基于PCR-DGGE技術(shù)分析宣威火腿中真菌群落結(jié)構(gòu)

鄒穎玲，劉姝韻，王桂瑛*，普岳紅，葛長(zhǎng)榮，廖國(guó)周*

1(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明，650201)2(云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南 昆明，650201)

宣威火腿是云南省傳統(tǒng)名特優(yōu)產(chǎn)品，其以“身穿綠袍，色香味美，咸淡相宜，風(fēng)味獨(dú)特，食而不膩”等特點(diǎn)名揚(yáng)海內(nèi)外，距今已有270年的歷史[1]，它是選用宣威當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)烏金豬的后腿，利用宣威獨(dú)特的氣候及地理?xiàng)l件在當(dāng)?shù)亟?jīng)過腌制、發(fā)酵、成熟制作而成[2]。云南省宣威市獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候條件造就了宣威火腿特定的品質(zhì)[3]。獨(dú)特的天然環(huán)境，促進(jìn)火腿微生物的大量繁殖，從而使火腿持續(xù)發(fā)酵[4]。微生物對(duì)肉制品的風(fēng)味形成及品質(zhì)有著獨(dú)特的作用，發(fā)酵時(shí)期，由于微生物的作用會(huì)使原料中的蛋白質(zhì)、脂肪等發(fā)生生化變化，進(jìn)而影響發(fā)酵肉制品的品質(zhì)，促進(jìn)其產(chǎn)生芳香化合物，提升肉制品的風(fēng)味[5]。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophorsis，PCR-DGGE)是一種分析微生物群落的有效工具，MUZYERS[6]等首次將PCR-DGGE技術(shù)應(yīng)用于研究微生物多樣性，近年來該項(xiàng)技術(shù)被應(yīng)用于研究食品微生態(tài)、鑒定微生物、評(píng)價(jià)食品質(zhì)量如益生菌制品[7]、酸面團(tuán)[8]、奶酪[9]、肉制品[10]、甜酒曲[11]等。目前，利用PCR-DGGE技術(shù)分析不同加工時(shí)間宣威火腿中真菌群落結(jié)構(gòu)還未見報(bào)道?；诖?，本研究通過PCR-DGGE技術(shù)分析不同加工年份(1、2和3年)宣威火腿中的真菌群落結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步探討宣威火腿品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宣威火腿樣品由云南省宣威市宣泰火腿有限公司提供，并分別在加工1、2和3年火腿的表面和內(nèi)部(距肉表面5 cm)取約10 g肉樣品，標(biāo)記為：A1、A2(1年腿的表面和內(nèi)部)，B1、B2(2年腿的表面和內(nèi)部)，C1、C2(3年腿的表面和內(nèi)部)。后將6個(gè)樣品真空包裝，置于-20℃保存以待分析。

乙醇、冰醋酸、硝酸銀、37%甲醛、NaOH,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；環(huán)境微生物DNA提取試劑盒、50×TAE buffer、ddH2O,北京博友順有限公司；DNA純化試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞,天根生化科技公司；dNTPs、rTaq、pMD18-T Cloning Kit,日本Takara公司；40% Acrylamide/Bis,美國(guó)Bio-Rad公司；Formamide (deionized)、Urea、APS,美國(guó)Amresco公司；TEMED,美國(guó)Sigma公司；Poly-Gel DNA Extraction Kit,美國(guó)OMEGA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge 5415D 離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司；T-gradient PCR儀,德國(guó)Biometra公司；SDC-6恒溫槽,寧波新芝有限公司；Gel-Doc2000凝膠成像儀,美國(guó)伯樂Bio-Rad公司；JY-SPFT CTAB,北京軍意東方儀器有限公司；Dcode變形梯度凝膠電泳儀,美國(guó)伯樂Bio-Rad公司；DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒有限公司；ZHWY-100C搖床,上海智城有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品中總DNA的提取

根據(jù)環(huán)境微生物DNA提取試劑盒方法對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行總DNA提取。具體操作步驟如下，取肉樣品0.5 g置于離心管中，加入緩沖液沒過離心管，漩渦振蕩5 min，后用多層無菌紗布過濾收集濾液，轉(zhuǎn)入2 mL離心管；加入100 mg玻璃珠，在高速振蕩器上振蕩約5 min；加入蛋白酶K，充分混勻，55 ℃水浴消化30 min；12 000 r/min離心2 min直至沒有沉淀；取上清液加入200 μL DNA提取試劑盒溶液B和200 μL無水乙醇，混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱中靜置2 min；12 000 r/min離心2 min后，棄廢液，然后漂洗吸附柱2次；12 000 r/min離心2 min，將吸附柱放在50 ℃恒溫箱一段時(shí)間后加洗脫液，室溫放置5 min后，12 000 r/min離心1 min；往吸附柱中加入離心所得洗脫液，室溫放置2 min，12 000 r/min離心2 min，即可得到基因組DNA，所得DNA置于-20 ℃保存以待分析。

1.3.2 真菌18S rDNA基因的PCR擴(kuò)增

真菌通用引物[12]如表1所示。

表1 用于18S rDNA擴(kuò)增的通用引物

以樣品基因組DNA為模板，以GC-Fung和NS1為引物擴(kuò)增樣品，得到18S rDAN高變區(qū)序列。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)為10× Ex Taq buffer(緩沖) 2.5 μL；dNTP(2.5 mmol/L)2 μL；ExTaqPolymerase(5 U/μL)0.25 μL；GC-FungF(10 mmol/L)1 μL；NS1(10 mmol/L)1 μL；模板DNA 0.05 μg；補(bǔ)ddH2O至25 μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 min，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸15 s，30個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收。

1.3.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

參考郭繼平等[13]的方法，稍作修改。取10 μL PCR的產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分析。變性梯度凝膠梯度為20%～40%，膠濃度為6%，電泳溫度控制在60 ℃，用220 V電壓預(yù)電泳5 min，接著在150 V條件下電泳8 h。電泳結(jié)束后、采用銀染法染色，條帶顯現(xiàn)后用Gel-Doc2000凝膠成像儀拍照、記錄。

1.3.4 條帶切膠回收與克隆測(cè)序

參考鄭艷等[14]的方法，用經(jīng)過滅菌的手術(shù)刀切下待回收DGGE條帶，采用OMEGA 公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶。以回收產(chǎn)物(2 μL)為模板，以Fung/NS1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)為10× PCR buffer 5 μL；dNTP(2.5 mmol/L)3.2 μL；rTaq(5 U/μL)0.4 μL；Fung(10 mmol/L)1μL；NS1(10 mmol/L)1 μL；模板DNA 1 μL；補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；最后，72 ℃延伸10 min。將重新擴(kuò)增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到Pmd18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4 真菌多樣性指數(shù)計(jì)算

真菌多樣性指數(shù)是研究群落物種數(shù)和個(gè)體數(shù)以及均勻度的綜合指標(biāo)。根據(jù)電泳圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個(gè)條帶的強(qiáng)度(灰度)，對(duì)各樣品中真菌多樣性指數(shù)(H)、均勻度(E)和豐富度(S)等指標(biāo)進(jìn)行分析。利用Quantity one軟件分析DGGE圖譜，而香農(nóng)指數(shù)(H)、豐度(S)和均衡指數(shù)(E)等指標(biāo)被用來比較不同樣品間的多樣性情況[15]。其算法參考鄭艷等[14]的方法，計(jì)算如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：pi為樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率；N為DGGE圖譜單一泳道上所有條帶的豐度；Ni為第i條帶的豐度；S為某樣品中總條帶數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 宣威火腿中真菌18S rDNA的PCR擴(kuò)增

以GC-Fung和NS1為引物，以從不同加工年份宣威火腿的表面和內(nèi)部6個(gè)樣品中提取的總DNA為模板進(jìn)行18S rDNA片段擴(kuò)增，得到220 bp左右的片段(圖1)，符合DGGE分析。

圖1 GC-PCR檢測(cè)

2.2 DGGE指紋圖譜及分析結(jié)果

對(duì)宣威火腿中的真菌總DNA進(jìn)行DGGE分析，DGGE圖譜如圖2所示，泳道中每1條亮帶代表1種真菌，不同位置的條帶代表不同種屬真菌，條帶越亮代表相應(yīng)的種屬真菌相對(duì)數(shù)量越多[16]。由圖2和圖3可知，共檢測(cè)到30條不同條帶，表明宣威火腿中豐富的真菌種類，不同加工年份宣威火腿樣品的電泳條帶分離效果較好，條帶的亮度也各有不同，其中1年腿表面有22個(gè)主要條帶，內(nèi)部有19個(gè)；2年腿表面有17個(gè)，內(nèi)部有22個(gè)；3年腿表面有23個(gè)，內(nèi)部有17個(gè)。

圖2 宣威火腿樣品的DGGE圖譜

圖3 宣威火腿樣品的DGGE條帶強(qiáng)度示意圖

2.3 主要電泳條帶的測(cè)序比對(duì)結(jié)果分析

將宣威火腿樣品主要的30條電泳條帶進(jìn)行克隆與測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)得到表2。由表2可知，切膠測(cè)序的30個(gè)條帶中有27條可以在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到，與其序列的同源性均在96%以上。

結(jié)合DGGE圖譜與表2可知，加工1年宣威火腿表面最亮的條帶為1、11和27，其中條帶1為Aspergilluspseudoglaucus(假灰綠曲霉)，條帶11為Aspergillusoryzae(米曲霉)，條帶27為Wallemiasebi。加工1年宣威火腿內(nèi)部最亮的條帶為1、22和27，其中條帶22為Yamadazymatriangularis。加工2年宣威火腿表面最亮的條帶為1和5，其中條帶5為Aspergilluspenicillioides(帚狀曲霉)。2年宣威火腿內(nèi)部最亮的條帶為1和14，其中條帶14為Aspergillusglaucus(灰綠曲霉)。加工3年宣威火腿表面最亮的條帶為1、3、16、22和27，其中條帶3為Phialosimplexcaninus，條帶16為Aspergillusniger(黑曲霉)，條帶22為Yamadazymatriangularis。加工3年宣威火腿內(nèi)部最亮的條帶為1、5和27，其條帶分別為Aspergilluspseudoglaucus(假灰綠曲霉)、Aspergilluspenicillioides(帚狀曲霉)和Wallemiasebi。由PCR-DGGE圖譜可知，不同加工年份宣威火腿的表面及內(nèi)部均檢測(cè)出Aspergilluspseudoglaucus(假灰綠曲霉)，由此可以推斷，Aspergilluspseudoglaucus(假灰綠曲霉)是宣威火腿的優(yōu)勢(shì)菌種。

表2 宣威火腿樣品DGGE主要條帶的序列比對(duì)結(jié)果

2.4 樣品間真菌群落結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)與聚類分析

DGGE圖譜的相似性是通過Quantity One軟件進(jìn)行分析的，通過分析得到不同加工年份宣威火腿真菌群落相似性指數(shù)。由表3可知，加工2年宣威火腿內(nèi)部與加工3年表面的真菌群落結(jié)構(gòu)相似性最高，為69.3%，加工1年內(nèi)部與加工2年表面的真菌群落結(jié)構(gòu)相似性最低，為42.7%。從宣威火腿表面看，加工1年的與加工3年表面真菌群落結(jié)構(gòu)相似性為60.9%，分別比加工1年與加工2年表面真菌群落結(jié)構(gòu)相似性、加工2年與加工3年表面真菌群落結(jié)構(gòu)相似性高13.2%、15%。從宣威火腿內(nèi)部看，加工1年的與加工2年內(nèi)部真菌群落結(jié)構(gòu)相似性為60.5%，分別比分別比加工1年與加工3年內(nèi)部真菌群落結(jié)構(gòu)相似性和加工2年與加工3年內(nèi)部真菌群落結(jié)構(gòu)相似高12.4%、4.9%。

圖4為不同加工年份宣威火腿表面及內(nèi)部的條帶相似性聚類分析圖，由圖4可知，加工2年宣威火腿內(nèi)部與加工3年火腿表面相似度為69%，說明兩者間差異較小。加工2年火腿表面與其他加工年份表面及內(nèi)部5個(gè)樣品間的相似度為46%，說明2年火腿表面與其他5個(gè)樣品間差異較大。從整體看，不同加工年份火腿表面及內(nèi)部真菌群落結(jié)構(gòu)間存在一定的差異，這可能是隨著時(shí)間的變化，空氣對(duì)火腿的氧化，導(dǎo)致真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

表3 戴斯系數(shù)比較宣威火腿樣品PCR-DGGE圖譜的相似性 單位：%

圖4 宣威火腿樣本間的聚類圖

2.5 宣威火腿樣品的真菌群落多樣性

微生物多樣性指數(shù)由于評(píng)估微生物群落的豐富度。香農(nóng)指數(shù)(H)用于評(píng)估微生物群落的多樣性，H值越大，說明微生物的種類和數(shù)量越多，微生物群落多樣性越高；均勻度指數(shù)(E)用于評(píng)估微生物分布的均勻程度，E值越大，說明微生物群落分布越均勻；豐富度指數(shù)(S)是指一個(gè)群落或生境中物種數(shù)目的多寡[17]。由表4可知，不同加工年份宣威火腿表面及內(nèi)部真菌群落多樣性有差異。加工3年宣威火腿表面及內(nèi)部的香農(nóng)指數(shù)分別是最高和最低的，說明其表面及內(nèi)部真菌群落多樣性分別是最高和最低的，加工1年腿表面真菌群落分布最均勻，而加工3年腿表面真菌群落豐富度指數(shù)最大。

表4 宣威火腿各樣品間的真菌群落多樣性分析

3 討論

宣威火腿所具有的特殊風(fēng)味與其漫長(zhǎng)的發(fā)酵過程密切相關(guān)，微生物的代謝活動(dòng)以及火腿表面大量霉菌的生長(zhǎng)是宣威火腿獨(dú)特風(fēng)味形成的基礎(chǔ)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，假灰綠曲霉、帚狀曲霉、假絲酵母屬存在于整個(gè)發(fā)酵期間的表面和內(nèi)部。霉菌是宣威火腿發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)真菌，這與黃艾祥等[19]對(duì)云南干腌火腿和甄宗圓等[20]對(duì)金華火腿的研究結(jié)果一致。霉菌的生長(zhǎng)對(duì)火腿風(fēng)味形成無直接作用，但對(duì)防止火腿氧化變質(zhì)、抑制有害微生物的生長(zhǎng)、提高火腿質(zhì)量有間接作用[21]。酵母菌的存在不但是火腿整個(gè)發(fā)酵期的優(yōu)勢(shì)有益菌群，而且對(duì)成熟火腿的VE、脯氨酸、色氨酸等香甜成分的增加及風(fēng)味的形成起重要作用[22]。NUNEZ等[23]對(duì)伊比麗亞干腌火腿中酵母菌的研究發(fā)現(xiàn)，誕沫假絲酵母是原料腿的優(yōu)勢(shì)菌，德巴利漢遜氏酵母是發(fā)酵腿、成熟腿的優(yōu)勢(shì)菌。MUHAMED等[24]研究了從香腸中分離出來的微生物菌株抗輻射情況，經(jīng)過抗輻射處理后，發(fā)現(xiàn)誕沫酵母菌(eandidazeylanoides)具有較強(qiáng)的抵抗力。本試驗(yàn)經(jīng)對(duì)云南宣威火腿分離鑒定出的酵母菌數(shù)量相對(duì)霉菌較少，最主要的有德巴利酵母屬和假絲酵母屬，這與黃艾祥[25]對(duì)云南干腌火腿的研究結(jié)果一致。

利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)微生物種群進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析與鑒定，能克服傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)與不足。傳統(tǒng)的微生物種群結(jié)構(gòu)分析方法是先進(jìn)行菌種分離培養(yǎng)再進(jìn)行單一菌種的鑒定，耗時(shí)長(zhǎng)，過程繁瑣，且自然界中有85%～99%的微生物至今還不可純培養(yǎng)，而利用DGGE技術(shù)可以直接對(duì)微生物進(jìn)行多種種群的鑒定[26]。但由于DGGE只能對(duì)微生物群落中數(shù)量>1%的優(yōu)勢(shì)種群進(jìn)行分析[27]，并且由于嵌合體、共遷移、異源雙鏈體等會(huì)導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生偏差，所以該技術(shù)也有一定的局限性[28]。因此充分了解該技術(shù)的基礎(chǔ)背景和局限性，結(jié)合其他分子生物學(xué)技術(shù)如酶學(xué)技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)等，才能從不同方面客觀的反映宣威火腿中真菌多樣性信息，為宣威火腿品質(zhì)的研究提供更好的技術(shù)支持。

4 結(jié)論

從不同加工年份宣威火腿中共檢測(cè)到了27種真菌，宣威火腿中主要的真菌為Aspergilluspseudoglaucus(假灰綠曲霉)、Phialosimplexcaninus、Aspergilluspenicillioides(帚狀曲霉)、Yamadazymatriangularis、Wallemiasebi、Candidaglucosophila等，其中Aspergilluspseudoglaucus(假灰綠曲霉)是宣威火腿的優(yōu)勢(shì)菌種。多樣性分析表明，加工3年的宣威火腿表面真菌群落多樣性最高，加工2年火腿表面真菌群落多樣性最低。加工2年火腿內(nèi)部真菌群落多樣性最高，加工3年火腿內(nèi)部真菌群落多樣性最低。相較于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法，采用PCR-DGGE技術(shù)分析宣威火腿的真菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果能夠更全面、更直觀，也為進(jìn)一步研究宣威火腿獨(dú)特風(fēng)味的形成提供了技術(shù)支持。