新型腺病毒載體肺結(jié)核疫苗的免疫原性研究①

史曉雨 隋秀文 苗 偉 高德進(jìn) 王 暢 魏夢(mèng)函 朱 濤

(天津科技大學(xué)，天津 300457)

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是全球領(lǐng)先的傳染性疾病殺手，新的結(jié)核病疫苗對(duì)于預(yù)這一流行病至關(guān)重要[1]。自從1921年引入目前唯一獲得許可的卡介苗(Bacillus calmette guerin，BCG)以來，很少有新的候選疫苗或策略進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，并且BCG只有效保護(hù)兒童，對(duì)成人肺結(jié)核沒有保護(hù)力[2]。Ag85A抗原是結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)表面抗原中免疫原性最強(qiáng)的蛋白之一,主要誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答[3]。單獨(dú)接種Ag85A疫苗能夠有效激發(fā)機(jī)體特異性免疫應(yīng)答，從而抑制MTB侵染能力[4]。但是，MVA-85A新型肺結(jié)核疫苗在臨床Ⅱb期的失敗[5]說明，單獨(dú)Ag85A抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，并不足以成功預(yù)防肺結(jié)核。相關(guān)文獻(xiàn)指出，將MTB早期分泌靶點(diǎn)抗原ESAT6、桿菌潛伏期抗原rv3407、桿菌復(fù)蘇相關(guān)抗原RpfB三個(gè)基因融合，Ad5作為病毒載體來表達(dá)3Ag融合蛋白，在小鼠模型中顯示了很好的免疫原性[6]。本實(shí)驗(yàn)開發(fā)了一種以Ad5為載體的新型雙價(jià)肺結(jié)核疫苗，涵蓋了Ag85A、ESAT6、rv3407以及RpfB四種不同抗原，擴(kuò)大了抗原的保護(hù)范圍，為肺結(jié)核各個(gè)階段提供較為全面的保護(hù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，普通級(jí)別BALB/c雌性小鼠，4～6周齡。

1.1.2免疫材料及試劑 Ad5-TPA-3Ag與Ad5-Ag85A毒種均由康希諾生物股份公司純化保存；ELISpot試劑盒購自瑞典Mabtech公司；細(xì)胞因子染色試劑盒購自德國美天旎生物技術(shù)有限公司；ELISA檢測用辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP*)的山羊抗小鼠抗體購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；ELISA平板與1640培養(yǎng)基購自美國康寧公司。

1.2方法

1.2.1單價(jià)和雙價(jià)疫苗制備 Ad5-Ag85A單價(jià)疫苗以5×107IF U/ml劑量免疫，雙價(jià)疫苗Ad5-Ag85A與Ad5-TPA-3Ag分別以1∶0.2、1∶1、1∶2、1∶4 劑量進(jìn)行配制，同時(shí)設(shè)置生理鹽水組作為陰性對(duì)照，充分混勻，備用。

1.2.2試驗(yàn)分組及免疫流程 BALB/c雌性鼠隨機(jī)分配為六組，42只/組，共252只。第一組接種Ad-Ag85A單價(jià)疫苗，第二至第五組分別接種劑量比例為1∶0.2、1∶1、1∶2、1∶4的雙價(jià)疫苗。共進(jìn)行3次免疫，免疫間隔14 d，注射途徑為后腿肌肉注射，100 μl/只。分別于每次免疫后28 d對(duì)小鼠眼球采全血及斷頸處死，檢測抗體效價(jià)和細(xì)胞因子水平。

1.2.3小鼠血清IgG抗體檢測 原核表達(dá)的Ag85A和TPA-3Ag抗原包被濃度分別為1 μg/ml和0.25 μg/ml，4℃過夜。洗滌液(PBST)洗3次，使用1%BSA在37℃條件下封閉1 h。供試品血清進(jìn)行倍比稀釋，37℃孵育1 h。Ag85A板中的酶標(biāo)抗體進(jìn)行1∶8 000稀釋，TPA-3Ag板中的酶標(biāo)抗體進(jìn)行1∶15 000稀釋，37℃孵育1 h。TMB避光顯色10 min，使用2 mol/L硫酸終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀450 nm處測定吸光度值，陰性血清OD450平均值與2.1乘積為Cutoff值，樣品血清OD450大于Cutoff值為陽性，對(duì)應(yīng)最大稀釋倍數(shù)作為抗體效價(jià)。

1.2.4小鼠脾細(xì)胞分離及體外刺激 小鼠斷頸處死，取出脾臟，浸入3 ml RPMI1640培養(yǎng)基于培養(yǎng)皿中，剪碎研磨出脾細(xì)胞，400 g，4℃離心5 min。去上清，每脾加3 ml ACK裂解液常溫裂解5 min，加入12 ml PBS終止裂解，400 g，4℃離心5 min。去上清后重懸于4.2 ml RPMI完全培養(yǎng)基中，分至96孔U板中，每孔2×106個(gè)細(xì)胞，100 μl/孔。分別加入用RPMI培養(yǎng)基稀釋的Ag85A和TPA-3Ag肽庫，終濃度2 μg/ml，終體積200 μl。充分混勻后置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后加入1∶1 500倍稀釋的高爾基體阻斷劑(GolgiStop)，每孔30 μl，繼續(xù)刺激4 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞染色。

1.2.5細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ICS) 經(jīng)6 h刺激的脾細(xì)胞400 g，4℃離心5 min，棄上清，重懸于MACS緩沖液，100 μl/孔，并轉(zhuǎn)移至96 V孔板，400 g，4℃離心5 min。準(zhǔn)備MACS Buffer稀釋好的CD3-FITC，CD4-PerCP熒光抗體，每孔50 μl，4℃避光孵育20 min。孵育結(jié)束后每孔加入150 μl PBS溶液，離心棄上清重懸于MACS緩沖液，充分吹打混勻，立刻加入Cytofix/Cytoperm TM Fixation and Permeabilizaiton Solution，150 μl/孔，反復(fù)吹打混勻，4℃過夜后離心去上清，每孔加入100 μl 1×Perm/wash Buffer，孵育5 min，400 g，4℃離心5 min。準(zhǔn)備1×Perm/wash Buffer稀釋好的IFNγ-PE和IL2-APC熒光抗體，每孔加入50 μl，4℃孵育30 min。結(jié)束后加入150 μl PBS溶液，離心去上清，重懸細(xì)胞于200 μl/孔MACS Buffer，混勻，4℃儲(chǔ)存。分析時(shí)，轉(zhuǎn)移至流式細(xì)胞儀分析用管，并加PBS至終體積500 μl上樣。

1.2.6ELISpot檢測IFN-γ 按照試劑盒說明書將ELISpot平板用70%乙醇活化2 min，加入濃度為5 μg/ml 抗小鼠IFN-γ抗體，4℃過夜包被，RPMI1640完全培養(yǎng)基室溫封閉2 h。按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種平板，每孔50 μl，Ag85A和TPA-3Ag肽庫按照終濃度2 μg/ml分別與脾細(xì)胞1∶1 混合，同時(shí)設(shè)置PMA刺激孔作為陽性對(duì)照，無細(xì)胞刺激孔為陰性對(duì)照，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。次日用PBS洗板5次拍干，加入以1∶1 000 PBS稀釋的R4-6A2-biotin抗體，每孔50 μl，室溫孵育2 h。孵育結(jié)束后棄去液體，PBS溶液洗5次，加入50 μl用PBS按1∶1 000倍稀釋好的Streptavidin-ALP，室溫孵育1 h。之后棄去液體，PBS洗5次，每孔加入100 μl BCIP/NBT，用0.45 μm濾膜過濾，直到出現(xiàn)明顯的斑點(diǎn)，隨后用大量純化水溫柔清洗以終止反應(yīng)。晾干平板后讀數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad InStat軟件，對(duì)抗原特異性IgG的滴度ELISA檢測，抗原特異性免疫應(yīng)答細(xì)胞的ELISpot和ICS檢測的結(jié)果進(jìn)行分析，組間比較分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1體液免疫應(yīng)答評(píng)價(jià) 使用ELISA法檢測小鼠血清中Ag85A特異性和TPA-3Ag特異性IgG抗體滴度，結(jié)果如圖1所示。對(duì)于Ag85A特異性抗體反應(yīng)結(jié)果，單價(jià)和雙價(jià)疫苗均引起體液免疫應(yīng)答；兩次免疫抗體水平最佳；單價(jià)Ag85A優(yōu)于各雙組分疫苗，雙價(jià)疫苗間無明顯差異。對(duì)于TPA-3Ag特異性抗體滴度結(jié)果，雙價(jià)疫苗各組均產(chǎn)生很強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答；第三次免疫抗體水平最高，效果最好；除雙價(jià)1∶0.2劑量組一免IgG抗體滴度顯著低于其他組外(P<0.05)，各雙組分疫苗之間無差異。

2.2ICS結(jié)果 首先，劃分出淋巴細(xì)胞中的CD4+細(xì)胞，再分析此細(xì)胞群落的IFNγ+、IFNγ+IL2+、IFNγ-IL2+細(xì)胞，結(jié)果如圖2所示。

圖3展示了Ag85A特異性細(xì)胞免疫檢測。一免(A)、二免(B)和三免(C)后ICS檢測Ag85A特異性CD4+T細(xì)胞的數(shù)量。圖中可以看出，單價(jià)和雙價(jià)疫苗均引起Ag85A特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答；一免時(shí)，1∶1劑量組比1∶2和1∶4組CD4+T細(xì)胞數(shù)量多，其他組無顯著差異；第二次產(chǎn)生針對(duì)Ag85A特異性CD4+T細(xì)胞的數(shù)量最多，雙價(jià)1∶1劑量組較1∶0.2組有明顯差異，1∶4組有差異；三免中1∶1劑量組誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞比1∶0.2和1∶2組多，有差異。

圖4反映了TPA-3Ag特異性細(xì)胞免疫檢測。一免(A)、二免(B)和三免(C)后ICS檢測TPA-3Ag特異性CD4+T細(xì)胞數(shù)量。一、二、三免中，各雙價(jià)疫苗組均引起明顯的細(xì)胞免疫應(yīng)答；兩針免疫表現(xiàn)效果最優(yōu)，以1∶0.2劑量組最低，有差異(P<0.05)，其他雙價(jià)組無明顯差異；三免中1∶4配比組產(chǎn)生的TPA-3Ag特異性CD4+T細(xì)胞數(shù)量最多，其他劑量組無差異。

圖1 Ag85A特異性和TPA-3Ag特異性IgG抗體滴度Fig.1 Titration of Ag85A-specific and TPA-3Ag-specific IgG antibodiesNote: *.P

圖2 流式細(xì)胞儀劃分細(xì)胞步驟Fig.2 Gating strategy of flow cytometry

圖3 Ag85A特異性細(xì)胞免疫檢測Fig.3 Ag85A specific cellular immunoassayNote: *.P P

2.3ELISpot結(jié)果 Ag85A特異性IFN-γ應(yīng)答細(xì)胞的數(shù)量如圖5所示。A、B分別表示二免和三免產(chǎn)生IFN-γ應(yīng)答的細(xì)胞情況。單價(jià)和雙價(jià)疫苗組均產(chǎn)生IFN-γ，且三免強(qiáng)度最大；二免時(shí)，各比例組無明顯差異；三免中，以雙價(jià)1∶1配比組產(chǎn)生IFN-γ應(yīng)答細(xì)胞最多(P<0.05)。

對(duì)于TPA-3Ag特異性IFN-γ應(yīng)答細(xì)胞數(shù)量情況，如圖6所示。各雙價(jià)配比組均有相應(yīng)IFN-γ應(yīng)答細(xì)胞產(chǎn)生，且三針免疫誘導(dǎo)的響應(yīng)細(xì)胞普遍比二免多；二免時(shí)，各組無顯著性差異(圖6A)；三免中(圖6B)，雙價(jià)1∶1組明顯優(yōu)于其他劑量組(P<0.05)。

圖4 TPA-3Ag特異性細(xì)胞免疫檢測Fig.4 TB3-Ag specific cellular immunoassayNote:*.P

圖5 Ag85A特異性細(xì)胞免疫檢測Fig.5 Ag85A specific cellular immunoassayNote:*.P

圖6 TPA-3Ag特異性細(xì)胞免疫檢測Fig.6 TB3Ag specific cellular immunoassayNote:*.P

3 討論

MTB是結(jié)核病的病原體，是導(dǎo)致死亡的主要原因[7]。2017年，大約有1 000萬人患上結(jié)核病，其中有160萬人死于這種疾病，23%的世界人口有潛在結(jié)核病感染的風(fēng)險(xiǎn)，因此開發(fā)一款有效對(duì)抗結(jié)核病的疫苗刻不容緩[8]。復(fù)制缺陷型腺病毒載體安全性高，具有無佐劑參與便能引起針對(duì)病原體更為快速、有效保護(hù)效果的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于預(yù)防病毒類病原體具有強(qiáng)大的潛力，成為疫苗領(lǐng)域常用的病毒載體[9]。由于腺病毒與結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)作用的靶器官均為肺，因此有文獻(xiàn)報(bào)道使用腺病毒作為載體開發(fā)對(duì)抗結(jié)核病的新型疫苗[10]。本研究在Ag85A抗原基礎(chǔ)上，引入MTB另外三種抗原(ESAT6、rv3407、RpfB)，通過增加結(jié)核分枝桿菌不同時(shí)期的抗原，對(duì)結(jié)核病的發(fā)作進(jìn)行全面預(yù)防。實(shí)驗(yàn)通過兩種腺病毒疫苗的不同比例，進(jìn)一步評(píng)價(jià)其免疫原性。

體液免疫應(yīng)答結(jié)果表明，對(duì)于Ad5-Ag85A，單價(jià)Ad5-Ag85A疫苗在三次免疫下均產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，且高于各組雙價(jià)疫苗。Ad5-TPA-3Ag的加入，并沒有增強(qiáng)針對(duì)Ag85A的抗體應(yīng)答，反而會(huì)有抑制；針對(duì)TPA-3Ag，雙價(jià)疫苗各組均產(chǎn)生很強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答；三免效果最好，且各組無明顯差異。

ICS結(jié)果表明，對(duì)于Ag85A特異性細(xì)胞免疫檢測，三次免疫下，各雙價(jià)疫苗均產(chǎn)生了特異性CD4+T細(xì)胞，且1∶1劑量組表現(xiàn)出更好的優(yōu)勢。對(duì)于免疫針次，兩次免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性CD4+T細(xì)胞普遍偏高。

ELISpot結(jié)果顯示，無論從Ag85A還是TPA-3Ag角度分析，兩免產(chǎn)生的對(duì)應(yīng)IFN-γ應(yīng)答細(xì)胞數(shù)量比三免低，三免中以1∶1 配比最佳，其他組無差異。

大量研究表明，結(jié)核病的預(yù)防以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫保護(hù)為主，即消滅細(xì)胞內(nèi)病原體的免疫保護(hù)力。因此，檢測抗原特異性Th1類免疫應(yīng)答，即檢測分泌IFN-γ細(xì)胞因子的CD4 T細(xì)胞，是評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫保護(hù)作用的重要指標(biāo)[11]。針對(duì)三免后細(xì)胞免疫應(yīng)答普遍下降情況，可能與腺病毒預(yù)存免疫有關(guān)。人體內(nèi)存在較高針對(duì)5型腺病毒的抗體水平，多次免疫可降低病毒載體的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，從而降低免疫原性[12]。

綜上所述，雙價(jià)疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，有望成為新型肺結(jié)核疫苗。