固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測火鍋底料中的喹諾酮類藥物

沈雄雅 何曉明 吳丹虹 葉冰潔 聞佳鈺 劉強欣

摘要?[目的]建立通過型固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋底料中11種喹諾酮類藥物的分析方法。[方法]樣品用酸化乙腈提取，經(jīng)Oasis Prime HLB固相萃取柱凈化，收集流出液，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式檢測和同位素內(nèi)標(biāo)定量。[結(jié)果]所有目標(biāo)物在線性范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)≥0.99，檢出限為0.6～4.8 μg/kg，定量限為2.0～13.2 μg/kg，不同加標(biāo)水平的平均回收率為78.5%～103.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～9.1%。[結(jié)論]該方法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點，可用于火鍋底料中11種喹諾酮類藥物的測定。

關(guān)鍵詞?通過型固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，火鍋底料，喹諾酮類藥物

中圖分類號?TS201.6文獻標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）06-0184-04

Abstract?[Objective]The research aimed to establish an analytical method for the determination of 11 quinolones in hotpot seasoning by solid phase extractionultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry.[Method]Samples were extracted with acidic acetonitrile，cleanedup by soludphase extraction using Oasus Prime HLB column. The analytes were detected in the multireaction monitoring （MRM） mode and quantified by the isotope internal standard method. [Result]The calibration curves were linear well in the corresponding concentration ranges，with correlation coefficient ≥ 0.99. The limits of detection and quantification were 0.6-4.8 μg/kg and 2.0-13.2 μg/kg，respectively.The average recoveries at three spiked levels ranged from 78.5% to 103.4% with RSD of 2.8%-9.1%.[Conclusion]This method is rapid，accurate and sensitive.It can be used for the determination of 11 quinolones in hotpot seasoning.

Key words?Solid phase extractionultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，Hotpot seasoning，Quinolones

喹諾酮類藥物是一類人工合成的廣譜抑菌劑，具有抗菌譜廣、高效、給藥方便、價格低廉等特點，在臨床治療感染方面有較廣泛應(yīng)用[1-2]。有研究表明，消費者長期食用含有喹諾酮類藥物殘留的食物，會誘發(fā)致病菌產(chǎn)生耐藥性，甚至還有潛在的致癌作用[3-4]。近年來，少數(shù)不法分子將喹諾酮類藥物添加在火鍋底料中用于殺菌，防止人們食用變質(zhì)的該類食物后出現(xiàn)腸胃不適等情況，給食品安全及消費者健康帶了巨大的隱患。因此，建立一種靈敏、準(zhǔn)確、快速同時測定火鍋底料中喹諾酮類藥物的檢測方法，對保障食品質(zhì)量安全、進而保護消費者健康具有重要意義。

目前對喹諾酮類藥物檢測方法多集中在動物源性食品和環(huán)境等領(lǐng)域[5-9]，關(guān)于火鍋底料中喹諾酮類藥物相關(guān)研究報道較少[10-12]，凈化方式主要采用液液萃取法、分散固相萃取法或固相萃取法等。液液萃取法、分散固相萃取法雖然簡單，但基質(zhì)效應(yīng)大，固相萃取的Oasis HLB柱需要進行活化、淋洗、洗脫等處理，過程繁瑣，消耗時間長。該試驗采用通過型固相萃取技術(shù)凈化樣品，對前處理提取條件、凈化條件和儀器分析條件進行了優(yōu)化，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，同位素內(nèi)標(biāo)定量，建立火鍋底料中11種喹諾酮類藥物的檢測方法。

1?材料與方法

1.1?儀器?LC-MS/MS 8050三重四級桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本Shimadzu公司），?ST16R高速冷凍離心機（美國Thermo公司），?Multi Reax全能型振蕩器（德國Heidolph公司），AUTO EVA-60全自動平行濃縮儀（?？乒荆?Milli-Q Reference超純水機（美國Millipore公司）。

1.2?試劑?喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：諾氟沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、氟羅沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、司帕沙星、環(huán)丙沙星、達氟沙星、恩諾沙星（純度均大于95%，德國 Dr.Ehrenstorfer 公司），同位素內(nèi)標(biāo)：恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、諾氟沙星-D5（純度均大于99%，德國Witega公司）。

甲酸、乙腈（HPLC級，美國Thermo公司），Oasis Prime HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL，美國Waters公司），甲酸銨（天津博納艾杰爾科技有限公司），試驗用水為Milli-Q超純水，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3?標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制?分別將11種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為100 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4 ℃ 下避光保存。取各單標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用時根據(jù)需要，將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液用初始濃度流動相逐級稀釋配成系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine溶液：準(zhǔn)確量取1 000 mL 0.1 mol/L 檸檬酸溶液與 625 mL 0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液混勻，用NaOH 調(diào)至 pH 4后，再加入 60.5 g 乙二胺四乙酸鈉，搖勻。

1.4?樣品前處理

1.4.1?提取。

準(zhǔn)確稱取5.0 g的樣品于50 mL離心管中，加入20 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液，渦旋混勻1 min后，加入10 mL 1%甲酸乙腈，渦旋振蕩15 min，10 000 r/min高速離心3 min。 取上清液于15 mL離心管中，待凈化。

1.4.2?凈化。準(zhǔn)確移取2 mL樣品提取液，加于Oasis Prime HLB固相萃取柱上，控制流速為1滴/s，收集全部流出液，40 ℃ 氮吹至干，用1 mL初始濃度流動相復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，待上機測定。

1.5?測定方法

1.5.1?色譜條件。

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱溫40 ℃，流速0.35 mL/min，進樣量3 μL，流動相：A相為2 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸），B相為乙腈，梯度順序：0～0.5 min，7% B，0.5～3.0 min，7%～25% B，3.0～5.0 min，25%～95% B，5.0～5.9 min，95% B，5.9～6.5 min，95%～7% B。

1.5.2?質(zhì)譜條件。

電噴霧離子源（ESI）：正離子模式，溫度400 ℃，毛細管電壓 4 000 V，霧化氣流量3.0 L/min，加熱氣流量10.0 L/min，定性與定量離子對、碰撞能量等參數(shù)見表1。

2?結(jié)果與分析

2.1?分析條件的優(yōu)化

在電噴霧正離子模式下，采用直接進樣方式對11種喹諾酮類藥物進行全掃描，確定分子離子峰。再以分子離子峰作為母離子，進行子離子掃描，確定每個目標(biāo)化合物的定性和定量離子對，最后通過多級反應(yīng)監(jiān)測模式，對各化合物定性定量離子對及碰撞能等參數(shù)進行優(yōu)化。

在流動相中添加緩沖鹽或甲酸是改善色譜峰形、提高儀器響應(yīng)值和離子化效率的常用有效手段[13]。該試驗比較了甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-2 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸）、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-2 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸）的分離效果。結(jié)果表明，甲醇和乙腈對目標(biāo)化合物響應(yīng)值無顯著差異，但甲醇的黏度大，作為流動相時色譜柱柱壓較高，保留時間延長。加入2 mmol/L甲酸銨后，色譜峰峰型更尖銳，對稱性更好。選擇乙腈-2 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸）作為流動相時獲得的11種喹諾酮類藥物的色譜圖見圖1。

2.2?提取和凈化條件優(yōu)化

2.2.1?提取條件的優(yōu)化。

喹諾酮類藥物的分子結(jié)構(gòu)中均含有羧基和叔氨基[14]，易溶于酸性或堿性溶液中，通常采用酸性乙腈溶液或酸性甲醇溶液作為提取溶劑。考慮到火鍋底料中含有較多的油脂和蛋白質(zhì)[15]，而乙腈具有良好沉淀蛋白的作用，帶出的極性成分較少，能在一定程度上減少基質(zhì)效應(yīng)。

火鍋底料樣品黏度大，在乙腈提取前需要對樣品進行分散，增加后續(xù)提取溶劑與樣品的接觸面積。該試驗比較了超純水和0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液對樣品的回收率的影響。結(jié)果表明，0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液的提取效率明顯好于超純水，這是因為Na2EDTA作為是一種良好的螯合物，可與樣品中的金屬離子絡(luò)合，使目標(biāo)化合物游離出來，從而提高提取效率[16]。因此，該試驗確定先用0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液分散樣品，再以1%甲酸乙腈提取。

2.2.2?凈化條件的優(yōu)化。

火鍋底料基質(zhì)復(fù)雜，為提高檢測靈敏度，降低基質(zhì)干擾，需對提取液進行凈化。該試驗考察了液液萃取[11]、分散固相萃取[10]、固相萃取3種凈化方式，并選擇Oasis HLB [12]和Oasis Prime HLB等不同類型的固相萃取柱進行凈化效果的比較。結(jié)果表明（圖2），液液萃取法和分散固相萃取法雖然方法簡單，但凈化效果不理想，凈化液較混濁，回收率偏低，使用Oasis HLB及 Oasis Prime HLB固相萃取柱凈化后，凈化液澄清透明，回收率均大于80%，但Oasis HLB固相萃取柱需經(jīng)活化、上樣、淋洗和洗脫等多個步驟，操作繁瑣，而Oasis Prime HLB固相萃取柱可以一步法凈化，在保證凈化效果的同時簡化了前處理步驟，提高檢測效率。因此，凈化方法選擇Oasis Prime HLB固相萃取柱凈化。

2.3?基質(zhì)效應(yīng)?樣品中基質(zhì)成分會對分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)[16]。該試驗采用提取后添加法，測定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛饶繕?biāo)化合物的離子響應(yīng)強度，通過二者比值來評價基質(zhì)效應(yīng)（ME）。結(jié)果表明（表2），在經(jīng)過優(yōu)化樣品前處理方法后，部分喹諾酮類藥物仍然存在不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)。該試驗采用同位素內(nèi)標(biāo)法進行定量，一方面可以補償基質(zhì)效應(yīng)，一方面也減少了樣品處理過程中可能帶來的誤差，提高定量準(zhǔn)確性。

2.4?線性范圍、檢出限和定量限?配制6 個濃度5、10、25、50、100和200 μg/L為混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，內(nèi)標(biāo)物濃度均為25 μg/L，在優(yōu)化的分析條件下，進行測定。以各目標(biāo)化合物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

對空白火鍋底料樣品進行低水平加標(biāo)試驗，計算信噪比（S/N）。以3倍信噪比和10倍信噪比對應(yīng)的濃度為檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。11種喹諾酮類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQ見表2。

2.5?回收率與精密度

選取空白火鍋底料樣品進行了3個不同濃度水平的加標(biāo)回收試驗，6次平行試驗的結(jié)果見3。從表3可看出，在添加濃度范圍內(nèi)，11種喹諾酮類藥物的平均回收率為78.5%～103.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.8%～9.1%。結(jié)果表明該方法具有較好的回收率，可以滿足日常檢測要求。

2.6?實際樣品的分析

應(yīng)用該方法對15 個不同品牌和批次的火鍋底料進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11種喹諾酮類藥物均未檢出。

3?結(jié)論

該試驗建立了通過型固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋底料中11種喹諾酮類藥物的分析方法，優(yōu)化了色譜質(zhì)譜條件以及提取凈化條件。與傳統(tǒng)固相萃取技術(shù)相比，該方法簡便、快速、檢測效率高，能很好地應(yīng)用于日常大批量檢測。

參考文獻

[1] 岳振峰，林秀云，唐少冰，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物組織中的16種喹諾酮類藥物殘留[J].色譜，2007，25（4）：491-495.

[2] 林黎，張毅，涂小珂，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定化妝品中的25種喹諾酮類藥物[J].色譜，2015，33（3）：275-281.

[3] 李婧妍，郭春鋒，崔立輝，等.QuEChERS HPLC-MS/MS法測定禽肉中9種喹諾酮類獸藥殘留量[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（22）：153-157.

[4] 梁素丹，陳劍剛，張艷.全自動固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物肌肉中喹諾酮類和四環(huán)素類獸藥殘留[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2018，30（2）：151-157.

[5] 劉柏林，謝繼安，趙紫微，等.超高壓液相色譜-電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法同時測定禽類食品中11種喹諾酮類藥物[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志，2017，29（3）：316-321.

[6] 尹燕敏，沈穎青，朱月芳，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水和沉積物中磺胺類、喹諾酮類和氯霉素類抗生素殘留[J].分析科學(xué)學(xué)報，2015，31（2）：228-232.

[7] CAO G Z，ZHAN J，SHI X Z，et al. Analysis of 140 veterinary drugs and other contaminants in poultry muscle by ultrahighperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Chromatographia，2018，81 （4）：707-718.

[8] HE Z Y，WANG Y H，XU Y P，et al. Determination of antibiotics in vegetables using QuEChERSbased method and liquid chromatography-quadrupole linear ion trap mass spectrometry [J]. Food analytical methods，2018，11（10）：2857-2864.

[9] 陳磊，吳赟琦，趙志勇，等.QuEChERS/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定土壤中19種氟喹諾酮類抗生素殘留[J].分析測試學(xué)報，2019，38（2）：194-200.

[10] 曹鵬，牟妍，高飛，等.分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測火鍋食材中11種喹諾酮類藥物[J].色譜，2013，31（9）：862-868.

[11] 馮月超，王穎，王建鳳，等.液質(zhì)聯(lián)用法同時測定火鍋調(diào)料中15種喹諾酮類抗生素[J].分析試驗室，2016，35（8）：924-927.

[12] 國家市場監(jiān)督管理總局.豆制品、火鍋、麻辣燙等食品中喹諾酮類化合物的測定：BJS 201909[S].北京：國家市場監(jiān)管總局，2019.

[13] 董茂鋒，白冰，唐紅霞，等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定玉米及植株中胺唑草酮及其代謝物[J].分析化學(xué)，2015，43（5）：663-668.

[14] 劉芃巖，申杰，劉磊.復(fù)合模板印跡聚合物凈化液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定魚肉中氟喹諾酮類殘留[J].分析化學(xué)，2012，40（5）：693-698.

[15] 李興根，喬勇升，陳偉，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定火鍋底料中的5種罌粟殼生物堿殘留[J].分析測試學(xué)報，2018，37（4）：446-451.

[16] 林靜，張順，蔡挺，等. QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)同時測定大蒜中10種農(nóng)藥殘留[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，30（1）：159-166.