一種蛋白質(zhì)游離氨基含量測定方法—三硝基苯磺酸法的探究

褚千千，韓秋煜，陳必文，2，包斌，2*

1 (上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海， 201306)2 (食品科學(xué)與工程國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海， 201306)

食品是一個復(fù)雜的混合體系，蛋白質(zhì)可以與其他食物成分形成復(fù)合物，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)、功能和營養(yǎng)特性的變化。通過分析蛋白質(zhì)游離氨基、巰基、二硫鍵、表面疏水性等指標(biāo)的變化可以評價蛋白質(zhì)與其他物質(zhì)發(fā)生的反應(yīng)[1-3]。其中蛋白質(zhì)的游離氨基含量可采用茚三酮法[4]、三硝基苯磺酸 (trinitrobrnzen sulfonic acid,TNBS) 法[5]、鄰苯二甲醛 (O-phthaladehyde，OPA) 法[6]、高效液相色譜法[7]等方法進(jìn)行分析。其中TNBS法因其靈敏度高、操作方便應(yīng)用最為廣泛，本文針對TNBS法進(jìn)行探討。

TNBS法是基于伯氨基與TNBS的定量反應(yīng)，通過TNBS與伯胺在弱堿性條件下反應(yīng)形成具有發(fā)色團(tuán)的中間絡(luò)合物(圖1)，中間絡(luò)合物在355 nm和420 nm附近有最大吸收值。蛋白質(zhì)中的巰基含量會影響TNBS法結(jié)果的準(zhǔn)確性[8]，因?yàn)閹€基基團(tuán)會和TNBS發(fā)生反應(yīng)。TNBS法應(yīng)用最廣泛的是測定蛋白質(zhì)水解物中游離氨基的含量[9-12]。近年來有些學(xué)者也用此方法，通過分析蛋白質(zhì)游離氨基的變化研究小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)反應(yīng)的機(jī)理[13-16]。以上研究中，終止反應(yīng)的方法部分采用加入鹽酸，也有加入亞硫酸氫鈉，但未見文獻(xiàn)對這2種終止反應(yīng)的方法進(jìn)行比較和探討。因此本文在采用TNBS法時，在分析較優(yōu)的反應(yīng)條件基礎(chǔ)上，選擇巰基含量不同的蛋白質(zhì)(牛血清蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶)，用紫外-可見分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀比較分析蛋白質(zhì)游離氨基含量的準(zhǔn)確性和靈敏性，并討論了它們的優(yōu)勢和不足。同時，探討了蛋白質(zhì)中的巰基含量對分析結(jié)果的影響，以期為采用TNBS法評價蛋白質(zhì)游離氨基含量的變化提供參考。

圖1 TNBS與游離氨基的反應(yīng)

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛血清蛋白(BSA),上海美倫生物科技有限公司；溶菌酶,上海生物工程股份有限公司；胰蛋白酶,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；TNBS,Sigma；L-亮氨酸,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaHSO3等,均為分析純。

UV1102紫外分光光度計(jì)，上海譜元儀器有限公司；SH-1000 Lab連續(xù)光波可調(diào)全波長酶標(biāo)儀，廣州濟(jì)恒生物科技有限公司；96孔酶標(biāo)板，上?？祵幱邢薰荆籋H-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，深圳市超杰生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 TNBS與游離氨基的反應(yīng)

紫外-可見分光光度計(jì)測定：參照ADLER-NISSE[5]的方法，略有改動。取待測溶液125 μL，加入1 mL pH 8.2的緩沖溶液及1 mL 0.1% TNBS，將混合好的樣品置于50 ℃的暗處搖勻1 h。將樣品取出后加入2 mL HCl，至于暗處，30 min后于最大吸收波長下測吸光值。

酶標(biāo)儀測定：分析步驟同分光光度計(jì)，在測定體系中樣品用量以及反應(yīng)底物均縮減為紫外-可見分光光度計(jì)測定的10倍。用石英96孔酶標(biāo)板進(jìn)行測定。

1.2.1.2 堿性條件下終止反應(yīng)

紫外-可見分光光度計(jì)測定：參照CROWELL[8]的方法，略有改動。取待測溶液125 μL，加入1 mL pH 8.2的緩沖溶液及1 mL 0.1% TNBS，將混合好的樣品置于50 ℃的暗處搖勻1 h。將樣品取出后加入2 mL NaHSO3，至于暗處，30 min后于最大吸收波長下測吸光值。

酶標(biāo)儀測定：分析步驟同分光光度計(jì)，在測定體系中樣品用量以及反應(yīng)底物均縮減為紫外-可見分光光度計(jì)測定的10倍。用96孔酶標(biāo)板進(jìn)行測定。

1.2.2 測定波長的選擇

酸性條件：準(zhǔn)確配制0.5 mmol/L的L-亮氨酸，分析步驟同1.2.1.1。以超純水作對照進(jìn)行基線掃描，在200～400 nm波長掃描，確定反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長。

堿性條件：準(zhǔn)確配制0.5 mmol/L的L-亮氨酸，分析步驟同1.2.1.2。以超純水作對照進(jìn)行基線掃描，在400～600 nm波長掃描，確定反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長。

人壽險可以選擇定期壽險及終身壽險，從性價比上來看，定期壽險會是較優(yōu)的選擇，一般來說女性費(fèi)率更低，繳費(fèi)期限選擇較長的較好。健康險除了上述的百萬醫(yī)療，還可以額外為自己加一份女性特定重疾保障。意外險建議選擇30萬或50萬保額，保障責(zé)任可以以自己需求來選擇。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以L-亮氨酸為游離氨基底物，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，方法同1.2.1。比較不同條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇TNBS與游離氨基反應(yīng)的最優(yōu)條件。

1.2.4 三種蛋白質(zhì)游離氨基含量的分析

準(zhǔn)確配制不同濃度的牛血清蛋白、溶菌酶、胰蛋白酶的水溶液，在最優(yōu)條件下測定游離氨基含量，測定方法同1.2.1。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)與分析

本文實(shí)驗(yàn)所有樣品均為3組平行。作圖采用Origin Pro 9.1軟件，采用SPSS statistic 22.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

由圖2可知，TNBS與0.5 mmol/LL-亮氨酸在酸性條件終止反應(yīng)得到的反應(yīng)產(chǎn)物在340 nm處有最大吸收波長，結(jié)果與SATAKE等[17]得到的一致；在堿性條件終止反應(yīng)得到的反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長為420 nm，(圖3)，結(jié)果與FIELDS[18]的描述一致。

圖2 TNBS與L-亮氨酸在酸性條件下反應(yīng)產(chǎn)物的波長掃描

圖3 TNBS與L-亮氨酸在堿性條件下反應(yīng)產(chǎn)物的波長掃描

2.2 不同反應(yīng)條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較

圖4、圖5為酸性與堿性反應(yīng)條件下分別采用紫外-可見分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀所獲得的L-亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。不論是采用紫外-可見分光光度計(jì)還是酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，同一濃度L-亮氨酸在堿性條件下得到的吸光度值都高于酸性條件。采用紫外-可見分光光度計(jì)測定時，各濃度L-亮氨酸在堿性條件下所得到的吸光度值比酸性條件的高0.03～0.04；采用酶標(biāo)儀時，堿性比酸性條件下吸光度值高0.03。說明此反應(yīng)在堿性條件下有更高的響應(yīng)。特別是在L-亮氨酸濃度很低時(0.1 mmol/L)，2種儀器測得的酸性條件下的吸光度值很低。因而堿性條件更適合作為TNBS法的終止方式，特別是在樣品濃度較低的情況下。因此在測定蛋白質(zhì)游離氨基含量時我們選擇在堿性條件下終止反應(yīng)。

圖4 紫外-可見分光光度計(jì)酸性與堿性條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較

圖5 酶標(biāo)儀酸性與堿性條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較

圖6為堿性反應(yīng)條件下紫外-可見分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較。紫外-可見分光光度計(jì)所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率明顯高于酶標(biāo)儀(P<0.01)，說明紫外-可見分光光度計(jì)測得的吸光度值對濃度的敏感程度高于酶標(biāo)儀，底物濃度即使變化較小，紫外-可見分光光度計(jì)所得數(shù)據(jù)的變化較酶標(biāo)儀更明顯。范鵬等[19]采用紫外分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀測定鹽酸川芎嗪含量時發(fā)現(xiàn)紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率也高于酶標(biāo)儀，與本文得到的結(jié)果一致。因此，在測定濃度變化較小的樣品的游離氨基含量時，可以優(yōu)先考慮采用紫外-可見分光光度計(jì)進(jìn)行分析。

圖6 堿性條件下紫外-可見分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀標(biāo)準(zhǔn)曲線的對比

綜上所述，通過不同條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較可知，TNBS法測定游離氨基含量時，選擇在堿性條件下終止反應(yīng)，采用紫外-可見分光光度計(jì)測定是較優(yōu)的方法。

2.3 紫外-可見分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀測定3種蛋白質(zhì)游離氨基含量的比較

選擇在堿性反應(yīng)條件下，利用紫外-可見分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀，測定不同濃度牛血清蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶的游離氨基含量，并對分析結(jié)果進(jìn)行比較。

2種儀器測得的牛血清蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶的游離氨基含量都隨濃度的增加而增加(表1)。在0.02 mmol/L下，2種儀器測得的牛血清蛋白、胰蛋白酶游離氨基含量差異顯著(P<0.05)，其他濃度下差異不顯著(P>0.05)。在0.1 mmol/L下，2種儀器測得的溶菌酶游離氨基含量差異顯著(P<0.05)，其他濃度下差異性不顯著(P>0.05)。當(dāng)樣品濃度較低時，由于儀器檢出限的不同，會出現(xiàn)差異性。肖婷等[20]等采用紫外分光光度計(jì)比色法與酶標(biāo)儀微量法比較了菜青蟲Pierisrapae(L.)體內(nèi)酚氧化酶蛋白含量和活力，發(fā)現(xiàn)微量法和比色法在檢測酚氧化酶(phenoloxidase，PO)蛋白含量、酶活力和抑制劑對PO抑制作用時結(jié)果無顯著性差異。此外，由標(biāo)準(zhǔn)差可以看出，紫外-可見分光光度法的變異程度較酶標(biāo)儀較小，說明誤差較??；由標(biāo)準(zhǔn)誤可以看出，紫外-可見分光光度法的精確度較酶標(biāo)儀高。因此，紫外-可見分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀都可用于游離氨基含量測定，綜合二者的優(yōu)缺點(diǎn)并且根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和樣品性質(zhì)選擇合適的方法進(jìn)行測定。

表1 兩種方法測定不同濃度蛋白質(zhì)游離氨基含量的比較

注：同一行不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

2.4 蛋白質(zhì)種類對TNBS法分析游離氨基含量的影響

為了探討蛋白質(zhì)種類對TNBS法分析游離氨基的影響，我們比較了同一濃度下的牛血清蛋白、胰蛋白酶、溶菌酶的游離氨基含量。當(dāng)濃度為0.1 mmol/L時，牛血清蛋白、胰蛋白酶和溶菌酶的游離氨基含量分別為(1.30±0.01) mmol/L、(0.42±0.04)mmol/L、(0.08±0.001) mmol/L(圖7)。這種差異首先是由蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定。牛血清蛋白是包含583個氨基酸殘基，86個游離氨基的一種球蛋白；胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白水解酶，含有223個氨基酸殘基，36個游離氨基；溶菌酶由129個氨基酸組成，含有15個游離氨基[21]。因而，在用此方法分析蛋白質(zhì)游離氨基含量時，樣品的濃度要根據(jù)蛋白質(zhì)本身含有的游離氨基數(shù)量進(jìn)行調(diào)整，樣品中所含蛋白質(zhì)的游離氨基數(shù)量多，取樣量可適當(dāng)減少。

值得注意的是，采用TNBS法測得的每2個蛋白之間游離氨基含量的比值高于理論上每2個蛋白之間游離氨基數(shù)量的比值。牛血清蛋白的游離氨基含量約是胰蛋白酶的3倍，而理論上牛血清蛋白的游離氨基數(shù)量約是胰蛋白酶的2.4倍；胰蛋白酶的游離氨基含量約是溶菌酶的12倍，而理論上胰蛋白酶的游離氨基含量約是溶菌酶的6倍。推測蛋白質(zhì)中可能存在其他能與TNBS反應(yīng)的基團(tuán)。ADLER-NISSEN[5]曾提出過蛋白質(zhì)中的巰基基團(tuán)會影響TNBS和蛋白質(zhì)中游離氨基的反應(yīng)。巰基存在于蛋白質(zhì)半胱氨酸殘基上，牛血清蛋白含有35個半胱氨酸，17個二硫鍵；胰蛋白酶含有14個半胱氨酸，12個二硫鍵；溶菌酶是4個二硫鍵銜接起來的單鏈多肽，含有8個半胱氨酸。這些巰基很可能與TNBS反應(yīng)，造成這些蛋白所測的游離氨基含量高于實(shí)際游離氨基的含量，影響到游離氨基分析的準(zhǔn)確性。KOTAKI等[22]也證實(shí)了在氨基和巰基共同存在的情況下，TNBS優(yōu)先與氨基結(jié)合。因此采用TNBS法時，如果比較不同蛋白質(zhì)游離氨基的含量，需要考慮巰基含量對結(jié)果的影響。另外，巰基很容易氧化成二硫鍵，而二硫鍵由于不牢固也很容易還原成巰基。因此，二硫鍵的存在也可能會對結(jié)果造成影響。對于涉及到二硫鍵的還原的反應(yīng)體系，不適合用該法測定。

圖7 不同種類蛋白質(zhì)游離氨基含量的變化

3 討論

TNBS法是一種可以直接測量蛋白質(zhì)游離氨基含量的簡便方法，堿性條件下的吸光度值對濃度的響應(yīng)值高于酸性條件，在樣品濃度較低的情況下，建議選擇堿性終止條件。紫外可見分光光度計(jì)和酶標(biāo)儀2種測定方法對蛋白質(zhì)游離氨基含量的測定結(jié)果在蛋白濃度非常低的范圍內(nèi)有顯著差異，濃度較高時，其結(jié)果沒有顯著性差異，但是紫外-可見分光光度計(jì)對濃度變化響應(yīng)更靈敏，誤差小且精確度高。綜合紫外-可見分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀的優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用時根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和樣品性質(zhì)選擇合適的方法，保證實(shí)驗(yàn)的可行性與結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時采用方法時，需要根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)游離氨基的數(shù)量確定樣品分析濃度，且需考慮蛋白質(zhì)中巰基和二硫鍵的多少和變化對該方法結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。