食品中羊肉源性成分微滴數(shù)字PCR定量方法的建立

陳傳君，金鷺，林華，胡濱*，韓國全*，陳世界，張婧，安微，楊苗

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625000)2(成都海關(guān)，四川 成都，610041)3(食品安全檢測四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都，610041)

肉及肉制品的摻假事件是國內(nèi)外廣泛關(guān)注的食品安全問題之一。肉類摻假不僅嚴(yán)重干擾肉類市場流通，侵害消費(fèi)者權(quán)益，而且還影響消費(fèi)者的健康甚至宗教信仰[1]。羊肉產(chǎn)品沒有文化和宗教禁忌，因其具有肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，同時(shí)又營養(yǎng)豐富而備受消費(fèi)者青睞。利用價(jià)格低廉的原料肉如鴨肉、豬肉、老鼠肉制造假羊肉，已是屢見報(bào)道[2]。因此，檢測肉制品中羊源性成分含量的方法具有重要意義。

目前，針對(duì)肉源性成分的檢驗(yàn)方法主要有電子鼻法、紅外光譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)法等，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(real-time quantitative PCR，qPCR)的應(yīng)用較為廣泛[3]。但qPCR技術(shù)通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板只能達(dá)到相對(duì)定量分析，其檢測靈敏度和準(zhǔn)確性還達(dá)不到精細(xì)定量要求[4]。目前我國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采用實(shí)時(shí)熒光PCR定性檢測肉品中某種動(dòng)物源性成分，但不能精確定量檢測樣品中所含有的肉源性成分含量，這使得在肉品摻假檢測過程中，很難判定是故意摻假，還是生產(chǎn)或取樣過程中意外污染所致[5]。因此，數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)作為一種對(duì)核酸進(jìn)行精確定量的全新方法應(yīng)運(yùn)而生，因?yàn)槠涓咄?、高靈敏度、高特異性被廣泛運(yùn)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)等領(lǐng)域。dPCR可以分為3種類型，即微孔板數(shù)字PCR法、微流控芯片數(shù)字PCR 法和微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)法。其中ddPCR法是利用油包水技術(shù)將其分割為數(shù)萬個(gè)納升級(jí)大小的微滴，每一個(gè)微滴都是一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系，當(dāng)PCR擴(kuò)增完成后，利用微滴分析儀逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測。再根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)中的泊松分布原理分析陽性微滴的個(gè)數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)低至單個(gè)拷貝核酸分子的絕對(duì)定量[6]。REN等[7]通過將ddPCR法與rPCR法應(yīng)用于檢測綿羊和山羊肉制品中的雞源性成分，研究表明ddPCR法在不同熱處理和超高的溫度下具有良好重復(fù)性和穩(wěn)定性，明顯優(yōu)于qPCR法。因此，對(duì)于食品源性成分的鑒定來說，ddPCR在定性和定量檢測方面都具有明顯的優(yōu)勢。但是，ddPCR應(yīng)用于肉源性成分定量檢測的難點(diǎn)在于如何將PCR擴(kuò)增得到的基因拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換成肉的質(zhì)量。如CAI等[8]利用ddPCR方法檢測肉制品中豬肉和雞肉質(zhì)量時(shí)，發(fā)現(xiàn)生肉質(zhì)量與DNA質(zhì)量以及DNA質(zhì)量和DNA拷貝數(shù)之間呈線性關(guān)系，能夠根據(jù)DNA拷貝數(shù)建立計(jì)算生肉質(zhì)量的公式。NOH等[9]采用ddPCR技術(shù)對(duì)海產(chǎn)品中阿拉斯加鱈魚的含量進(jìn)行測定，通過確立原始樣品質(zhì)量、DNA濃度和DNA拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，建立了基于DNA拷貝數(shù)的樣本質(zhì)量計(jì)算公式。由于該方法需要建立2組標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行兩步轉(zhuǎn)化，實(shí)驗(yàn)步驟增加，容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差加大。因此，如何將基因拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換成肉的質(zhì)量是值得深入研究的問題。

目前在有關(guān)肉品摻假檢測報(bào)道中，多是檢測某類肉中容易摻假的其他肉類，如在羊肉及其制品中檢測摻入的鴨肉含量，但市售摻假肉中多為2種或2種以上肉類的摻雜混合，這就給定量檢測帶來困難。由于直接對(duì)肉品中羊肉ddPCR精準(zhǔn)定量的報(bào)道較少，因此本研究將通過向樣品中添加牛肉作為內(nèi)標(biāo)，采用ddPCR對(duì)羊肉的單拷貝基因進(jìn)行定量檢測，根據(jù)基因拷貝數(shù)建立食品中羊肉源性成分ddPCR的定量檢測方法，以便為摻假肉的監(jiān)督管理提供一些技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

主要樣品：山羊肉、綿羊肉、鴨肉、水牛肉、黃牛肉、牦牛肉、豬肉、鹿肉、狐貍?cè)?、貂肉、兔肉、雞肉、鵝肉、鴿肉、火雞肉、鱈魚、大黃魚、虹鱒魚、銀鱈魚、大菱鲆，以上樣品均由四川出入境檢驗(yàn)檢疫局提供，-70 ℃保存。

Premix Ex Taq(probe qPCR)預(yù)混液，TaKaRa公司；蛋白酶K(20 mg/mL)，拓樣生物有限公司；Droplet Generator DG8 CartndgeDroplet Gene rator，BIO-RAD公司；ddPCR Supermix for Probes (no dutp)，BIO-RAD公司；ddPCR Droplet Generation Oil，BIO-RAD公司；DG8 GasketPierceable Foil Heat Seal，BIO-RAD公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FastPrep樣品研磨器，印度MP公司；Thermomixer Comfort恒溫混勻儀，德國eppendorf公司；X3R高速冷凍離心機(jī)，Thermo公司；CFX96 Real-time PCR 儀，Bio-Rad公司；QX100 Droplet Digital PCR系統(tǒng)，BIO-RAD公司；

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

取新鮮羊肉樣品的肌肉組織，絞肉機(jī)絞碎后于100 ℃烘干至恒重。在研缽中加入液氮，將烘干樣品研磨至粉末狀，室溫條件下保存于干燥皿中。準(zhǔn)確稱取處理后的肉粉100 mg，采用實(shí)驗(yàn)室自制的動(dòng)物組織基因組磁珠法提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，所得基因組DNA質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-2000核酸蛋白定量儀評(píng)價(jià)[10]。

1.2.2 羊肉、牛肉源性引物探針篩選設(shè)計(jì)

1.2.2.1 引物探針的選擇與設(shè)計(jì)

分別選定羊、牛的單拷貝生長激素基因GH(序列號(hào)分別為NC-019468、NC-000077)設(shè)計(jì)引物探針，再根據(jù)NCBI等網(wǎng)站中公布的不同物種間各基因序列進(jìn)行序列比對(duì)，設(shè)計(jì)的引物探針委托成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。

1.2.2.2 特異性驗(yàn)證

分別提取山羊、綿羊、水牛、黃牛、牦牛、豬、鹿、狐貍、鵝、兔、鴿、鱈魚、大黃魚、鴨、火雞、虹鱒魚、貂、雞、銀鱈魚、多寶魚等動(dòng)物肌肉DNA作為模板，分別對(duì)所設(shè)計(jì)篩選的羊源性、牛源性引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證。同時(shí)設(shè)立用ddH2O代替核酸的1個(gè)陰性對(duì)照驗(yàn)證其對(duì)引物的特異性。當(dāng)陰性對(duì)照為陰性時(shí)整個(gè)試驗(yàn)有效，可進(jìn)一步判定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次2個(gè)平行。

1.2.2.3 靈敏度驗(yàn)證

將提取的羊肉、牛肉DNA模板分別按梯度進(jìn)行稀釋，均稀釋至濃度為100、 10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)梯度2個(gè)平行，驗(yàn)證該方法靈敏度。

1.2.3 ddPCR定量方法的建立

1.2.3.1 ddPCR操作步驟

具體程序與步驟為：將各物種的反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至微滴生成卡中，并在反應(yīng)用油加樣孔加入70 μL的微滴成專用油；加樣完成后，將微滴生成卡轉(zhuǎn)移至微滴生成器中進(jìn)行微滴的生成；將生成微滴后的40 μL反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至96孔板中并封膜進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，50個(gè)循環(huán)；98 ℃加熱10 min使酶滅活。擴(kuò)增結(jié)束后，將96孔板取出，置于Droplet reader微滴讀取儀中進(jìn)行微滴熒光讀??；采用FAM/VIC雙通道熒光采集微滴信號(hào)，并通過分析熱點(diǎn)圖確定熒光閾值限以確定陰性微滴和陽性微滴。

以提取的羊DNA(約50 ng/μL)為模板，用ddPCR擴(kuò)增后的拷貝數(shù)確定羊源性特異性基因引物和探針最優(yōu)濃度，以及最佳退火溫度。最后用微滴分析儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行計(jì)數(shù)分析，最終以平均值確定羊肉核酸標(biāo)準(zhǔn)品的基因拷貝數(shù)。通過比較ddPCR微滴生成數(shù)，微滴分布狀態(tài)、微滴熒光信號(hào)強(qiáng)度等來確定優(yōu)化的結(jié)果。

1.2.3.2 ddPCR反應(yīng)體系和程序

ddPCR擴(kuò)增體系為：ddPCRTMSupermix for probes，10 μL；上游引物(10 p)，1.8 μL；下游引物(10 p)，1.8 μL；探針(10 p)，0.5 μL；模板(50 ng/μL)，2.0 μL；ddH2O，3.9 μL。

ddPCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸60 s，50個(gè)循環(huán)；98 ℃加熱10 min使酶滅活，擴(kuò)增結(jié)束。

1.2.3.3 羊、牛源性引物探針的ddPCR特異性驗(yàn)證

以提取的羊肉基因組DNA為研究對(duì)象，牛、豬、驢、馬、狐貍、兔DNA為對(duì)照模板進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物探針的ddPCR特異性，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照孔。

以提取的?；蚪MDNA為研究對(duì)象，山羊、驢、豬、鹿、貂、鴨肉的DNA為對(duì)照模板進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增，驗(yàn)證引物探針的ddPCR特異性，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照孔。

反應(yīng)程序及反應(yīng)體系參照1.2.2.2。

1.2.3.4 ddPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

ddPCR體系中羊、牛源性引物濃度優(yōu)化：羊、牛源性引物的ddPCR體系的引物濃度優(yōu)化處理方式相同，PCR反應(yīng)體系20 μL：ddPCRTMSupermix for Probes 10 μL，上、下游引物各1μL，設(shè)置上下游引物摩爾濃度0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 μmol/L，加入探針0.5 μL(0.4 μmol/L)，DNA模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)足20 μL體積。在體系充分混勻后加入Bio-Rad公司的微滴生成卡中，油包水微滴生成按照說明書進(jìn)行。將生成的微滴全部轉(zhuǎn)入96孔PCR反應(yīng)板中，進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件確定為：預(yù)變性95 ℃，10 min；變性94 ℃，30 s；60 ℃，1 min，40個(gè)循環(huán)；固化微滴98 ℃，10 min。

ddPCR體系中羊、牛源性探針濃度優(yōu)化：羊、牛源性引物的ddPCR體系的引物濃度優(yōu)化處理方式一致，PCR反應(yīng)體系20 μL：ddPCRTMSupermix for Probes 10 μL，上、下游引物各1 μL(0.9 μmol/L)，探針0.5 μL，設(shè)置探針摩爾濃度梯度為100、150、200、250、300 nmol/L，DNA模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)足20 μL體積。應(yīng)在體系充分混勻后加入Bio-Rad公司的微滴生成卡中，油包水微滴生成按照說明書進(jìn)行。將生成的微滴全部轉(zhuǎn)入96孔PCR反應(yīng)板中，進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件確定為：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s；60 ℃退火延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；固化微滴98 ℃，10 min。

ddPCR體系中羊、牛源性引物退火溫度優(yōu)化:羊、牛源性引物的ddPCR反應(yīng)程序的退火溫度優(yōu)化處理方式一致，設(shè)置退火溫度為58、59、60、61、62、63、64和65 ℃等8個(gè)梯度，最后通過比較分析ddPCR的拷貝數(shù)和微滴情況來分別確定羊和牛源性特異性引物ddPCR最佳退火溫度。每個(gè)樣品每個(gè)處理做2個(gè)平行。

ddPCR靈敏度驗(yàn)證:將提取的羊肉DNA 模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別稀釋至濃度為10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL，進(jìn)行ddPCR靈敏度的驗(yàn)證。ddPCR實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次2個(gè)平行。

ddPCR定量方法的建立:肉的質(zhì)量與樣品DNA溶液中的基因的拷貝數(shù)及單位質(zhì)量的基因拷貝數(shù)有關(guān)，如公式(1)所示：

Q=M×C

(1)

式中：M，肉的質(zhì)量；Q，基因拷貝數(shù)；C，單位質(zhì)量肉的基因拷貝數(shù))

不同肉種的質(zhì)量比按公式(2)計(jì)算：

(2)

由于進(jìn)行固定條件下干燥處理，同一肉種的細(xì)胞密度和基因組大小是固定的，因此，Cb/Ca為常數(shù)命名為k，只要測得基因拷貝數(shù)，即可獲得2組分比例[11]。

以羊肉作為研究對(duì)象，將羊肉與鴨肉、豬肉按表1配制成含有1%、4%、10%、30%、50%、60%和95%羊肉成分和10 mg內(nèi)標(biāo)牛肉的混合樣品(共110 mg干物質(zhì))，分別取5.5 mg干物質(zhì)提取DNA，進(jìn)行ddPCR檢測，分別測得羊源性成分和內(nèi)標(biāo)牛源性成分基因拷貝數(shù)，計(jì)算K值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)，構(gòu)建質(zhì)量與拷貝數(shù)的數(shù)學(xué)關(guān)系。每個(gè)樣品重復(fù)3次，每次2個(gè)平行，相關(guān)系數(shù)R2的計(jì)算用Excel自動(dòng)生成。

1.2.4 定量方法靈敏度驗(yàn)證

為驗(yàn)證ddPCR內(nèi)標(biāo)定量方法的靈敏度，將羊肉干物質(zhì)分別按0.5%、0.25%、0.01%與鴨肉、豬肉的干物質(zhì)混合后加10%內(nèi)標(biāo)物質(zhì)牛肉干物質(zhì)，進(jìn)行混合后提取DNA，并對(duì)羊源性成分及內(nèi)標(biāo)牛源性成分進(jìn)行雙重ddPCR檢測。具體混合比例見表2。

1.2.5 定量線性范圍和方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性驗(yàn)證

針對(duì)檢測體系，按照表3制備不同摻假含量和不同摻假種類的模擬混合樣品，提取 DNA后進(jìn)行ddPCR定量檢測，測得的羊與內(nèi)標(biāo)拷貝數(shù)帶入公式(1)計(jì)算，得出羊的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次2個(gè)平行。

表1 ddPCR定量方法的建立中各肉樣混合比例

注：“/”表示不含該成分(下同)

表2 ddPCR內(nèi)標(biāo)定量方法實(shí)際靈敏度驗(yàn)證的樣品混合比例

表3 模擬混合樣品的混合比例(內(nèi)標(biāo)法)

1.2.6 ddPCR檢測市售樣品羊源性成分的含量

為了驗(yàn)證所建立的ddPCR定量方法在實(shí)際羊肉樣品檢測中的可行性，以2018～2019年成都海關(guān)技術(shù)中心動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室保存的四川省內(nèi)隨機(jī)抽取的28個(gè)羊肉及其制品作為檢測對(duì)象，樣品主要來源于超市及農(nóng)貿(mào)市場，包括13個(gè)羊肉片(卷)、8個(gè)羊肉串、7個(gè)羊肉樣品。準(zhǔn)確稱取經(jīng)前處理干燥后的1 g待檢樣品，加入100 mg內(nèi)標(biāo)干物質(zhì)混合均勻后，取7 mg進(jìn)行DNA提取，采用現(xiàn)行定性檢測標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2051—2008食品、化妝品和飼料中牛羊源性成分檢測方法進(jìn)行定性檢測，檢測結(jié)果顯示為陽性的樣品再利用建立的ddPCR內(nèi)標(biāo)定量方法進(jìn)行定量檢測，進(jìn)一步驗(yàn)證所建方法的準(zhǔn)確性和應(yīng)用能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊、牛源性引物探針篩選設(shè)計(jì)

2.1.1 單拷貝基因的篩選

參考相關(guān)文獻(xiàn)，并查詢NCBI上基因的相關(guān)信息，確定以生長激素基因(GH)為目的基因，分別進(jìn)行羊、牛源性引物探針的設(shè)計(jì)，羊肉、牛肉的GH基因在染色體上的位置及數(shù)量分別如圖1所示。

2.1.2 不同物種GH基因序列比對(duì)

利用序列分析軟件DNA Man6.0 對(duì)山羊、綿羊、水牛、瘤牛、黃牛的生長激素基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，選取羊的特異性保守區(qū)域進(jìn)行引物探針的設(shè)計(jì)，各物種序列比對(duì)結(jié)果如圖2所示。

圖1 羊肉、牛肉的單拷貝GH基因

圖2 羊與其他物種GH基因序列比對(duì)

利用序列分析軟件DNA Man6.0 對(duì)水牛、瘤牛、黃牛、牦牛、山羊、綿羊的生長激素基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，選取牛的特異性保守區(qū)域進(jìn)行引物探針的設(shè)計(jì)，各物種序列比對(duì)結(jié)果如圖3所示。

圖3 牛肉與其他物種GH基因序列比對(duì)

2.1.3 引物探針的設(shè)計(jì)

利用軟件Oligo 6.0、DNAMan對(duì)牛的引物探針進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析，表4、表5分別是設(shè)計(jì)的羊源性引物探針和牛源性引物探針的基本信息。

表6和表7分別為設(shè)計(jì)的羊、牛源性GH基因引物探針的序列。合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果進(jìn)行Blast同源性數(shù)據(jù)庫比對(duì)后結(jié)果顯示同源性均在96%以上。

2.2 gPCR驗(yàn)證引物探針特異性

2.2.1 羊源性引物探針特異性驗(yàn)證

由圖4可以看出，在引物特異性實(shí)驗(yàn)中，只有綿羊和山羊的DNA檢測到了擴(kuò)增信號(hào)，平均Ct值分別為24.93和25.77，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，說明所設(shè)計(jì)引物的特異性良好，能同時(shí)對(duì)綿羊和山羊成分進(jìn)行檢測。

表4 羊源性引物探針基本信息

表5 牛源性引物探針基本信息

表6 羊GH基因引物探針序列

表7 牛肉的GH基因引物探針序列

圖4 羊源性引物探針qPCR特異性驗(yàn)證

2.2.2 牛源性引物探針特異性驗(yàn)證

由圖5可以看出，牛源性引物的特異性實(shí)驗(yàn)中，只有水牛、黃牛和牦牛的DNA檢測到了擴(kuò)增信號(hào)，平均Ct值分別為26.63、28.05和30.89，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，說明所設(shè)計(jì)的引物特異性良好且能同時(shí)對(duì)水牛、黃牛和牦牛成分進(jìn)行檢測。

圖5 牛源性引物探針qPCR特異性

2.3 ddPCR驗(yàn)證羊、牛源性引物探針特異性

羊肉和牛肉DNA的ddPCR擴(kuò)增結(jié)果分別如圖6、圖7所示，空白對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增，說明體系未污染，且每個(gè)樣品生成微滴數(shù)均大于12 000個(gè)，符合泊松分布計(jì)算需要。羊引物探針特異性良好，只擴(kuò)增出羊DNA，其他非目標(biāo)物種肉樣均沒有出現(xiàn)擴(kuò)增；牛源性引物探針特異性良好，只有牛DNA發(fā)生擴(kuò)增，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。表明該ddPCR鑒別體系特異性良好，2對(duì)引物均可用于后續(xù)ddPCR定性和定量檢測。

圖6 羊源性引物探針ddPCR特異性

圖7 牛源性引物探針ddPCR特異性

2.4 ddPCR反應(yīng)條件優(yōu)化

ddPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果為：20 μL反應(yīng)體系中引物體系終摩爾濃度0.9 μmol/L，探針體系終摩爾濃度0.25 μmol/L，ddPCRTMSupermix for Probes 10 μL，DNA模板2 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序最佳退火溫度為60 ℃。

2.5 ddPCR靈敏度驗(yàn)證

由圖8可看出，當(dāng)DNA質(zhì)量濃度為0.01 ng/μL時(shí)，檢測為0.05 copies/μL，質(zhì)量濃度為0.001 ng/μL時(shí)，未出現(xiàn)擴(kuò)增，因此ddPCR檢測羊DNA的靈敏度為0.01 ng/μL，靈敏度滿足定量檢測需要。

圖8 ddPCR檢測羊肉的靈敏度

2.6 ddPCR定量方法的建立

羊源性成分的檢測結(jié)果如圖9所示，羊肉樣品含量在1%～95%，羊肉的拷貝數(shù)隨羊肉含量的增大而增加；內(nèi)標(biāo)牛肉的拷貝數(shù)檢測結(jié)果如圖10所示，隨羊肉含量的增大，牛肉的拷貝數(shù)幾乎無差異。

圖9 ddPCR內(nèi)標(biāo)法檢測1%～95%的羊肉拷貝數(shù)

圖10 ddPCR檢測10%內(nèi)標(biāo)牛肉的拷貝數(shù)

得到羊肉靶基因拷貝數(shù)與內(nèi)標(biāo)物種牛靶基因拷貝數(shù)后計(jì)算2個(gè)拷貝數(shù)比值，以該比值與對(duì)應(yīng)的羊肉實(shí)際質(zhì)量作為橫、縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖11所示。羊肉的含量與羊肉與內(nèi)標(biāo)牛肉的基因拷貝數(shù)之比呈線性響應(yīng)，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 3，計(jì)算如公式(3)所示：

y= 0.042 5x+0.015 2

(3)

式中：y表示羊肉的質(zhì)量，x表示羊與內(nèi)標(biāo)牛肉的基因拷貝數(shù)之比，通過該公式可將羊肉的基因拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化為質(zhì)量，該回歸方程即可作為羊肉質(zhì)量的計(jì)算方程。

圖11 羊肉與內(nèi)標(biāo)的拷貝數(shù)比值和羊肉含量的函數(shù)關(guān)系

2.7 ddPCR內(nèi)標(biāo)法檢測羊肉的實(shí)際靈敏度

由圖12可看出，空白對(duì)照未出現(xiàn)擴(kuò)增，說明體系未污染，且每個(gè)樣品生成的微滴數(shù)均大于15 000個(gè)，滿足泊松分布統(tǒng)計(jì)需要。當(dāng)羊肉含量為0.01%時(shí)，檢測結(jié)果為0.12 copies/μL。結(jié)果表明，該方法具有良好的靈敏度，可以檢測出含有0.01%羊肉的樣品。

圖12 ddPCR內(nèi)標(biāo)法檢測羊肉的實(shí)際靈敏度驗(yàn)證

2.8 定量線性范圍和方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性驗(yàn)證

測得的羊肉拷貝數(shù)和牛肉拷貝數(shù)分別如圖13、圖14所示。

圖13 ddPCR定量方法的準(zhǔn)確性及重復(fù)性驗(yàn)證

圖14 ddPCR檢測10%內(nèi)標(biāo)牛肉的拷貝數(shù)

羊肉與牛肉的拷貝數(shù)之比見表8。由表8可看出5個(gè)處理的樣品6次測量值均有很好的重復(fù)性，RSD均小于8.7%。當(dāng)羊肉含量為1%時(shí)，定量的相對(duì)誤差較大，為155.8%；當(dāng)羊肉含量大于5%時(shí)，測定值與實(shí)際值相對(duì)誤差較小，均在6.6%以內(nèi)。說明該方法在羊肉含量5%以上時(shí)，具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

表8 ddPCR定量檢測方法檢測混合肉中羊肉含量的最低檢測限、重復(fù)性及準(zhǔn)確性

2.9 ddPCR檢測市售樣品羊源性成分含量的結(jié)果

利用建立的ddPCR絕對(duì)定量方法對(duì)樣品中的羊源性成分進(jìn)行定量檢測，結(jié)果表9所示。由表9可知，農(nóng)貿(mào)市場出售的2個(gè)羊肉片(卷)和1個(gè)羊肉串檢測出了非羊源性成分。2個(gè)被檢出非羊源性成分的羊肉片(卷)樣品中羊肉所占比例均<95%，說明樣品被其他動(dòng)物成分污染，這可能是加工環(huán)節(jié)或者樣品流通中出現(xiàn)的無意沾染，而非故意添加。1個(gè)被檢出非羊源性成分的羊肉串樣品中羊肉所占比例僅為65.1%，可確定為摻假，這表明了現(xiàn)有的市售樣品存在一定的摻假情況。

3 討論

近年來，以核酸為標(biāo)志物的動(dòng)物種類鑒別檢測方法獲得了快速發(fā)展，尤其dd PCR技術(shù)的出現(xiàn)為qPCR檢測核酸提供了一種獨(dú)特的方法，尤其適用于低水平檢測。該方法不需要依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因，可直接得出DNA拷貝數(shù)，是對(duì)樣品的絕對(duì)定量[12]。MORISSET等[13]研究了ddPCR在食品和飼料樣品常規(guī)分析中的適用性，認(rèn)為ddPCR檢測在低靶濃度下顯示出更好的重復(fù)性，它的定性和定量檢測限比傳統(tǒng)定量PCR低，能分別達(dá)到5個(gè)和6個(gè)拷貝數(shù)，而不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，ddPCR在準(zhǔn)確性、特異性和重復(fù)性較之于傳統(tǒng)定量PCR存在更大的優(yōu)勢，在肉源成分檢測方面已經(jīng)取得一定的成績。由于ddPCR對(duì)待檢肉樣的精確定量是利用DNA濃度作為中間變量，從而確定肉樣質(zhì)量和微滴拷貝數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如SHEHATA等[14]采用ddPCR方法，對(duì)食品和飼料樣品中牛、豬、雞和火雞的DNA進(jìn)行定量檢測，是先將基因拷貝數(shù)轉(zhuǎn)換為DNA質(zhì)量，再從DNA質(zhì)量換算為肉的質(zhì)量。苗麗等[5]和陳晨等[15]采用ddPCR方法對(duì)肉制品中羊肉和豬肉定量分析，也是以DNA濃度作為中間換算值，得到肉質(zhì)量和DNA 拷貝數(shù)之間的換算關(guān)系。但BALLIN等[16]在研究肉類產(chǎn)品的物種標(biāo)簽時(shí)認(rèn)為，相同質(zhì)量的不同肉種其DNA基因拷貝數(shù)不相同，如果直接將基因拷貝數(shù)之比作為肉質(zhì)量之比，結(jié)果會(huì)出現(xiàn)較大差異。因此，本研究選擇直接利用2種肉基因拷貝數(shù)之比的固定值，一步實(shí)現(xiàn)了基因拷貝數(shù)之比與肉質(zhì)量之比的轉(zhuǎn)化，而實(shí)現(xiàn)對(duì)羊源性成分的精確定量。

表9 ddPCR對(duì)市售樣品的檢測結(jié)果

此外，線粒體基因作為靶基因在物種的定性檢測中得到了廣泛應(yīng)用，但線粒體基因在同一物種的不同組織中含量差異巨大，這給定量檢測帶來困難。FLOREN等[17]認(rèn)為以線粒體DNA(mtDNA)為靶點(diǎn)進(jìn)行物種量化具有局限性，因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞的mtDNA含量有5倍的組織間變異，容易導(dǎo)致物種DNA含量被低估或高估。而單拷貝基因與線粒體基因相比，具有拷貝數(shù)少且數(shù)量相對(duì)恒定等特點(diǎn)，不會(huì)因?yàn)闃悠凡课坏牟煌瑢?dǎo)致定量結(jié)果的偏差，適合于對(duì)肉類產(chǎn)品進(jìn)行定量檢測。KOPPEL等[18]利用單拷貝基因設(shè)計(jì)特異性引物，定量分析了食品中牛、豬等動(dòng)物源性成份，取得了滿意效果。因此，本研究選擇單拷貝持家基因作為靶基因，利用ddPCR技術(shù)對(duì)肉中羊源性成分進(jìn)行精確定量。

由于目前市場上肉制品種類繁多，僅從感官上無法識(shí)別肉制品的真實(shí)性，更無法識(shí)別肉制品是人為故意摻假還是無意污染。為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)建立ddPCR法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，將ddPCR法與SN/T 2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊源性成分檢測方法》對(duì)比進(jìn)行市售樣品的檢測，結(jié)果表明ddPCR能夠?qū)悠分醒蛟葱猿煞值暮勘壤M(jìn)行了準(zhǔn)確定量，這有利于食品檢測部門對(duì)樣品中肉源性成分的真?zhèn)巫龀雠卸ā?/p>

4 結(jié)論

本研究建立了基于DNA拷貝數(shù)與樣品質(zhì)量間線性關(guān)系，對(duì)羊源性成分進(jìn)行ddPCR內(nèi)標(biāo)定量的方法，實(shí)現(xiàn)了從靶基因拷貝數(shù)到樣品質(zhì)量間的一步轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)證明該方法在檢測出0.01%的羊肉源性成分時(shí)，檢測結(jié)果達(dá)0.12 copies/μL；對(duì)于含量5%以上的羊肉源性成分，具有很好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。總的來看，本方法在肉及肉制品中羊肉源性成分檢測和摻假鑒別方面具有較大的應(yīng)用潛力。