解毒祛瘀滋陰方對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠的作用及Wnt/β-catenin信號通路的影響

關(guān)彥紅 張秀霞

(冀中能源井陘礦業(yè)集團總醫(yī)院，石家莊 050100)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣且好發(fā)于女性的自身免疫性疾病[1,2]，可以導(dǎo)致全身多個器官發(fā)生嚴重的并發(fā)癥，比如皮膚紅斑、口腔黏膜炎癥、關(guān)節(jié)炎、心包炎、腎病或腎炎綜合征、脾淋巴結(jié)腫大、呼吸系統(tǒng)受累等，其中腎臟損傷是系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者死亡的主要原因之一。關(guān)于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的病因及發(fā)病機制尚不明確，目前的研究認為其與免疫功能異常有關(guān)，治療主要以糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑為主，臨床療效顯著，但是長期與大劑量應(yīng)用的不良反應(yīng)較大，造成機體不可逆的損傷。因此，減少糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑的毒副作用同時提高其療效是現(xiàn)代臨床需要解決的問題。

研究顯示，具有滋補作用中藥方劑扶正固本可以彌補免疫抑制劑對機體內(nèi)環(huán)境的損害，可安全、高效地用于輔助治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡[3,4]。解毒祛瘀滋陰方具有健脾益腎滋陰作用，方中熟地、鱉甲和黃芪等中藥起滋陰養(yǎng)血益氣作用，薏苡仁和茯苓起健脾作用，可彌補系統(tǒng)性紅斑狼瘡導(dǎo)致的耗氣傷津。但是目前有關(guān)解毒祛瘀滋陰方治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的機制研究較少。Wnt/β-catenin信號通路在免疫調(diào)節(jié)與自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。Tveita 等[5]發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎動物腎組織中Wnt信號通路被激活，β-catenin出現(xiàn)高表達，并且其下游信號LEF1因子的mRNA表達水平明顯升高，提示W(wǎng)nt信號通路活化可能參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎腎臟形態(tài)學(xué)的改變。另有研究通過系統(tǒng)性紅斑狼瘡動物模型發(fā)現(xiàn)，隨著狼瘡腎炎的發(fā)展，動物血清與腎組織中β-catenin表達逐漸升高，同時β-catenin靶基因表達也相應(yīng)增加[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎患者腎臟組織β-catenin及其mRNA水平高表達，而且與系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎活動度具有相關(guān)性[7]。通過以上研究可以推斷wnt/β-catenin 的激活參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎的發(fā)生及發(fā)展。本實驗主要觀察解毒祛瘀滋陰方對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠的作用及Wnt/β-catenin信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雌性系統(tǒng)性紅斑狼瘡MRL/lpr小鼠40只，8周齡，體重(25±2.3)g，購自深圳市拓普生物科技有限公司。雌性C57BL/6小鼠20只，8周齡，體重(26±2.8)g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。實驗中對動物的處置符合3R規(guī)則。

1.1.2主要試劑 解毒祛瘀滋陰方購自浙江省中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，主要成分為：熟地18 g、鱉甲12 g、黃芪12 g、薏苡仁15 g、茯苓9 g、赤芍12 g、柴胡9 g、青蒿9 g和甘草6 g等，水煎，濃縮成生藥含量1.0 g/ml。CD4-FITC(ANT-132)購自上海江萊生物科技有限公司。CD25-PE抗體(130-101-426)購自上海恒斐生物科技有限公司。小鼠血清肌酐ELISA檢測試劑盒(SJH-033740)購自青島捷世康生物科技有限公司。小鼠血清尿素氮ELISA檢測試劑盒(EK-R21223)購自上海酶研生物科技有限公司。小鼠抗雙鏈DNA抗體ELISA檢測試劑盒(BJ42946)購自廣州邊金生物科技有限公司。小鼠抗核抗體ELISA檢測試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司。CD4-FITC、IFNγ-PE及IL-4-APC抗體購自eBioscience公司。Wnt3a抗體(ab81614)、β-catenin抗體(ab22656)購自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗分組 將40只系統(tǒng)性紅斑狼瘡MRL/lpr小鼠隨機分為模型組與藥物組，藥物組灌胃給予25 g/(kg·d)的解毒祛瘀滋陰方，模型組灌胃給予等量的生理鹽水，連續(xù)給藥21 d；將20只C57BL/6小鼠作為正常組，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2尿素氮、肌酐和抗雙鏈DNA抗體檢測 給藥21 d后每組各取小鼠10只，5%水合氯醛麻醉(0.1 ml/10 g)后摘眼球取血200 μl，離心、取血清，取一部分血清，利用酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測血尿素氮、肌酐、抗雙鏈DNA抗體水平，將剩余血清樣品置于-80℃保存?zhèn)溆?。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明操作進行。

1.2.3外周血炎性因子檢測 取剩余血清，進行IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ水平的檢測，嚴格依照ELISA檢測試劑盒說明操作進行。

1.2.4腎臟病理觀察 采血后取各組小鼠腎臟，經(jīng)腎門切取1/2，固定于甲醛中24 h，梯度乙醇脫水后浸蠟、石蠟包埋，切片厚度為3 μm，脫蠟后常規(guī)蘇木精-伊紅染色，透明、中性樹脂封固，顯微鏡下觀察。

1.2.5調(diào)節(jié)性T細胞比例檢測 給藥21 d后每組各取小鼠10只，5%水合氯醛麻醉(0.1 ml/10 g)后尾部取血約50 μl，分別加入抗體CD4-FITC、CD25-PE及同型對照，空白管不加任何抗體，室溫孵育30 min；加染色緩沖液2 ml，1 500 r/min離心5 min洗滌2次，棄上清液；加冷固定/穿膜劑4℃避光孵育30 min；加穿膜緩沖液1 200 r/min離心5 min洗滌2次，棄上清液；加入300～400 μl染色緩沖液懸浮混勻；加入Foxp3同型對照抗體或抗體4℃避光孵育30 min；以穿膜劑緩沖液1 200 r/min離心5 min 離心洗滌2次，棄上清液；懸浮于300～400 μl染色緩沖液，上流式細胞儀檢測。

1.2.6脾臟輔助性T細胞亞群檢測 尾部取血后取各組小鼠脾臟組織，剪碎后以膠原酶消化過濾，利用淋巴細胞分離液制備單個核細胞懸液，分別加入CD4-FITC細胞膜染色、IFN-γ-PE及IL-4-APC細胞質(zhì)染色避光孵育30 min，利用流式細胞儀檢測CD4+細胞中CD4+IFN-γ+細胞(Th1)、CD4+IL-4+細胞(Th2)陽性率，并計算Th1/Th2值。

1.2.7Western blot檢測 取各組小鼠腎皮質(zhì)，加入預(yù)冷的蛋白裂解液，采用BCA法進行蛋白質(zhì)定量檢測。首先將蛋白煮沸3～5 min使其變性，然后以每孔40 μg上樣，以12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，120 V電泳25 min后再以150 V電泳至Marker在分離膠中完全分開。根據(jù)對應(yīng)的Marker在相應(yīng)的位置切下目的蛋白凝膠，然后利用轉(zhuǎn)膜儀將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再以TBST配制的脫脂牛奶封閉2 h，將封閉好的膜在自封袋中分別與稀釋的一抗(Wnt3a、β-catenin)混合，4℃孵育過夜。以TBST洗膜3次，每次10 min，再與稀釋的二抗混合，37℃孵育2 h，以TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯色、曝光。

2 結(jié)果

2.1尿素氮、肌酐和抗雙鏈DNA抗體檢測 各組小鼠血清尿素氮、肌酐和抗雙鏈DNA抗體檢測結(jié)果見表1，與正常組比較，模型組尿素氮、肌酐和抗雙鏈DNA抗體水平顯著升高，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物組尿素氮、肌酐和抗雙鏈DNA抗體水平顯著降低，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2炎性因子檢測 與正常組比較，模型組IL-2、IFN-γ、IL-10濃度降低(P<0.05)，IL-4濃度升高(P<0.05)；與模型組比較，藥物組IL-2、IFN-γ、IL-10濃度升高(P<0.05)，IL-4濃度降低(P<0.05)，見表2。

GroupsUreanitrogen(mmol/L)Creatinine(μmol/L)Anti-double-strandedDNA antibodies(U/ml)Normal group5.02±0.4917.39±3.150Model group13.75±1.211)38.23±4.121)148.31±24.181)Drug group8.39±0.482)26.37±3.282)70.19±18.792)

Note:Compared with the normal group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

2.3腎臟病理觀察 蘇木精-伊紅染色可見，正常組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)正常，未見腫脹與萎縮，系膜細胞正常，系膜基質(zhì)未見增生；模型組小鼠腎小球腫脹明顯，可見明顯增厚的腎小球毛細血管基底膜及大量增生的系膜細胞，系膜基質(zhì)增生明顯，腎小管水腫明顯，炎性細胞浸潤于腎間質(zhì)；相較于模型組，小鼠藥物組腎小球毛細血管基底膜增厚程度減少，系膜細胞減少，系膜基質(zhì)增生程度減少，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤減少，見圖1。

2.4調(diào)節(jié)性T細胞比例檢測 與正常組比較，模型組CD4+CD25+Foxp3+T細胞陽性率降低，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物組CD4+CD25+Foxp3+T細胞陽性率升高，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.5脾臟輔助性T細胞亞群檢測 模型組脾臟Th1細胞比例低于正常組(P<0.05)，藥物組脾臟Th1細胞比例高于模型組(P<0.05)；模型組脾臟Th2細胞比例高于正常組(P<0.05)，藥物組脾臟Th2細胞與模型組比較無差異(P>0.05)，見圖3；正常組、模型組、藥物組Th1/Th2比值分別為0.98±0.22、0.59±0.13、1.02±0.21，模型組Th1/Th2比值低于正常組(P<0.05)，藥物組Th1/Th2高于模型組(P<0.05)。

2.6Western blot檢測 與正常組比較，模型組Wnt-3a、β-catenin蛋白表達顯著升高，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，藥物組Wnt3a、β-catenin蛋白表達顯著降低，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

GroupsIL-2(ng/L)IFN-γ(μg/L)IL-10(ng/L)IL-4(ng/L)Normal group12.98±2.15103.28±9.34130.34±12.1011.25±1.19Model group4.17±0.791)54.31±9.131)78.59±19.631)28.67±3.551)Drug group10.31±2.182)90.25±6.122)120.88±19.382)16.27±4.842)

Note:Compared with the normal group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

圖1 各組小鼠腎臟病理學(xué)觀察(蘇木精-伊紅染色) Fig.1 Pathological observation of kidneys of mice in each group(HE staining)Note:A.Normal group；B.Model group；C.Drug group.

圖2 各組小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+T細胞陽性率Fig.2 Positive rate of CD4+CD25+Foxp3+T cells in peripheral blood of mice in each group

圖3 各組小鼠脾臟輔助性T細胞亞群檢測Fig.3 Detection of helper T lymphocyte subsets in spleen of mice in each groupNote: A.The proportion of Th1 cells in the spleen of mice in each group；B.The proportion of Th2 cells in the spleen of mice in each group.

圖4 各組小鼠腎臟組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達Fig.4 Expression of Wnt3a and β-catenin in kidney tissue of mice in each groupNote: Compared with the normal group,*.P P

3 討論

與其他針對某個靶器官損害的自身免疫性疾病不同的是，系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種可引起全身多發(fā)性器官損害的自身免疫性疾病，目前的觀點認為其發(fā)病與遺傳特質(zhì)及環(huán)境因素密切相關(guān)?？闺p鏈DNA抗體水平升高是系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者標志性的血清學(xué)改變，也是反映患者病情活動性的良好指標[8,9]。幾乎所有的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者均存在血清抗雙鏈DNA抗體水平的升高。過高的自身抗體在循環(huán)中可以形成免疫復(fù)合物，進而沉積在靶器官中，損傷組織器官，例如免疫復(fù)合物沉積在腎臟中會導(dǎo)致腎小球腎炎的發(fā)生。同時在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者腎臟中可見大量炎性細胞浸潤，腎小球結(jié)構(gòu)遭到破壞，進而影響腎功能狀態(tài)，尿素氮、血肌酐及尿蛋白等指標發(fā)生異常改變[10]。并且在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病免疫應(yīng)答過程中，B淋巴細胞、T淋巴細胞及相關(guān)免疫細胞因子發(fā)揮了重要作用[11-13]，其中T淋巴細胞可分為Th1和Th2效應(yīng)細胞，Th1細胞負責介導(dǎo)細胞免疫，通過釋放IFN-γ等細胞因子來發(fā)揮吞噬效應(yīng)；Th2細胞負責介導(dǎo)體液免疫，通過釋放IL-4、IL-6等細胞因子來促進T淋巴細胞免疫增殖，引發(fā)機體免疫功能紊亂，發(fā)生自身免疫損傷。

解毒祛瘀滋陰方具有清熱解毒、活血祛瘀與滋陰益腎等主要功效，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡減少激素用量與減少激素不良反應(yīng)方面發(fā)揮了較好的效果[14,15]，但是有關(guān)解毒祛瘀滋陰方治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的作用機制研究不多見。作為經(jīng)典自發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡動物模型的MRL/lpr小鼠，其疾病發(fā)展與人系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床與病理表現(xiàn)相似，所以本實驗以MRL/lpr小鼠為系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型，主要觀察解毒祛瘀滋陰方的治療作用及對Wnt/β-catenin信號通路的影響。

本實驗結(jié)果顯示，系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠尿素氮、肌酐和抗雙鏈DNA抗體水平及IL-4濃度升高，IL-2、IFN-γ、IL-10濃度降低，CD4+CD25+Foxp3+T細胞陽性率降低，Th1細胞比例及Th1/Th2降低，同時出現(xiàn)了嚴重的腎臟病理損傷，而經(jīng)過解毒祛瘀滋陰方治療后，系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠尿素氮、肌酐和抗雙鏈DNA抗體水平及IL-4濃度顯著降低，IL-2、IFN-γ、IL-10濃度升高，CD4+CD25+Foxp3+T細胞陽性率升高，Th1細胞比例及Th1/Th2升高，同時腎臟病理損傷明顯減輕，提示解毒祛瘀滋陰方可改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠的免疫功能與腎損害，與以往研究結(jié)果一致[16]。

研究已證實Wnt/β-catenin信號通路參與了急性腎損傷的修復(fù)[17]，同時亦有研究證實Wnt/β-catenin信號通路在系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎中存在異常表達[18]。本實驗檢測發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達顯著升高，由此推測Wnt/β-catenin信號通路可能參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎的發(fā)生與發(fā)展。而經(jīng)過解毒祛瘀滋陰方治療后，系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達出現(xiàn)了明顯的降低，提示解毒祛瘀滋陰方可能通過調(diào)節(jié)Wnt3a、β-catenin蛋白表達來減輕系統(tǒng)性紅斑狼瘡的腎損傷。但是本實驗僅檢測了Wnt3a、β-catenin蛋白表達情況，未進行相關(guān)的基因檢測，因此實驗結(jié)果還有待進一步的證實。本實驗提示解毒祛瘀滋陰方可改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠的免疫功能與腎損害，其機制可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。