用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測定釓特酸葡胺注射液中游離Gd3+的含量

王騏榕，陳潔儀，孫 渺，陳玉平，楊 峰 （海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院無機(jī)化學(xué)教研室，上海 200433）

釓特酸葡胺注射液是一種臨床上常用的含釓增強(qiáng)磁共振對比劑。釓對比劑按照釓離子結(jié)合配體的結(jié)構(gòu)不同，可將其分為線性類和大環(huán)類兩類，釓特酸葡胺注射液中釓屬于大環(huán)類釓對比劑。釓對比劑具有很強(qiáng)的親水性，理論上不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且無特殊靶器官。通過靜注后短時間內(nèi)分布到全身血液系統(tǒng)，并很快達(dá)到平衡期，可在1 d 內(nèi)以原型的形式全部排出體外，理論上在人體內(nèi)無殘留。近年來研究表明，反復(fù)使用釓對比劑的患者，其腦部會出現(xiàn)不同程度的釓對比劑沉積現(xiàn)象，并且其腦深部核團(tuán)的MRI 掃描信號也會隨之發(fā)生改變[1-3]。同時，使用不同類型的釓對比劑所造成的釓對比劑腦沉積的程度也有所不同[4-5]。曾經(jīng)反復(fù)使用過線狀釓對比劑的患者，可在其頭顱MR 掃描中觀察到明顯的信號改變。而曾經(jīng)多次使用過大環(huán)狀釓對比劑的患者，在腦中卻未觀察到明顯的釓對比劑沉積現(xiàn)象[6]。在此基礎(chǔ)上，美國食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布通告，要求醫(yī)療人員重新評估使用釓對比劑的條件[7]。同時，歐洲藥品管理局也停止了對幾種線性釓對比劑的市場授權(quán)[8]。2017 年，我國食品藥品監(jiān)督管理局也發(fā)布通告提示關(guān)注含釓對比劑反復(fù)使用引起腦部釓沉積的風(fēng)險[9-10]。研究表明，釓對比劑中游離Gd3+的含量與釓對比劑的腦沉積現(xiàn)象密切相關(guān)[4-5]，但目前無論在體內(nèi)或者體外環(huán)境中定量測定釓對比劑中游離Gd3+含量的方法尚不成熟。因此，筆者通過反復(fù)試驗并查閱相關(guān)資料，建立了一種新的體外環(huán)境測定釓對比劑中游離Gd3+含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

AKTA 蛋白純化儀、自動進(jìn)樣器（美國GE 公司）；ICP-MS 8800（Agilent technologies）；分離柱（1-ml Chelating Sepharose column GE）。

1.2 藥品與試劑

釓特酸葡胺注射液0.5 mol/L，含釓特酸葡胺377 g/L。（批號：170923BC、170924BC、170925BC，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；Gd 標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液（標(biāo)準(zhǔn)值1 000 mg/L，批號：GSB 04-1780-2004，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；六水合硝酸釓（濃度99.99%）；去離子水(18.2 MΩ，自制）；內(nèi)標(biāo)溶液：20 mg/L 的6Li、45Sc、89Y、115In、209Bi 混合溶液（2%硝酸介質(zhì)，Accu Standard，USA）。其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

2.1.1 分離條件

分離柱為金屬螯合柱（1-ml Chelating Sepharose column），常溫下，A 液為10 mmol/L 的雙（2-羥乙基）氨基（三羥甲基）甲烷（BIS-TRIS）溶液，B 液為50 mmol/L 的EDTA 溶液。流速為1 ml/min，平衡系統(tǒng)后，進(jìn)樣500 μl，先用100%的A 液沖洗10 min（10 倍柱體積），再用100%的B 液沖洗20 min（20 倍柱體積），得到分離后的樣品。

2.1.2 ICP-MS 條件

載氣為氬氣，射頻功率1 350 W，冷卻氣流量：13 L/min；輔助氣流量：0.80 L/min；霧化器氬氣流量：0.88 L/min。采用內(nèi)標(biāo)法做定量分析，將“2.1.1”項分離得到的樣品稀釋10 倍后，用過蠕動泵進(jìn)樣，樣品提升速度為0.2 r/min，時間45 s，樣品平衡速度0.1 r/min，時間35 s。ICP-MS 的相對分子質(zhì)量為157。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)釓對照品溶液

精密量取標(biāo)準(zhǔn)釓對照品1 ml，置50 ml 容量瓶中，加0.5%的稀硝酸稀釋至刻度，搖勻即得20 mg/L標(biāo)準(zhǔn)對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液

精密量取釓特酸葡胺注射液1 ml，置于50 ml量瓶中，加去離子水稀釋至刻度，搖勻，即得10 mmol/L樣品儲備液。

2.2.3 pH 中性對照品溶液

取六水合硝酸釓（99.99%）0.45 g，精密稱量，置于1 000 ml 容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度，搖勻得到1 mmol/L 的中性對照品儲備液。

2.2.4 混合對照溶液

精密吸取“2.2.3”項下對照品儲備液1.0 ml，置于10 ml 量瓶中，再精密吸取“2.2.2”供試品儲備液1 ml，用去離子水稀釋至刻度，搖勻。得到1 mmol/L供試品（Gd 配合物）+0.1 mmol/L 中性對照品混合溶液（Gd3+）。

2.3 方法專屬性考察

精密吸取“2.2.3”中性對照品儲備液1.0 ml，置于10 ml 量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，得到0.1 mmol/L 的中性對照品溶液（Gd3+）。精密吸取1 ml 上述稀釋后的中性對照品儲備液得到樣本1。精密吸取“2.2.2”供試品儲備液1.0 ml，置于10 ml量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，得到1 mmol/L 的供試品溶液（Gd 配合物）。精密吸取1 ml 上述稀釋后的供試品儲備液得到樣本2。取“2.2.4”項下溶液1 ml，作為樣本3。將樣本1、2、3 分別稀釋10 倍后，照“2.1.1”項下分離條件分離供試品，并間隔2 min 收取1 管分離后的供試品。得到3 批、共45 管分離后的供試品。將分離后的供試品按照“2.1.2”項下ICP-MS 條件測量其濃度變化，結(jié)果見圖1?；旌蠈φ掌焚|(zhì)譜中，有兩個保留時間的質(zhì)譜峰，分別對應(yīng)對照品質(zhì)譜和供試品質(zhì)譜相應(yīng)的位置上的質(zhì)譜峰，而兩個質(zhì)譜峰之間無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項下標(biāo)準(zhǔn)對照品儲備液0.5、1.25、2.5 ml，加入到100 ml 容量瓶中。用0.5%的稀硝酸稀釋至刻度線，搖勻。得到理論濃度為100、250、500 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液。再分別取濃度為500 和250 μg/L 的溶液5 ml 置于50 ml 容量瓶中，用0.5%的稀硝酸稀釋至刻度線，搖勻。得到理論濃度為25、50、100、250、500 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，按上述ICP-MS 條件進(jìn)樣測定，以對照品濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/L），對照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程：Y=0.001 635X+0.000 000E+000（經(jīng)過原點），r=1.000。結(jié)果表明Gd 元素濃度在0～500 μg/L 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下標(biāo)準(zhǔn)對照品儲備液0.2 ml，用0.5%硝酸稀釋至40 ml，搖勻。按上述ICP-MS條件進(jìn)樣測定，連續(xù)操作5 次，測得釓濃度。結(jié)果表明，觀察峰面積的RSD ＜10%（n=5），表明儀器精密度良好。結(jié)果見表1。

圖 1 方法專屬性考察曲線

表 1 釓特酸葡胺注射液精密度試驗結(jié)果

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.4”項下同一供試品溶液適量,稀釋10 倍后，按“2.1.1”項下條件進(jìn)行分離，分別取分離后前10 min 和后20 min 的溶液，編號為a 液和b 液。分別精密量取a 液、b 液各5 份，于室溫下放置0、2、4、6、12 h，按“2.1.2”項下的條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，a 液的RSD 為1.826%（n=5），RSD＜2%表明分離后的釓配合物12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。b 液的RSD 為1.911%（n=5），表明分離后的釓與EDTA 螯合物在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好（表2）。

表 2 釓特酸葡胺注射液穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=5)

2.7 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（批號：170923BC），精密量取適量，按照“2.2.4”項下方法配成混合溶液適量,稀釋10 倍后，按“2.1.1”項下條件進(jìn)行分離，分別取分離后前10 min 和后20 min 的溶液，編號為a 液和b 液。分別按“1.1.2”項下條件進(jìn)樣測定。計算混合溶液中Gd3+的實際含量。同法操作重復(fù)5 次。結(jié)果表明，混合溶液中Gd3+的實測含量RSD 為1.998%（n=5），RSD＜2%（n=5）表明本方法重復(fù)性良好，結(jié)果見表3。

表 3 釓特酸葡胺注射液重復(fù)性試驗結(jié)果(n=5，mmol/L)

2.8 檢測限測定

用空白對照溶液（去離子水），按“2.1.2”項下ICP-MS 條件進(jìn)樣測定，連續(xù)操作8 次，分別測得釓濃度。計算其平均濃度，檢測限=測得空白對照的平均濃度×3，測得結(jié)果為0.223 μg/L。

2.9 定量限測定

用空白對照溶液（0.5%的硝酸），按“2.1.2”項下ICP-MS 條件進(jìn)樣測定，連續(xù)操作8 次，分別測得釓濃度。計算其平均濃度，定量限=測得空白對照的平均濃度×10，測得結(jié)果為：0.7443 μg/L。

2.10 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的釓特酸葡胺注射液（批號：170923BC）4 份，按照“2.2.2”方法配得10 mmol/L的樣品溶液，精密量取1 ml 樣品溶液置10 ml 容量瓶中，用0.5%的硝酸定容，搖勻，得到1 mmol/L 的樣品溶液。精密量取1 ml 稀釋后的樣品，用0.5%的硝酸再稀釋到30 ml。得到5.23 mg/L 的樣品溶液，稱其為①液。精密量取1 ml 對照品溶液（1 g/L）置50 ml 容量瓶中，用0.5%的硝酸定容，搖勻。同樣精密量取5 ml 稀釋后的對照品溶液，用0.5%的硝酸稀釋至20 ml，得到5 mg/L 的對照品溶液，稱為②液。精密量取2 ml①液置50 ml 容量瓶中，用0.5%的硝酸定容，搖勻，得到樣品液A。分別精密量取1 ml①液和1 ml②液置50 ml 容量瓶中，用0.5%的硝酸定容，搖勻，得到樣品液B。得到的兩份溶液分別按“2.1.2”項下條件，進(jìn)樣測定并計算加樣回收率，反復(fù)4 次上述步驟。加樣回收率=（加樣試樣測定值-加樣測定值）/加樣量×100%。計算平均加樣回收率，結(jié)果見表4。

表 4 加樣回收率試驗結(jié)果(n=4)

2.11 含量測定

取3 批精密量取已知含量的釓特酸葡胺注射液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件測定，通過回歸方程計算，結(jié)果見表5。

表 5 釓特酸葡胺注射液Gd3+含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

文獻(xiàn)[11]報道，采用HPLC-ICP-MS 聯(lián)用，以硝酸作為洗脫液的方法測定釓特酸葡胺注射液中Gd3+的含量。經(jīng)查閱相關(guān)資料，其選用的金屬螯合柱實際為低壓柱，無法承受高效液相的壓力，并且硝酸的洗脫效率較EDTA 要低得多，還具有腐蝕性，對于ICP-MS 儀器有一定的損害，因此，該文獻(xiàn)所報道方法無法驗證。根據(jù)配位化學(xué)原理，EDTA對Gd3+有很強(qiáng)的螯合性，能快速形成穩(wěn)定配合物，故筆者選用EDTA 作為洗脫流動相，結(jié)果表明，此法可迅速將螯合柱上的Gd3+完全洗脫。因為自然界中Gd 元素含量稀少，所以本實驗運用ICP-MS時受外界干擾小，實驗結(jié)果可靠。

本實驗建立的測定釓特酸葡胺注射液中Gd3+含量的方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。研究表明不同批次釓特酸葡胺注射液樣品中Gd3+含量變化較小，質(zhì)量穩(wěn)定可控。綜上所述，此方法可作為測定釓特酸葡胺注射液中Gd3+含量的方法。