互花米草NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定與表達(dá)分析

王濤濤，楊勇，魏唯，林辰濤，馬留銀

研究報(bào)告

互花米草NAC轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定與表達(dá)分析

王濤濤1,2，楊勇1,2，魏唯2，林辰濤2，馬留銀2

1. 福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福州 350002 2. 福建農(nóng)林大學(xué)基礎(chǔ)林學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)研究中心，福州 350002

互花米草()作為一種海岸帶鹽生植物，高度耐鹽脅迫，但因?yàn)槿鄙賲⒖蓟蚪M，其耐鹽的分子機(jī)制卻尚未見報(bào)道。NAC家族蛋白是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物的生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答。為了鑒定互花米草NAC蛋白(SaNAC)并探究它們與互花米草生長發(fā)育及脅迫響應(yīng)之間的關(guān)系，本研究以互花米草三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考，通過與水稻()、擬南芥()和玉米()NAC蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合保守功能域進(jìn)一步篩選，最終找到62個(gè)SaNAC蛋白。從蛋白序列比對(duì)、進(jìn)化、motif預(yù)測、同源性比較、亞細(xì)胞定位、組織表達(dá)以及非生物脅迫下的基因差異表達(dá)等方面分別對(duì)互花米草NAC家族成員進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SaNAC蛋白均含有保守的NAM結(jié)構(gòu)域，且在進(jìn)化上與水稻NAC家族具有一定的相似性；SaNAC家族中的兩個(gè)蛋白SaNAC9和SaNAC49在細(xì)胞核表達(dá)；另外，本研究還發(fā)現(xiàn)互花米草基因表達(dá)具有高度組織和脅迫應(yīng)答差異性。這些結(jié)果表明互花米草NAC轉(zhuǎn)錄因子家族不僅具有保守的功能域，而且在調(diào)控互花米草的生長發(fā)育和非生物脅迫響應(yīng)過程中具有重要的作用。

互花米草；NAC；轉(zhuǎn)錄因子；基因家族；基因表達(dá)

由于固定生長的特點(diǎn)，植物極度依賴其所在的生存環(huán)境，因此環(huán)境因素對(duì)植物生長發(fā)育有著深遠(yuǎn)的影響[1]。其中，土壤鹽漬化是制約植物生產(chǎn)的主要環(huán)境壓力之一，高鹽脅迫誘使細(xì)胞膜解體、產(chǎn)生活性氧、削弱代謝過程、抑制光合作用和減弱營養(yǎng)吸收，進(jìn)而延緩植物生長和發(fā)育、降低農(nóng)林作物品質(zhì)[2]。因此，研究植物高鹽耐受性的調(diào)控機(jī)理具有十分重要的理論與實(shí)踐價(jià)值。

轉(zhuǎn)錄因子是一類重要的調(diào)控子，一般通過結(jié)合在脅迫相關(guān)基因的順式作用元件，參與植物對(duì)干旱、高鹽、低溫等非生物脅迫的響應(yīng)[3]。NAC (NAM、ATAF1/2和CUC2)家族是植物特有的且最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。NAC家族蛋白在N端擁有一個(gè)大約160個(gè)氨基酸殘基大小的保守區(qū)域，該區(qū)域被進(jìn)一步分為5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(A~E)[4,5]。在植物中，NAC轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控大量的生長過程，包括花形態(tài)建成[6]、根部發(fā)育[7]、葉片衰老[8]和種子萌發(fā)[9]等。同時(shí)NAC轉(zhuǎn)錄因子也參與植物各類脅迫應(yīng)答過程[10]，例如小麥() NAC家族因子TaNAC2TaNAC47和TaNAC67在促進(jìn)自身耐多種脅迫壓力過程中具有重要的作用[11~13]，林木類植物剛毛檉柳() ThNAC13因子能促進(jìn)檉柳和擬南芥()更加耐鹽及滲透脅迫[14]，表明NAC轉(zhuǎn)錄因子在促進(jìn)農(nóng)林物種耐脅迫改良方面均具有重要的利用價(jià)值。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的植物NAC家族被發(fā)掘和鑒定，大大加速了NAC蛋白在調(diào)控植物生長發(fā)育和脅迫應(yīng)答方面的研究。研究人員不僅在擬南芥和水稻()中發(fā)現(xiàn)117和151個(gè)NAC蛋白[15]，在大豆()和烏拉爾圖小麥()中也發(fā)現(xiàn)含有152和87個(gè)NAC蛋白[16,17]。同時(shí)，在一些林木植物如果梅()、白梨()和海岸松()中也分別識(shí)別出113、146和37個(gè)NAC因子[18~20]。分析NAC家族因子有助于探究植物在非生物脅迫下的應(yīng)答機(jī)理，然而大多數(shù)植物因?yàn)槿鄙俑哔|(zhì)量的參考基因組，NAC家族還沒有被系統(tǒng)地鑒定和研究。第三代轉(zhuǎn)錄組測序(Pacbio單分子測序)技術(shù)的誕生為很多缺少基因組的物種提供了可參考的全長轉(zhuǎn)錄組序列[21]，在一定程度上解決了這些物種家族分析研究上的難題。

互花米草()作為耐鹽性良好的鹽生植物，自1979年引入我國以后，廣泛分布于沿海地區(qū)的潮灘及河口灣地帶，根系發(fā)達(dá)，莖稈粗壯，能夠忍受惡劣的氣候和環(huán)境，尤其是高鹽脅迫。本研究以互花米草為對(duì)象，將全長轉(zhuǎn)錄組序列作為參考，通過與擬南芥、水稻和玉米NAC蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并經(jīng)過功能域分析和篩選，獲得62個(gè)SaNAC蛋白，隨后從序列比對(duì)、進(jìn)化比較、蛋白定位、組織表達(dá)以及非生物脅迫下的基因差異表達(dá)等角度對(duì)SaNAC家族進(jìn)行系統(tǒng)的分析，完成了NAC轉(zhuǎn)錄因子家族在互花米草轉(zhuǎn)錄組水平上的初步鑒定以及在生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)過程中的表達(dá)分析，為進(jìn)一步探究互花米草NAC蛋白功能及遺傳應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

互花米草種子和植株采自江蘇省贛榆市(E119°16?, N34°46?)，把種子浸泡在1.5%鹽水中并且儲(chǔ)存于4℃以備長期使用。幼苗種植：將互花米草種子放在含1/2 Hoaglang營養(yǎng)液的濾紙上萌發(fā)7 d，然后轉(zhuǎn)移至含有營養(yǎng)液的生長盒中繼續(xù)生長3周，期間每隔3 d更換一次營養(yǎng)液。鹽處理：將互花米草幼苗分別培養(yǎng)在正常營養(yǎng)液以及含350、500和800 mmol/L NaCl的營養(yǎng)液中24 h，然后進(jìn)行整株取樣并立即置于液氮保存。干旱處理：將4周大的互花米草幼苗放在干燥的濾紙上，分別在第0 h、1 h、8 h和24 h取樣并立即置于液氮保存。ABA處理：將4周大的互花米草幼苗放入含有100 μmol/L ABA[22]的營養(yǎng)液里培養(yǎng)，分別在第0 h、1 h、8 h和24 h取樣并凍存。

1.2 互花米草NAC家族的鑒定

擬南芥、水稻以及玉米NAC家族蛋白序列從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫上(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)下載，互花米草全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自于第三代Pacbio測序數(shù)據(jù)[23]，通過ORF預(yù)測(http://bioinformatics. ysu.edu/tools/OrfPredictor.html)獲得所有互花米草轉(zhuǎn)錄本對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。將擬南芥、水稻以及玉米的NAC蛋白序列分別與互花米草蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，值取小于?50，得到所有與NAC蛋白序列相似性較高的互花米草轉(zhuǎn)錄本序列號(hào)。根據(jù)序列號(hào)在互花米草轉(zhuǎn)錄組網(wǎng)站(http://plantpolya.org/SAPacBio/)下載對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本序列并通過ORF預(yù)測得到對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。將所有可能的SaNAC蛋白序列放在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)中進(jìn)行保守功能域預(yù)測，去除不含NAC功能域的蛋白，并得到最終的互花米草NAC家族蛋白。在ProtPaeam (https://web.expasy.org/protparam/)上進(jìn)行SaNAC蛋白氨基酸數(shù)量、分子量和等電點(diǎn)的分析，同時(shí)在Protcomp 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml? topic=protcomppl&group=programs&subgroup=proloc)上進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.3 序列比較、同源進(jìn)化樹分析和motif預(yù)測

利用DNAMAN軟件進(jìn)行復(fù)合序列比對(duì)，保守的結(jié)構(gòu)域參照擬南芥和水稻的NAC家族進(jìn)行劃分[5]。利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，選擇Neighbour- Joining方法，并設(shè)置自檢次數(shù)為1000次。利用MEME (http://meme-suite.org/)進(jìn)行motif預(yù)測，數(shù)量設(shè)置為10。

1.4 煙草瞬時(shí)表達(dá)

利用基因特異性引物(表1)從互花米草cDNA中擴(kuò)增和基因全長CDS序列，并連接到植物表達(dá)載體pCambia3301上GFP標(biāo)簽的N端，隨后將載體借助農(nóng)桿菌AGL0瞬時(shí)轉(zhuǎn)入煙草(L)葉片中。煙草浸染實(shí)驗(yàn)步驟：首先從轉(zhuǎn)化目的載體的培養(yǎng)板上挑取單克隆菌落培養(yǎng)并進(jìn)行PCR鑒定，然后取200 μL陽性菌液接入50 mL含有10 mmol/L MES、20 μmol/L 乙酰丁香酮以及相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。第二天，將菌液離心(4000 r/min，15 min)，并用適量體積重懸液(10 mmol/L MES、150 μmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L MgCl2)將沉淀混勻至值為1.0~1.5之間，重懸的菌液放置室溫2 h后用無菌注射器輕輕注射入新鮮煙草的葉片中，并對(duì)注射位置進(jìn)行標(biāo)記。將煙草放在暗室過夜培養(yǎng)后繼續(xù)放置溫室生長1~2 d。進(jìn)行顯微觀察時(shí)，取小塊注射位置的葉片浸泡在1 mg/L的DAPI染液中30 min，分別在倒置顯微鏡(型號(hào)Zeiss Axio Observer.A1)下觀察SaNAC9、SaNAC49以及對(duì)照蛋白在GFP和DAPI通道下的熒光表達(dá)，找到同時(shí)表達(dá)的核定位信號(hào)后與明場圖片進(jìn)行重疊。

1.5 SaNAC基因家族表達(dá)模式分析與驗(yàn)證

1.5.1 RNA-seq數(shù)據(jù)分析

表達(dá)模式分析參考互花米草轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[23]，RNA-seq數(shù)據(jù)從Bioproject(PRJNA413596)下載。使用bowtie2 (v2.2.9)[24]將測序數(shù)據(jù)與互花米草全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，最后使用RSME[25]對(duì)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得到基因標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)量FPKM值。

表1 本研究使用的引物序列

下劃線部分代表載體構(gòu)建接頭序列。

1.5.2 RT-PCR驗(yàn)證

用試劑盒(廣州美基生物公司，R4151-02)提取不同組織(葉、莖、根和地下莖)以及脅迫處理的互花米草幼苗總RNA，具體操作參照說明書進(jìn)行，對(duì)RNA進(jìn)行定性定量檢測確保其質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取1 μg RNA，利用MonScript? RTIII All-in-One Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(武漢莫納生物公司，RN05004M)合成第一鏈cDNA，具體操作參照說明書進(jìn)行，將cDNA的濃度稀釋至5 ng/μL后備用。挑選、、、、、、、、、、和基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，引物序列如表1所示。擴(kuò)增前先用內(nèi)參基因?qū)δ０暹M(jìn)行均一化，然后取合適體積的模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系：10 μL MonAmp? 2× Taq Mix (武漢莫納生物公司，MP05001)，0.5 μL正向引物，0.5 μL反向引物，適當(dāng)體積的模板cDNA，適量體積RNAse-free水，總體系20 μL。反應(yīng)程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

1.5.3 qRT-PCR驗(yàn)證

通過qRT-PCR驗(yàn)證、、、、、、、、、、、、、、和基因在互花米草葉、莖、地下莖和根部的表達(dá)量，同時(shí)驗(yàn)證、、、、、、、、、、和基因在ABA及干旱處理下的表達(dá)量。引物在Primer3 (http://primer3.ut.ee/)網(wǎng)站上設(shè)計(jì)，GC含量在40%~60%且值在55℃~65℃之間，序列如表1所示。每個(gè)qRT-PCR反應(yīng)體系包含1 μL正反向引物(10 μmol/L)、1 μL cDNA模板、7 μL RNAse-free水和10 μL SYBRGreen Master Mix(莫納生物，RN04002M)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min；95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。樣本之間的表達(dá)量差異使用-test進(jìn)行計(jì)算，值小于0.01定義為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 互花米草NAC轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定

為了從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出含有功能域的NAC轉(zhuǎn)錄因子，本研究首先對(duì)復(fù)合序列比對(duì)產(chǎn)生的所有可能NAC蛋白進(jìn)行保守功能域分析。CDD (Conserved Domain Database)預(yù)測結(jié)果顯示，62個(gè)SaNAC蛋白在N端均含有NAM結(jié)構(gòu)域(附圖1)。NAM是NAC家族蛋白特有的結(jié)構(gòu)域(NAM、ATAF1/2和CUC2)之一，也是NAC轉(zhuǎn)錄因子能夠發(fā)揮結(jié)合功能的關(guān)鍵區(qū)域，預(yù)測結(jié)果表明62個(gè)SaNAC蛋白均是具有潛在NAC功能的轉(zhuǎn)錄因子。

根據(jù)三代全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)所有互花米草基因的命名[23]，按從小到大的順序?qū)⒒セ撞軳AC蛋白命名為SaNAC1~SaNAC62，然后根據(jù)氨基酸序列對(duì)所有SaNAC蛋白的基礎(chǔ)特征包括氨基酸數(shù)量、蛋白分子重量、等電點(diǎn)以及蛋白定位進(jìn)行預(yù)測(表2)。通過分析發(fā)現(xiàn)，SaNAC蛋白大小介于186~ 858個(gè)氨基酸之間，蛋白分子量則介于21.2~93.2 kDa之間，其中SaNAC6和SaNAC15分別對(duì)應(yīng)最大和最小的蛋白。所有SaNAC蛋白的等電點(diǎn)在4.3~ 10.7之間，SaNAC47和SaNAC2蛋白分別具有最大和最小的等電點(diǎn)。蛋白定位預(yù)測結(jié)果顯示大多數(shù)SaNAC蛋白定位在細(xì)胞核，少數(shù)蛋白定位在細(xì)胞外(表2)。

表2 互花米草NAC蛋白基本信息

續(xù)表

2.2 蛋白序列比對(duì)及功能域分析

復(fù)合序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，所有的互花米草NAC蛋白在N端都具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域(圖1)，這與擬南芥和水稻的報(bào)道結(jié)果相一致[5]。除了少數(shù)基因具有不完整的NAC結(jié)構(gòu)域外，大多數(shù)基因具有5個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域(A~E)。其中，蛋白SaNAC2、SaNAC3、SaNAC13和SaNAC60缺少A、B結(jié)構(gòu)域；SaNAC58缺少B、C結(jié)構(gòu)域；SaNAC25缺少A、B和C結(jié)構(gòu)域；SaNAC46、47、51和53缺少E結(jié)構(gòu)域。蛋白序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)一步證明了SaNAC家族蛋白在N端具有保守的NAM功能域(A~D)，表明SaNAC轉(zhuǎn)錄因子可能與其他植物NAC蛋白功能相似。

為了研究互花米草NAC轉(zhuǎn)錄因子之間的進(jìn)化關(guān)系，本研究利用62個(gè)SaNAC蛋白序列構(gòu)建NJ進(jìn)化樹。通過進(jìn)化樹分析將互花米草NAC家族分成9個(gè)小組，分別命名為a~I (圖2)。其中小組e中包含最多的SaNAC蛋白，有12個(gè)，小組b中的SaNAC蛋白最少，只有2個(gè)，分別是SaNAC4和SaNAC10。為了進(jìn)一步探究NAC蛋白功能域之間的關(guān)系，對(duì)所有的SaNAC蛋白序列進(jìn)行motif分析(MEME)，通過預(yù)測最終獲得10個(gè)保守的motif (motif 1~10) (圖2)。分析motif與蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)motif 3、4、1、7、2和5分別對(duì)應(yīng)SaNAC轉(zhuǎn)錄因子N端5個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)A~D，其中motif 2和motif 7共同組成結(jié)構(gòu)域D。另外，SaNAC11、29、36、38、40和58蛋白缺少motif 1和4，但是都擁有motif 6。Motif 8則主要存在于小組d和h中，而motif 9則出現(xiàn)在一些SaNAC蛋白的C端。結(jié)合小組分類分析motif，發(fā)現(xiàn)小組g中的全部NAC蛋白均具有不完整的NAC亞結(jié)構(gòu)，而小組a、b、d里的NAC蛋白亞結(jié)構(gòu)最為完整，其他小組里都有個(gè)別基因缺少某些亞結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖1 互花米草NAC蛋白序列比對(duì)

黑色線框圈出的位置代表不同的亞結(jié)構(gòu)域A~E，不同顏色代表序列之間的相似性程度(黑色>紅色>綠色>黃色)，線框下方的Logo代表對(duì)應(yīng)亞結(jié)構(gòu)域的保守序列。

圖2 互花米草NAC家族進(jìn)化及MEME分析

左側(cè)為SaNAC家族NJ進(jìn)化樹，a~i代表進(jìn)化樹不同的小組；右側(cè)為SaNAC蛋白MEME預(yù)測結(jié)果，1~10代表不同的motif。

2.3 互花米草與水稻NAC家族進(jìn)化分析

為了探究互花米草與水稻NAC家族成員之間的進(jìn)化關(guān)系，本研究利用MEGA7軟件構(gòu)建互花米草與水稻NAC蛋白NJ進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果顯示，所有NAC蛋白被分為12個(gè)小組(Ⅰ~Ⅻ)，其中小組Ⅰ中蛋白數(shù)量最多，包含11個(gè)SaNAC和18個(gè)OsNAC蛋白，小組Ⅲ中蛋白數(shù)量最少，不包含SaNAC蛋白。小組Ⅷ和Ⅺ中也只包含1個(gè)(SaNAC9)及2個(gè)(SaNAC36和SaNAC44) SaNAC蛋白，說明互花米草基因組在長期的進(jìn)化過程中可能丟失了一些基因。但是，幾乎所有小組都同時(shí)包含互花米草和水稻NAC蛋白，表明兩個(gè)物種的NAC家族在進(jìn)化水平上具有一定的相似性。

2.4 互花米草NAC蛋白亞細(xì)胞定位

蛋白定位預(yù)測結(jié)果表明大多數(shù)互花米草NAC轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中(表1)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SaNAC蛋白的表達(dá)定位，本研究將和基因全長CDS序列克隆到植物表達(dá)載體pCambia3301中，并利用煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將目的載體和空載體對(duì)照同時(shí)轉(zhuǎn)入煙草葉片表皮中。通過對(duì)SaNAC蛋白表達(dá)GFP信號(hào)的觀察以及煙草葉片細(xì)胞核的染色，可以清楚的發(fā)現(xiàn)SaNAC9和SaNAC49蛋白在煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)(圖4)。

圖3 互花米草與水稻NAC家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

Ⅰ~Ⅻ分別代表進(jìn)化樹的不同小組。

2.5 互花米草NAC基因在不同組織中的表達(dá)特征

為了研究基因在互花米草不同組織中的表達(dá)情況，本研究隨機(jī)挑選16個(gè)基因，并通過qRT-PCR檢測它們在互花米草的葉、莖、根以及地下莖中的表達(dá)量。結(jié)果顯示，這些基因在互花米草不同組織中的表達(dá)量各不相同，其中、和在葉片表達(dá)量最高，而和則在地下莖中有較高的表達(dá)量(圖5)。另外，和在根部有較高的表達(dá)量，這些基因在莖中的表達(dá)量都相對(duì)較低(圖5)。結(jié)果顯示，基因的表達(dá)具有一定的組織差異性，表明基因可能與互花米草的生長發(fā)育有關(guān)。

圖4 互花米草NAC蛋白亞細(xì)胞定位

BF代表明場通道下的細(xì)胞，GFP和DAPI分別代表綠色熒光和細(xì)胞核信號(hào)，Merge代表BF、GFP和DAPI圖像的重疊。所有圖像在顯微鏡下放大倍數(shù)：20′。

2.6 互花米草NAC基因在鹽脅迫下的表達(dá)特征

為了探究基因在鹽脅迫下的表達(dá)特征，結(jié)合不同濃度(0、350、500以及800 mmol/L)NaCl處理下的互花米草RNA-seq測序數(shù)據(jù)[23]，對(duì)所有基因的表達(dá)水平進(jìn)行了系統(tǒng)分析。通過不同鹽濃度處理下的表達(dá)熱圖可以看出，大部分基因在鹽處理下發(fā)生了差異表達(dá)(圖6A)，說明鹽脅迫可以調(diào)控基因的表達(dá)。其中和隨著鹽濃度的升高表達(dá)量持續(xù)降低(圖6A)，表明這些基因可能負(fù)向調(diào)控互花米草的鹽脅迫響應(yīng)。在800 mmol/L高鹽處理時(shí)，與對(duì)照組相比，以及等25個(gè)基因表達(dá)量顯著增加，基因的表達(dá)量上調(diào)最多，增加近60倍，表明高鹽對(duì)基因具有顯著調(diào)控作用。其中S以及等10個(gè)基因隨著鹽濃度的增加，表達(dá)量呈逐漸上升趨勢(圖6A)。另外，一些基因隨著鹽濃度的增加，表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，例如以及等(圖6A)，表明這些基因雖然受鹽脅迫的調(diào)控，但具有一定的濃度范圍，一旦超過最適的濃度，則開始發(fā)生負(fù)向調(diào)控。為了證明RNA-seq數(shù)據(jù)分析的可信性，本研究挑選了、、、、、、、、、、和基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證(圖6B)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RNA-seq分析結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明鹽脅迫調(diào)控互花米草NAC家族基因的表達(dá)。

2.7 互花米草NAC基因在ABA處理下的表達(dá)特征

NAC家族除了調(diào)控植物響應(yīng)鹽脅迫，還參與多種脅迫的調(diào)控過程[12,13]。脫落酸(abscisic acid, ABA)信號(hào)通路已被確定為植物非生物脅迫反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)因子,可以引起植物生理反應(yīng)和基因的表達(dá)[26]，為了探究互花米草基因在ABA脅迫下的表達(dá)變化，對(duì)12個(gè)隨機(jī)的基因在ABA處理下的表達(dá)量進(jìn)行檢測。qRT-PCR結(jié)果顯示，在ABA處理下，大部分檢測的基因發(fā)生了表達(dá)量的改變(圖7)。其中，及的表達(dá)隨著ABA處理時(shí)間的增加逐漸降低，、、及則在ABA處理下呈現(xiàn)顯著上調(diào)的趨勢，這些基因中只有的表達(dá)水平?jīng)]有受到ABA的影響(圖7)，表明基因的表達(dá)受到ABA的調(diào)控。

圖5 16個(gè)SaNAC基因組織表達(dá)特征

每個(gè)樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，葉片的表達(dá)量被均一化成1。

2.8 互花米草NAC基因在干旱處理下的表達(dá)特征

與ABA脅迫類似，植物對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答同樣是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過程[27]。研究表明水稻ONAC066和ONAC095蛋白都參與干旱脅迫的調(diào)控[28,29]，大豆NAC家族因子在抗旱過程中也具有重要作用[30]，表明NAC蛋白是植物干旱脅迫響應(yīng)過程中的重要調(diào)控子。本研究對(duì)12個(gè)基因在干旱脅迫下的基因表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，與ABA脅迫類似，干旱脅迫促進(jìn)大多數(shù)基因發(fā)生差異表達(dá)(圖8)。其中和在干旱處理時(shí)表達(dá)量均呈顯著上調(diào)趨勢，且除在干旱脅迫下表現(xiàn)出顯著下調(diào)的趨勢，其中和基因的表達(dá)量在1 h干旱處理時(shí)先降至最低，然后隨著處理時(shí)間的增加開始逐漸增加(圖8)。這些結(jié)果表明干旱脅迫同樣可以調(diào)控基因的表達(dá)。外，其他基因的表達(dá)量都表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。和

圖6 SaNAC基因在不同鹽濃度下的表達(dá)特征

A：不同濃度鹽脅迫下所有基因的表達(dá)熱圖。表達(dá)量的值經(jīng)過均一化后呈現(xiàn)在熱圖的右邊，紅色代表高表達(dá)，綠色代表低表達(dá)。B：12個(gè)鹽脅迫應(yīng)答基因的RT-PCR驗(yàn)證作為RT-PCR擴(kuò)增均一化的內(nèi)參基因。

3 討論

互花米草作為高度耐鹽的鹽生植物，在沿海地帶具有良好的生長優(yōu)勢。NAC家族蛋白具有保守的結(jié)構(gòu)域和功能域，對(duì)植物的生長發(fā)育以及非生物脅迫應(yīng)答具有重要的作用[16,18,20]。本研究從互花米草全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出62個(gè)完整的NAC轉(zhuǎn)錄因子，明顯少于擬南芥和水稻基因組中的數(shù)目[5]。三代測序技術(shù)雖然可以得到較長的基因序列，但受到文庫構(gòu)建和機(jī)器讀取不確定性的影響，相比基因組測序存在基因測序不全的缺點(diǎn)，因此互花米草NAC家族成員的完整性還有待進(jìn)一步確定和完善。

蛋白序列比對(duì)結(jié)果顯示SaNAC家族蛋白在N端含有基本的NAC結(jié)構(gòu)域，除了SaNAC2、SaNAC3和SaNAC13等一些蛋白缺少個(gè)別亞結(jié)構(gòu)域(A~E)外，絕大多數(shù)SaNAC蛋白都含有完整的NAC結(jié)構(gòu)。NAC蛋白結(jié)構(gòu)可以分為兩個(gè)部分：N端保守的DNA結(jié)合區(qū)域(BD)和C端變化的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域(TR)[5]，其中BD包含150~160個(gè)氨基酸殘基，主要被分為A~E五個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，與DNA結(jié)合、同源或異源二聚體的形成以及核定位具有密切聯(lián)系。保守功能域預(yù)測結(jié)果顯示SaNAC蛋白均含有NAM功能域，NAM區(qū)域雖然只包含A~D共4個(gè)NAC亞結(jié)構(gòu)域，但結(jié)構(gòu)域E卻是AtNAM蛋白一個(gè)重要的DNA結(jié)合區(qū)域[31]，因此可以用NAM結(jié)構(gòu)域來替代分析NAC結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)也證明SaNAC9和SaNAC49在細(xì)胞核里表達(dá)，這些分析結(jié)果共同表明SaNAC蛋白可能發(fā)揮植物NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能。

圖7 ABA處理下12個(gè)SaNAC基因的表達(dá)特征

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，處理0 h的樣本表達(dá)量被均一化為1，星號(hào)代表ABA處理1 h、8 h或者24 h的樣本與0 h樣本之間具有差異。*表示<0.05，樣本之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；**表示<0.01，樣本之間具有顯著性差異；***表示<0.001，****表示<0.0001，均代表樣本之間具有極顯著差異。

在進(jìn)化分組上共同位于某一小組的蛋白一般具有相似程度較高的序列，因此可能發(fā)揮相似的蛋白功能。互花米草與水稻同為單子葉植物，在結(jié)構(gòu)上具有一定的相似之處，而且研究表明互花米草基因與水稻具有90%以上的相似度[32]，因此分析它們NAC家族蛋白之間的進(jìn)化保守性(圖3)，有助于更好的研究互花米草NAC蛋白的功能。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示互花米草與水稻NAC蛋白相似程度較高，因此可以通過分析水稻NAC蛋白來預(yù)測互花米草NAC同源蛋白的功能。水稻ONAC095 (Os06g51070)被證明參與干旱和冷脅迫的響應(yīng)，在干旱和ABA處理下，基因表達(dá)量增加，通過顯性嵌合抑制因子抑制基因的表達(dá)后減少了水稻體內(nèi)水分的丟失并且增加了脯氨酸和可溶性糖的含量，同時(shí)使一些干旱相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生上調(diào)，從而促進(jìn)水稻抗干旱脅迫[29]?；セ撞軸aNAC2、SaNAC18、SaNAC28、SaNAC31、SaNAC32、SaNAC34及SaNAC51與OsNAC095蛋白共同位于X小組，研究發(fā)現(xiàn)、和基因在干旱處理下的表達(dá)量同樣增加，因此猜測這些蛋白可能同樣參與互花米草對(duì)干旱脅迫的調(diào)控。

圖8 干旱處理下12個(gè)SaNAC基因的表達(dá)特征

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，處理0 h的樣本表達(dá)量被均一化為1，星號(hào)代表干旱處理1 h、8 h或者24 h的樣本與0 h樣本之間具有顯著性差異。*表示<0.05，樣本之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；**表示<0.01，樣本之間具有顯著性差異；***表示<0.001，****表示<0.0001，均代表樣本之間具有極顯著差異。

組織表達(dá)差異是基因選擇性表達(dá)的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基因在互花米草葉、莖、根以及地下莖中的表達(dá)具有明顯差異?；蛟跀M南芥里的同源基因編碼一種轉(zhuǎn)錄激活因子，在干旱誘導(dǎo)的葉片衰老過程中，通過與ROS生物合成酶基因的啟動(dòng)子直接結(jié)合來促進(jìn)ROS的產(chǎn)生[33]?；セ撞菽軌蛏L在潮水漲落頻繁的海岸帶，主要原因之一是具有發(fā)達(dá)的地下根莖系統(tǒng)，地下莖的橫向擴(kuò)張也是互花米草繁殖的主要途徑之一。本研究結(jié)果顯示基因在互花米草地下莖中的表達(dá)量相對(duì)較高，同時(shí)在干旱處理下表達(dá)量也顯著上調(diào)，因此猜測基因參與的干旱應(yīng)答過程可能在互花米草地下莖中進(jìn)行。在擬南芥的同源基因，參與調(diào)控?cái)M南芥韌皮部薄壁轉(zhuǎn)移細(xì)胞壁的生長[34]，的同源基因，也影響擬南芥纖維次生細(xì)胞壁發(fā)育以及增加纖維細(xì)胞面積相關(guān)基因的表達(dá)[35]，和基因在互花米草葉片中具有較高的表達(dá)，卻在莖稈部分表達(dá)量較低，表明它們很可能同樣參與調(diào)控互花米草器官的生長發(fā)育。另外，葉片中含有鹽腺是互花米草耐鹽的特點(diǎn)之一，根部吸收的鹽大多可以由鹽腺排出體外，因此葉片在互花米草的耐鹽過程中也極為重要[36]。在研究紅樹林的鹽腺時(shí)，發(fā)現(xiàn)相比葉肉組織，在富含鹽腺的組織中紅樹林基因具有更高的表達(dá)量[37]，說明NAC家族因子可能參與調(diào)控鹽腺器官的發(fā)育。因此，大量基因在互花米草葉片中的高度表達(dá)，可能與鹽腺的發(fā)育以及耐鹽的調(diào)控有關(guān)。

為了系統(tǒng)的研究非生物脅迫對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，本研究同時(shí)分析了鹽、ABA以及干旱脅迫對(duì)基因表達(dá)的影響。耐鹽是互花米草最顯著的特征，找出耐鹽相關(guān)基因?qū)ρ芯科錂C(jī)理具有重要意義。非生物脅迫的控制機(jī)制依賴于大量脅迫相關(guān)基因的激活和調(diào)控[38]，通過RNA-seq數(shù)據(jù)和qRT- PCR分析發(fā)現(xiàn)和基因同時(shí)受到高鹽、ABA和干旱脅迫的調(diào)控，基因的表達(dá)量在3種脅迫下均顯著增加，表明這些基因都是潛在的脅迫相關(guān)基因，在非生物脅迫的調(diào)控過程中可能扮演重要的角色。其中，的同源基因參與調(diào)控?cái)M南芥對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答[33]，的同源基因調(diào)控?cái)M南芥細(xì)胞的衰老[39]，而同源基因則可以負(fù)向調(diào)控ABA信號(hào)通路[40]，充分顯示基因在互花米草組織發(fā)育和對(duì)非生物脅迫應(yīng)答方面的重要作用，同時(shí)也表明互花米草對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答是一個(gè)多基因復(fù)雜調(diào)控的過程。本研究豐富了互花米草NAC家族轉(zhuǎn)錄因子的信息，不僅為更好的研究互花米草生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)機(jī)制提供一定的參考，同時(shí)也為農(nóng)林作物耐鹽改良提供良好的基因資源。

附錄：

附圖1詳見文章電子版www.chinagene.cn。

[1] Zhu JK. Abiotic stress signaling and responses in plants., 2016, 167(2): 313–324.

[2] Anumalla M, Roychowdhury R, Geda CK, Bharathkumar S, Goutam KD, Dev TSSM. Mechanism of stress signal transduction and involvement of stress inducible transcri-ption factors and genes in response to abiotic stresses in plants., 2016, 7(8): 12754–12771.

[3] Khan SA, Li MZ, Wang SM, Yin HJ. Revisiting the role of plant transcription factors in the battle against abiotic stress., 2018, 19(6): E1634.

[4] Aida M, Ishida T, Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M. Genes involved in organ separation in Arabidopsis: an analysis of the cup-shaped cotyledon mutant., 1997, 9(6): 841–857.

[5] Ooka H, Satoh K, Doi K, Nagata T, Otomo Y, Murakami K, Matsubara K, Osato N, Kawai J, Carninci P, Hayashizaki Y, Suzuki K, Kojima K, Takahara Y, Yamamoto K, Kikuchi S. Comprehensive analysis of NAC family genes inand., 2003, 10(6): 239–247.

[6] Sablowski RW, Meyerowitz EM. A homolog of NO APICAL MERISTEM is an immediate target of the floral homeotic genes APETALA3/PISTILLATA., 1998, 92(1): 93–103.

[7] Wang TZ, Liu M, Zhao MG, Chen R, Zhang WH. Identification and characterization of long non-coding RNAs involved in osmotic and salt stress inusing genome-wide high-throughput sequencing., 2015, 15: 131.

[8] Kim HJ, Nam HG, Lim PO. Regulatory network of NAC transcription factors in leaf senescence., 2016, 33: 48–56.

[9] Park J, Kim YS, Kim SG, Jung JH, Woo JC, Park CM. Integration of auxin and salt signals by the NAC transcrip-tion factor NTM2 during seed germination in., 2011, 156(2): 537–549.

[10] Sun LJ, Li DY, Zhang HJ, Song FM. Functions of NAC transcription factors in biotic and abiotic stress responses in plants., 2012, 34(8): 993–1002.孫利軍, 李大勇, 張慧娟, 宋鳳鳴. NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病和抗非生物脅迫反應(yīng)中的作用. 遺傳, 2012, 34(8): 993–1002.

[11] Mao XG, Chen SS, Li A, Zhai CC, Jing RL. Novel NAC transcription factor TaNAC67 confers enhanced multi-abiotic stress tolerances in., 2014, 9(1): e84359.

[12] Mao XG, Zhang HY, Qian XY, Li A, Zhao GY, Jing RL. TaNAC2, a NAC-type wheat transcription factor conferring enhanced multiple abiotic stress tolerances in., 2012, 63(8): 2933–2946.

[13] Zhang LN, Zhang LC, Xia C, Zhao GY, Jia JZ, Kong XY. The novel wheat transcription factor TaNAC47 enhances multiple abiotic stress tolerances in transgenic plants., 2015, 6: 1174.

[14] Wang LQ, Li Z, Lu MZ, Wang YC. ThNAC13, a NAC transcription factor from, confers salt and osmotic stress tolerance to transgenic Tamarix and., 2017, 8: 635.

[15] Nuruzzaman M, Manimekalai R, Sharoni AM, Satoh K, Kondoh H, Ooka H, Kikuchi S. Genome-wide analysis of NAC transcription factor family in rice., 2010, 465(1–2): 30–44.

[16] Sun H, Hu ML, Li JY, Chen L, Li M, Zhang SQ, Zhang XL, Yang XY. Comprehensive analysis of NAC transcri-ption factors uncovers their roles during fiber develop-ment and stress response in cotton., 2018, 18(1): 150.

[17] Ma JH, Tong DD, Zhang WL, Zhang DJ, Shao Y, Yang Y, Jiang L. Identification and analysis of the NAC transcri-ption factor family in., 2016, 38(3): 243–253.馬建輝, 仝豆豆, 張文利, 張黛靜, 邵云, 楊云, 姜麗娜. 烏拉爾圖小麥NAC轉(zhuǎn)錄因子的篩選與分析. 遺傳, 2016, 38(3): 243–253.

[18] Gong X, Zhao LY, Song XF, Lin ZK, Gu BJ, Yan JX, Zhang SL, Tao ST, Huang XS. Genome-wide analyses and expression patterns under abiotic stress of NAC transcri-ption factors in white pear ()., 2019, 19(1): 161.

[19] Pascual MB, Cánovas FM, ávila C. The NAC transcrip-tion factor family in maritime pine (): molecular regulation of two genes involved in stress responses., 2015, 15: 254.

[20] Zhuo XK, Zheng TC, Zhang ZY, Zhang YC, Jiang LB, Ahmad S, Sun DL, Wang J, Cheng TR, Zhang QX. Genome-wide analysis of the NAC transcription factor gene family reveals differential expression patterns and cold-stress responses in the woody plant., 2018, 9(10): 494.

[21] Rhoads A, Au KF. PacBio sequencing and its applications., 2015, 13(5): 278– 289.

[22] Karan R, Subudhi PK. Overexpression of an adenosine diphosphate-ribosylation factor gene from the halophytic grass Spartina alterniflora confers salinity and drought tolerance in transgenic., 2014, 33(2): 373–384.

[23] Ye WB, Wang TT, Wei W, Lou ST, Lan FX, Zhu S, Li QZ, Ji GL, Lin CT, Wu XH, Ma LY. The full-length transcrip-tome of Spartina alterniflora reveals the complexity of high salt tolerance in monocotyledonous halophyte., 2020,DOI：10.1093/pcp/pcaa013.

[24] Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2., 2012, 9(4): 357–359.

[25] Li B, Dewey CN. RSEM: accurate transcript quantifica-tion from RNA-Seq data with or without a reference genome., 2011, 12: 323.

[26] Finkelstein R. Abscisic acid synthesis and response., 2013, 11: e0166.

[27] Todaka D, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. Recent advances in the dissection of drought-stress regulatory networks and strategies for development of drought- tolerant transgenic rice plants., 2015, 6: 84.

[28] Yuan X, Wang H, Cai JT, Bi Y, Li DY, Song FM. Rice NAC transcription factor ONAC066 functions as a positive regulator of drought and oxidative stress response., 2019, 19(1): 278.

[29] Huang L, Hong YB, Zhang HJ, Li DY, Song FM. Rice NAC transcription factor ONAC095 plays opposite roles in drought and cold stress tolerance., 2016, 16(1): 203.

[30] Hussain RM, Ali M, Feng X, Li X. The essence of NAC gene family to the cultivation of drought-resistant soybean () cultivars., 2017, 17(1): 55.

[31] Duval M, Hsieh TF, Kim SY, Thomas TL. Molecular characterization of AtNAM: a member of the Arabidopsis NAC domain superfamily., 2002, 50(2): 237–248.

[32] Bedre R, Mangu VR, Srivastava S, Sanchez LE, Baisakh N. Transcriptome analysis of smooth cordgrass (), a monocot halophyte, reveals candidate genes involved in its adaptation to salinity., 2016, 17(1): 657.

[33] Lee S, Seo PJ, Lee HJ, Park CM. A NAC transcription factor NTL4 promotes reactive oxygen species production during drought-induced leaf senescence in., 2012, 70(5): 831–844.

[34] Wu YZ, Hou JX, Yu F, Nguyen STT, Mccurdy DW. Transcript profiling Identifies NAC-domain genes involved in regulating wall ingrowth deposition in phloem parenchyma transfer cells of., 2018, 9: 341.

[35] Hussey SG, Mizrachi E, Spokevicius AV, Bossinger G, Berger DK, Myburg AA. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development infibres and increases fibre cell area in Eucalyptus., 2011, 11: 173.

[36] Skelding AD, Winterbotham J. The structure and develop-ment of the hydathodes of, 1939, 38(1): 69–79.

[37] Jyothi-Prakash PA, Mohanty B, Wijaya E, Lim TM, Lin Q, Loh CS, Kumar PP. Identification of salt gland-associated genes and characterization of a dehydrin from the salt secretor mangrove., 2014, 14: 291.

[38] Haak DC, Fukao T, Grene R, Hua Z, Ivanov R, Perrella G, Li S. Multilevel regulation of abiotic stress responses in plants., 2017, 8: 1564.

[39] Takasaki H, Maruyama K, Takahashi F, Fujita M, Yoshida T, Nakashima K, Myouga F, Toyooka K, Yamaguchi- Shinozaki K, Shinozaki K. SNAC-As, stress-responsive NAC transcription factors, mediate ABA-inducible leaf senescence., 2015, 84(6): 1114–1123.

[40] Liu YC, Sun J, Wu YR.ATAF1 enhances the tolerance to salt stress and ABA in transgenic rice., 2016, 129(5): 955–962.

Identification and expression analyses of the NAC transcription factor family in

Taotao Wang1,2, Yong Yang1,2, Wei Wei2, Chentao Lin2, Liuyin Ma2

As a coastal halophytehas high salt tolerance. However, the mechanism at the molecular level has not been widely studied due to the absence of a reference genome. The proteins of NAC families are plant-specific transcription factors that regulate the growth, development and stress response in plants. To identify the NAC family and explore the relationship between NACproteins and the growth, development and stress response of, full-length transcriptome data ofby the third generation sequencing technology was used as reference sequences in this study to blast with the NAC protein sequences from,and. Finally, 62 SaNAC proteins were found inby deep analysis on conserved domains. Then we analyzed sequence alignment, evolution, motif prediction, homology comparison, subcellular localization, tissue and abiotic stress-induced gene differential expression profile on the NAC family members in. As a result, all SaNAC proteins were found containing a conserved NAM domain and having certain evolutionary similarity with rice; two family proteins, SaNAC9 and SaNAC49, were expressed in the nucleus; moreover,genes were identified to have distinct expressional profiles in different tissues and stress response ofThese results indicated the SaNAC transcription factor family not only had conserved functional domains but also played important role in the regulation of growth, development and abiotic stress response.

; NAC; transcription factor; gene family; gene expression

2019-08-27;

2019-12-26

福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)高峰學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào)：71201800725，71201800773)和福建農(nóng)林大學(xué)優(yōu)秀博士學(xué)位論文基金項(xiàng)目(編號(hào)：324-1122yb043)資助[Supported by Peak Subject Construction Project of Fujian Agricultural and Forestry University (Nos. 71201800725, 71201800773) and Scientific Research Foundation of the Graduate School of Fujian Agriculture and Forestry University (No. 324-1122yb043)]

王濤濤，博士研究生，研究方向：林木遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)。E-mail: fjnlwtt@163.com

馬留銀，博士，副教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。E-mail: lma223@163.com

10.16288/j.yczz.19-250

2020/2/21 11:21:17

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200220.1501.001.html

(責(zé)任編委: 趙方慶)