吳茱萸次堿對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠腦組織病理、免疫失衡和氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究①

周海燕 周俐紅 張彩霞 周 立 韓玉華

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，新鄉(xiāng) 453000)

腦中風(fēng)是一種非常常見(jiàn)的腦血管疾病，是由于顱內(nèi)腦血管阻塞或破裂引起的急性腦損傷，在中老年群體中具有高發(fā)生率、高致死率和高致殘率，超過(guò)70%的腦中風(fēng)是由局灶性腦缺血引起的[1,2]。而最終腦梗死面積以及神經(jīng)功能的結(jié)果依賴(lài)許多因素，例如局部缺血的持續(xù)時(shí)間、嚴(yán)重性、側(cè)支血流量、全身血壓、梗死病因以及定位，同時(shí)也與年齡、性別、并存疾病等背景因素有關(guān)[3]。近期研究表明，氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥引起的內(nèi)皮功能紊亂是缺血性腦中風(fēng)導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷和死亡的關(guān)鍵因素，通過(guò)藥物干涉降低局灶性腦缺血的氧化應(yīng)激和炎癥水平能夠有效阻止腦缺血造成的細(xì)胞損傷[4,5]。吳茱萸次堿(Rutaecarpine,Rut)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥吳茱萸的一種主要活性成分，是一種吲哚喹唑啉類(lèi)生物堿，具有廣泛的藥理學(xué)效應(yīng)[6]。有研究表明吳茱萸次堿在腦缺血性疾病中具有保護(hù)性作用，然而Rut對(duì)局灶性腦缺血保護(hù)作用的生物學(xué)機(jī)制尚有很多空缺之處[7,8]。本研究通過(guò)建立大鼠局灶性腦缺血模型(CI/R)，在Rut對(duì)局灶性腦缺血組織損傷、氧化應(yīng)激以及炎癥中發(fā)揮作用的機(jī)制進(jìn)行了初步探究。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 Rut，純度98%，購(gòu)自南京澤郎科技有限公司；HE染色液、TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒、Trizol試劑、RIPA試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒SsoFast Eva-Green Supermix試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；白細(xì)胞介素6(IL-6)、IL-1β、IL-4、IL-10 ELISA試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司；半胱天冬酶3(Caspase-3)、核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)、血紅素氧化酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、依賴(lài)還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1]一抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只清潔級(jí)SD大鼠(體質(zhì)量280～320 g)購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，常溫、標(biāo)準(zhǔn)溫度和濕度、12 h晝夜交替的封閉環(huán)境下喂養(yǎng)1周，期間水和食料正常供給。

1.2方法

1.2.1分組及模型建立方法 大鼠隨機(jī)分為空對(duì)照(Control)組，CI/R組，Rut 5、10、20 mg/kg組，每組6只，Rut 5、10、20 mg/kg組大鼠術(shù)前按照對(duì)應(yīng)組別的劑量連續(xù)灌胃給藥10 d，每天1次。最后1次灌胃治療24 h后，Control組大鼠僅切開(kāi)皮膚并分離血管，不做其他處理，其余各組腹腔注射戊巴比妥麻醉，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端，并在頸外動(dòng)脈切口，將涂抹了少許硅膠的0.25 mm尼龍線(xiàn)插入頸內(nèi)動(dòng)脈，深度20 mm，并結(jié)扎4 h，緩緩抽出線(xiàn)栓，縫合傷口，建立大鼠CI/R模型。術(shù)后24 h參照Bederson評(píng)分法對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分，對(duì)側(cè)前肢無(wú)法完全伸展；2分，前肢抵抗對(duì)側(cè)推力能力下降；3分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。

1.2.2貼紙去除實(shí)驗(yàn) 模型建立24 h后，將大鼠置于圓筒中60 s適應(yīng)新環(huán)境，使用黏性貼紙貼在大鼠前肢掌面，記錄大鼠撕除前肢紙片的時(shí)間。

1.2.3平衡木行走實(shí)驗(yàn) 將長(zhǎng)度80 cm，寬度2.5 cm 的平衡木放置于高于地面10 cm，讓大鼠從平衡木經(jīng)過(guò)，記錄大鼠通過(guò)平衡木所經(jīng)過(guò)的時(shí)間。

1.2.4HE染色檢測(cè)腦組織病理性改變 神經(jīng)功能測(cè)試結(jié)束后，將大鼠斷頭取腦，摘除嗅球、小腦和低位腦干等部位，4%多聚甲醛固定，清洗后使用70%～100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并切成2 μm切片，二甲苯脫蠟，100%～70%乙醇梯度水化，使用HE染色液進(jìn)行染色后封片，光學(xué)顯微鏡觀察腦組織病理性改變。

1.2.5TUNEL染色檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡 腦組織進(jìn)行石蠟包埋切片后，二甲苯脫蠟，100%～70%乙醇梯度水化，蛋白酶K去除組織蛋白，清洗后使用2%過(guò)氧化氫室溫反應(yīng)，TdT反應(yīng)液孵育，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗地高辛抗體反應(yīng)，0.05%DAB溶液顯色，封片后光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡，每張切片選取6個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目在視野總細(xì)胞數(shù)目中所占的百分比作為凋亡率。

1.2.6RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá) Trizol試劑盒提取腦組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)SsoFastTMEva-Green?Supermix試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為0℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，循環(huán)次數(shù)40次，2-ΔΔCt法處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7ELISA檢測(cè)血清細(xì)胞因子 血液離心收集血清，向預(yù)先包被細(xì)胞因子對(duì)應(yīng)抗體的酶標(biāo)孔中加入樣品，再根據(jù)試劑盒的操作說(shuō)明加入試劑盒預(yù)先配制的試劑進(jìn)行反應(yīng)，檢測(cè)450 nm吸光度，根據(jù)預(yù)先制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算樣品細(xì)胞因子的濃度。

1.2.8試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激 血液離心收集血清，根據(jù)試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)依次加入試劑盒中提供的試劑進(jìn)行反應(yīng)，并檢測(cè)與說(shuō)明對(duì)應(yīng)的吸光度值，其中SOD檢測(cè)采用的原理是羥胺法，MDA檢測(cè)采用的原理是TBA法，LDH檢測(cè)采用的原理是比色法，ROS檢測(cè)的原理是化學(xué)熒光法。

1.2.9Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) RIPA試劑盒提取腦組織總蛋白，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)定量結(jié)果，取每孔20 μg的上樣量進(jìn)行點(diǎn)樣，10%SDS-PAGE電泳分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，加入適量一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST清洗后適量二抗室溫孵育2 h，ECL顯色液顯色，凝膠成像儀分析條帶的灰度值進(jìn)行相對(duì)定量。

2 結(jié)果

2.1Rut減輕大鼠CI/R對(duì)神經(jīng)功能的影響 結(jié)果見(jiàn)圖1A，與Control組比較，CI/R組、Rut 5、10、20 mg/kg 組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CI/R組比較，Rut 10、20 mg/kg組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分顯著降低(P<0.05)，且呈現(xiàn)量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)，與Control組比較，CI/R組、Rut 5、10、20 mg/kg組大鼠雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過(guò)桿時(shí)間均顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CI/R組比較，Rut 10、20 mg/kg組大鼠雙側(cè)貼紙去除時(shí)間、平衡木過(guò)桿時(shí)間顯著縮短(P<0.05)，且呈現(xiàn)量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1B、C。

2.2Rut減輕CI/R大鼠腦組織損傷 結(jié)果見(jiàn)圖2A、B，Control組大鼠大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，排列整齊有序，無(wú)明顯神經(jīng)變性壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，CI/R組皮質(zhì)區(qū)域變性，細(xì)胞縮小，核固縮，細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)目減少，同時(shí)相比于Control組出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞凋亡(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Rut 5、10、20 mg/kg組相比于Control組盡管也出現(xiàn)了病理性改變，但相比于CI/R組明顯減輕，同時(shí)細(xì)胞凋亡率也明顯降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外對(duì)細(xì)胞凋亡標(biāo)志物Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)圖2C、D，與Control組比較，CI/R組、Rut 5、10 mg/kg組大鼠腦組織中Bax基因表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2基因表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，并且活化型Caspase-3蛋白水平也顯著升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CI/R組比較，Rut 5、10、20 mg/kg組大鼠腦組織中Bax基因表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2基因表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，活化型Caspase-3蛋白水平也顯著降低(P<0.05)，且具有量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 Rut對(duì)CI/R大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、雙側(cè)貼紙去除時(shí)間和平衡木過(guò)桿時(shí)間的影響Fig.1 Effects of Rut on neurologic function score,remo-val time of double sticker and passing time of balance beam of CI/R ratNote:A.Neurologic function score of rat;B.Removal time of double sticker test of rat;C.Passing time of balance beam test of rat,n=6.*.P P

2.3Rut對(duì)CI/R大鼠血清細(xì)胞因子的調(diào)控作用 結(jié)果見(jiàn)圖3A，與Control組比較，CI/R組、Rut 5、10 mg/kg組大鼠血清促炎細(xì)胞因子IL-6、IL-1β濃度顯著升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CI/R組比較，Rut 5、10、20 mg/kg組大鼠血清IL-6、IL-1β濃度顯著降低(P<0.05)，且呈量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，與Control組比較，CI/R組、Rut 5 mg/kg組大鼠血清抑炎細(xì)胞因子IL-4、IL-10濃度顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CI/R組比較，Rut 5、10、20 mg/kg組大鼠血清IL-4、IL-10濃度顯著升高(P<0.05)，且呈量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3B。

2.4Rut對(duì)CI/R大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)的調(diào)控作用 結(jié)果見(jiàn)圖4A～D所示，與Control組比較，CI/R組、Rut 5、10 mg/kg組大鼠血清SOD濃度顯著降低(P<0.05)，血清MDA、LDH、ROS濃度顯著升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CI/R組比較，Rut 5、10、20 mg/kg組大鼠血清SOD濃度顯著升高(P<0.05)，血清MDA、LDH、ROS濃度顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 Rut對(duì)CI/R大鼠腦組織病理性改變及細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of apoptotic rate in brain tissue of CI/R ratNote:A.HE staining to detect pathological changes in rat brain tissue and TUNEL staining to detect rat brain tissue cell apoptosis;B.CI/R apoptosis rate of rat brain tissue;C.Bax and Bcl-2 gene expressions in rat brain tissue detected by RT-PCR;D.Caspase-3 protein level in rat brain tissue detected by western blot,n=6.*.P P

圖3 Rut對(duì)CI/R大鼠血清細(xì)胞因子濃度的影響Fig.3 Effect of Rut on concentrations of serum cytokine in CI/R ratNote:A.Concentrations of serum inflammatory cytokine in rat;B:Concentrations of serum anti-inflammatory cytokine in rat,n=6,*.P P

圖4 Rut對(duì)CI/R大鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)志物的影響Fig.4 Effect of Rut on serum oxidative stress marker in CI/R ratNote:A.Concentration of serum SOD in rat;B.Concentration of serum MDA in rat;C.Concentration of serum LDH in rat;D.Concentration of serum ROS in rat,n=6.*.P P

2.5Rut激活CI/R大鼠Nrf2/HO-1/NQO1通路 結(jié)果見(jiàn)圖5A、B，與Control組比較，CI/R組、Rut 5、10 mg/kg組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平顯著降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與CI/R組比較，Rut 5、10、20 mg/kg組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平顯著升高(P<0.05)，且呈量效關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 Rut對(duì)大鼠Nrf2/HO-1/NQO1通路的調(diào)控作用Fig.5 Effect of Rut on concentrations of serum cytokine in CI/R ratNote:A.Concentrations of serum inflammatory cytokine in rat;B.Concentrations of serum anti-inflammatory cytokine in rat,n=6.*.P P

3 討論

Rut是傳統(tǒng)中藥吳茱萸的生物活性成分，在諸如心血管、消化系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)等方面的疾病中均表現(xiàn)出一定的藥理作用[9]。有研究表明抗炎和抗氧化應(yīng)激作用是Rut發(fā)揮其藥理作用的重要機(jī)制，Li等[10]發(fā)現(xiàn)Rut可通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和核因子κB通路減輕膿毒癥誘導(dǎo)的腹膜巨噬細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)；Wang等[11]發(fā)現(xiàn)Rut可通過(guò)JNK/p38 MAPK信號(hào)通路以及干涉氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕大鼠腎缺血再灌注損傷。炎癥和氧化應(yīng)激是局灶性腦缺血損傷的關(guān)鍵因素，推測(cè)Rut在局灶性腦缺血損傷中發(fā)揮的保護(hù)性作用與這兩個(gè)關(guān)鍵因素有關(guān)。為了探究其中可能存在的作用機(jī)制，本研究通過(guò)線(xiàn)栓法復(fù)制了大鼠CI/R模型[12]，并通過(guò)Rut預(yù)處理治療。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)Rut灌胃治療的CI/R大鼠，神經(jīng)功能方面的指標(biāo)得到明顯好轉(zhuǎn)，同時(shí)腦組織病理性改變和細(xì)胞凋亡率均顯著減輕，并且變化具有量效關(guān)系。此外，對(duì)細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子Bax、Bcl-2、Caspase-3的檢測(cè)結(jié)果顯示，Rut顯著降低了組織中Bax基因表達(dá)水平，提高了Bcl-2基因表達(dá)水平，并且活化型Caspase-3蛋白水平顯著降低，Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中的一對(duì)凋亡相關(guān)調(diào)控因子，其中Bcl-2具有抑制凋亡的作用，Bax具有促進(jìn)凋亡的作用，而Caspase-3是細(xì)胞凋亡關(guān)鍵的執(zhí)行因子，其表達(dá)量改變可反映出細(xì)胞凋亡水平[13]。上述結(jié)果表明，Rut可減輕局灶性腦缺血造成的組織損傷，減少細(xì)胞凋亡，對(duì)腦神經(jīng)功能具有保護(hù)性作用。

當(dāng)局灶性腦缺血發(fā)生時(shí)，浸潤(rùn)的白細(xì)胞以及包括神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)等腦細(xì)胞成員會(huì)釋放出各種炎性介質(zhì)，包括各種細(xì)胞因子，同時(shí)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧自由基，造成組織損傷的發(fā)展[14]。通過(guò)藥物作用降低炎癥介質(zhì)，釋放及控制氧化應(yīng)激是緩解局灶性腦缺血病情的常用手段。Gong等[15]研究發(fā)現(xiàn)甘草甜素可通過(guò)調(diào)控腦缺血再灌注過(guò)程中產(chǎn)生的炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，對(duì)大鼠腦組織發(fā)揮保護(hù)性作用。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)Rut治療的CI/R大鼠血清中IL-6和IL-1β濃度顯著降低，IL-4和IL-10濃度顯著升高，IL-6是體內(nèi)重要的促炎細(xì)胞因子，IL-1β是體內(nèi)應(yīng)答感染時(shí)產(chǎn)生的細(xì)胞因子，廣泛參與了腦血栓和粥樣動(dòng)脈硬化等疾病的病理過(guò)程[16]。而IL-4是一種具有調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞作用的細(xì)胞因子，在腦修復(fù)過(guò)程中起著不可替代的作用，IL-10是一種炎癥和免疫抑制因子，在炎癥反應(yīng)中具有保護(hù)組織的作用[17,18]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)Rut治療的CI/R大鼠SOD濃度顯著升高，MDA、LDH、ROS濃度均顯著下降，SOD是體內(nèi)清除ROS等成分的主要酶類(lèi)，當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生后，SOD不斷消耗，同時(shí)ROS大量積累，ROS造成細(xì)胞損傷，當(dāng)脂質(zhì)過(guò)氧化時(shí)會(huì)生成MDA，可反映出氧化應(yīng)激的程度，LDH廣泛存在于腦細(xì)胞中，損傷的細(xì)胞會(huì)釋放出LDH[19]。結(jié)合上述結(jié)果表明，Rut可降低局灶性腦缺血的炎癥和氧化應(yīng)激，發(fā)揮保護(hù)性作用。

Nrf2是調(diào)控細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的最主要的轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2可進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，激活Nrf2下游的抗氧化基因表達(dá)，HO-1和NQO1是Nrf2下游對(duì)抗氧化應(yīng)激的主要酶類(lèi)，HO-1催化血紅素分解的產(chǎn)物具有抗氧化的功能，NQO1與氫醌相關(guān)的耦聯(lián)反應(yīng)有關(guān)[20]。研究表明Nrf2/HO-1/NQO1通路在腦損傷過(guò)程中具有保護(hù)性作用，Chen等[21]研究表明Nrf2的激活可誘導(dǎo)抗氧化和解毒性酶表達(dá)從而抗氧化應(yīng)激，對(duì)腦組織具有保護(hù)作用。有研究表明Rut具有調(diào)控Nrf2/HO-1/NQO1通路的作用[22]，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)Rut治療的CI/R大鼠，腦組織中Nrf2、HO-1、NQO1的表達(dá)均明顯恢復(fù)，表明Rut對(duì)局灶性腦缺血的保護(hù)作用與Nrf2/HO-1/NQO1通路激活有關(guān)。

綜上所述，Rut可減輕局灶性腦缺血引起的炎癥和氧化應(yīng)激，減輕腦組織損傷，減少腦細(xì)胞凋亡，對(duì)腦功能具有保護(hù)性作用，其作用機(jī)制與Nrf2/HO-1/NQO1通路激活有關(guān)。研究結(jié)果為Rut在缺血性腦中風(fēng)治療上的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。