通心絡(luò)對腦缺血再灌注大鼠TLR4和NF-κB表達(dá)的影響①

李佳佳 朱云波 康玲伶 朱 江

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，承德 067000)

缺血性腦卒中是危害人類健康的高發(fā)病之一，目前缺血性腦卒中的發(fā)病機制尚未明了，但研究表明，炎癥反應(yīng)參與缺血性腦卒中的發(fā)生與發(fā)展，Toll樣受體4 (Toll-like receptor 4，TLR4) 通過介導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κB，NF-κB)的激活，促進其下游炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α等的表達(dá)，從而放大炎癥信號[1,2]。通心絡(luò)是有脈絡(luò)學(xué)說指導(dǎo)組方的中成藥，具有活血通絡(luò)、搜風(fēng)解痙的功效，是臨床上治療冠心病和缺血性腦卒中的主要用藥，大量文獻報道通心絡(luò)可通過保護血管及神經(jīng)損傷治療缺血性腦卒中[3,4]，但通心絡(luò)能否介導(dǎo)TLR4/NF-κB通路對缺血性腦卒中產(chǎn)生療效尚未報道。故本文旨在建立大鼠腦缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion，I/R)模型，觀察不同劑量通心絡(luò)的藥效及具體效用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠50只，4月齡，體質(zhì)量(300±20)g，由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(鄂)2018-0028，飼養(yǎng)于清潔級動物房中，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后用于后續(xù)試驗中。

1.1.2試劑與儀器 通心絡(luò)(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z19989915)，尼莫地平(山東新華制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H10910080)，TUNEL試劑盒(Roche公司)，IL-6、IL-1β及TNF-αELISA試劑盒(美國R&D公司)，Caspase-3、TLR4、p65、p-p65及β-Actin抗體(美國Sigma-Aldrich公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗或小鼠二抗(美國Santa Cruz公司)；JS-1075化學(xué)發(fā)光全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)；GRME-LUX2-3L光學(xué)顯微鏡(日本Kyowa公司)。

1.2方法

1.2.1模型制備 采用改良Longa法[5]建立腦缺血再灌注模型，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉大鼠，仰臥固定；小心開腦，分離出右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈和頸外動脈根部，于頸總動脈靠近分叉口處開孔后插入線栓，從頸總動脈通過頸內(nèi)動脈一直插入到大腦中動脈處；局灶性腦缺血90 min后去掉線栓，進行再灌注。假手術(shù)組按照上述方法分離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈及頸外動脈，但不作結(jié)扎和插入線栓處理。術(shù)后各組大鼠分籠飼養(yǎng)，并注意保溫。

1.2.2分組與給藥 將50只SD大鼠隨機分為5組：假手術(shù)組(Sham)、模型組(I/R)、通心絡(luò)低、高劑量組(0.5 g/kg、2 g/kg)和尼莫地平組(2 mg/kg)，每組10只；造模成功后，通心絡(luò)按0.5 g/kg、2 g/kg，尼莫地平按2 mg/kg灌胃給藥，連續(xù)給藥10 d；Sham組和I/R組以生理鹽水替代。

1.2.3樣品采集 收集各組大鼠眼底靜脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min，取上清即為血清，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?；腹腔注?0%的水合氯醛麻醉大鼠，快速斷頭，冰上迅速開顱取腦，置于液氮罐中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4神經(jīng)功能缺損評分 參照Longa評分對各組大鼠神經(jīng)功能學(xué)進行評價[6]，分值為0～5分，其中無神經(jīng)缺損癥狀為0分，不能完全伸展對側(cè)前爪為1分，行走時向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分，行走時向偏癱側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走、意識受到抑制為4分，死亡為5分。剔除死亡大鼠，并補足各組大鼠數(shù)目。

1.2.5腦梗死體積的測量 取出腦組織，以2 mm間距切片，置于0.5%TTC緩沖液中，避光條件下37℃孵育30 min；固定于4%多聚甲醛中，用數(shù)碼相機拍照，應(yīng)用軟件Image J掃描圖片，計算腦梗死區(qū)所占百分比(相較于對側(cè)腦體積)。

1.2.6病理學(xué)形態(tài)檢測 取出腦組織置于4%多聚甲醛液中固定4 h，作常規(guī)石蠟切片，梯度乙醇脫水后行HE染色，顯微鏡下觀察大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.2.7TUNEL檢測腦組織中細(xì)胞凋亡 取出腦組織作常規(guī)石蠟切片，二甲苯浸洗10 min脫蠟，梯度乙醇浸洗，滴加蛋白酶 K增加細(xì)胞通透性，37℃下孵育20 min，滴加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液加蓋玻片，避光條件下37℃孵育1 h，滴加50 μl converter-POD加蓋玻片,避光條件下37℃孵育30 min，加100 μl DAB混合液，室溫下反應(yīng)10 min，蘇木素復(fù)染3 s后沖洗，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)目(凋亡的細(xì)胞被染色)，隨機挑選5個視野(200～500個細(xì)胞)計數(shù)并拍照。

1.2.8ELISA檢測腦組織中血清因子的含量 取出血清樣本，參照ELISA試劑盒說明書，檢測大鼠血清中白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的含量。

1.2.9Western blot檢測腦組織中Caspase-3、TLR4及NF-κB p65的表達(dá) 取出腦組織，剪碎后置于RIPA裂解液中勻漿，冰上靜置裂解40 min，4℃下9 000 r/min 離心10 min，去上清測蛋白濃度，定量后置于沸水浴中變性10 min；配制SDS-PAGE凝膠，點蛋白樣電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)跑至底部時停止電泳，轉(zhuǎn)膜2 h，封閉2 h，分別置于兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、TLR4、p65、p-p65及β-actin抗體(稀釋比為1∶1 000)中，4℃孵育過夜；清洗后，加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗或小鼠二抗(稀釋比為1∶8 000)，室溫孵育40 min；應(yīng)用JS-1075化學(xué)發(fā)光全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)進行曝光拍照。應(yīng)用軟件Image J掃描圖片，以β-actin為內(nèi)參，計算Caspase-3、TLR4、p65的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1通心絡(luò)對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分和腦梗死體積的影響 與Sham組相比，I/R組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積顯著升高(P<0.05)；通心絡(luò)低、高劑量組和尼莫地平組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分、腦梗死體積顯著降低(P<0.05)，通心絡(luò)組具有劑量依賴性，見表1。

2.2通心絡(luò)對腦缺血再灌注大鼠病理學(xué)形態(tài)的影響 HE染色如圖1所示，Sham組神經(jīng)元細(xì)胞呈圓形，且形態(tài)正常、結(jié)構(gòu)完整、排列整齊，細(xì)胞內(nèi)未見水腫、空泡、核固縮現(xiàn)象，無炎性細(xì)胞浸潤；I/R組神經(jīng)元細(xì)胞呈梭形或三角形，且結(jié)構(gòu)模糊、排列紊亂，細(xì)胞間距增大，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯水腫、空泡和核固縮現(xiàn)象，有炎性細(xì)胞浸潤；相較于I/R組，通心絡(luò)低、高劑量組和尼莫地平組細(xì)胞形態(tài)與結(jié)構(gòu)明顯改善，周圍細(xì)胞水腫、空泡和核固縮現(xiàn)象減輕。

2.3通心絡(luò)對腦缺血再灌注大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響 如圖2所示，與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)、Caspase-3的表達(dá)顯著升高(P<0.05)；通心絡(luò)低、高劑量組和尼莫地平組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡數(shù)、Caspase-3的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，通心絡(luò)組具有劑量依賴性。

2.4通心絡(luò)對腦缺血再灌注大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平的影響 如圖3所示，與Sham組相比，I/R組大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；通心絡(luò)低、高劑量組和尼莫地平組大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平顯著降低(P<0.05)，通心絡(luò)組具有劑量依賴性。

GroupsNeurologic deficitscoring(Score)Volume ofcerebral infarction(%)Sham0.00±0.000.00±0.00I/R3.14±0.651)34.42±3.521)0.5 g/kg Tongxinluo2.47±1.532)27.45±1.382)2 g/kg Tongxinluo1.62±0.752)21.56±1.152)2 mg/kg Nimodipine1.18±0.512)17.49±0.942)

Note:I/R vs.Sham,1)P<0.05；Tongxinluo,Nimodipine vs.I/R,2)P<0.05.

圖1 通心絡(luò)對腦缺血再灌注大鼠病理學(xué)形態(tài)的影響(HE,×400，n=5)Fig.1 Effects of Tongxinluo on pathological morphology of rats with cerebral ischemia-reperfusion(HE,×400,n=5)Note: A.Sham；B.I/R；C.0.5 g/kg Tongxinluo；D.2 g/kg Tongxinluo；E.2 mg/kg Nimodipine.

圖2 通心絡(luò)對腦缺血再灌注大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響(n=5)Fig.2 Effects of Tongxinluo on apoptosis of brain tissues in rats with cerebral ischemia-reperfusion(n=5)Note: A.Sham；B.I/R；C.0.5 g/kg Tongxinluo；D.2 g/kg Tongxinluo；E.2 mg/kg Nimodipine;I/R vs.Sham,#.P P

圖3 通心絡(luò)對腦缺血再灌注大鼠血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平的影響(n=5)Fig.3 Effects of Tongxinluo on serum IL-6,IL-1β and TNF-α levels in rats with cerebral ischemia-reperfusion(n=5)Note: I/R vs.Sham,#.P P

圖4 通心絡(luò)對腦缺血再灌注大鼠腦組織中TLR4、NF-κB p65表達(dá)的影響(n=5)Fig.4 Effects of Tongxinluo on expression of TLR4 and NF-κB p65 in brain tissue of rats with cerebral ischemia-reperfusion(n=5)Note: A.Sham；B.I/R；C.0.5 g/kg Tongxinluo；D.2 g/kg Tongxinluo；E.2 mg/kg Nimodipine;I/R vs.Sham,#.P P

2.5通心絡(luò)對腦缺血再灌注大鼠腦組織中TLR4、NF-κB p65表達(dá)的影響 如圖4所示，與Sham組相比，I/R組大鼠腦組織中TLR4、NF-κB p65表達(dá)顯著升高(P<0.05)；通心絡(luò)低、高劑量組和尼莫地平組大鼠腦組織中TLR4、NF-κB p65表達(dá)顯著降低(P<0.05)，通心絡(luò)組具有劑量依賴性。

3 討論

通心絡(luò)由人參、水蛭、全蝎、土元、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、冰片、檀香、降香、乳香、酸棗仁等組成，可用于治療氣虛血瘀絡(luò)阻型腦卒中[7]。據(jù)報道，通心絡(luò)可靶向興奮性氨基酸毒性、鈣超載、自由基、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等，保護腦組織細(xì)胞[8]，但通心絡(luò)介導(dǎo)TLR4/NF-κB信號通路對腦卒中的影響報道較少。本研究通過改良Longa法處理大鼠，成功復(fù)制腦缺血再灌注(I/R)模型，發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)可明顯改善I/R大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分并減少腦梗死體積，與譚輝等[9]研究結(jié)果一致，提示通心絡(luò)可以緩解缺血再灌注腦損傷。

TLR4是重要的調(diào)控先天性免疫功能的效應(yīng)分子，參與多種疾病的病理生理過程，主要表達(dá)于防御功能的細(xì)胞中[10]。TLR4通過與接頭蛋白髓樣分化因子88、白細(xì)胞介素相關(guān)激酶等結(jié)合，激活NF-κB p65和MAPKs信號通路，誘發(fā)炎性細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6等)的分泌，最終導(dǎo)致機體過度炎癥反應(yīng)[11]。IL-6、TNF-α是重要的促炎因子，其過度分泌會引起局部炎癥反應(yīng)，損傷器官；IL-1β是主要的炎癥調(diào)節(jié)因子，可以誘導(dǎo)促炎因子的產(chǎn)生，放大炎癥信號[12]。通心絡(luò)膠囊是傳統(tǒng)的抗炎中成藥，其中人參、冰片、檀香、降香等成分均具有良好的抗炎活性[13,14]，本研究發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)可明顯減少血清IL-6、IL-1β及TNF-α水平和腦組織中TLR4 及NF-κB p65的表達(dá)，提示通心絡(luò)可能通過下調(diào)TLR4/NF-κB信號，減少IL-6、IL-1β及TNF-α等炎性因子的分泌，從而降低腦缺血損傷后的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。

此外，TLR4/NF-κB信號通路還參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等生理過程[15]。細(xì)胞凋亡過程是凋亡相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果，同時受細(xì)胞內(nèi)外多種基因調(diào)控，Caspase-3是凋亡過程中重要的執(zhí)行蛋白[16]。本研究發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)可明顯下調(diào)Caspase-3水平，抑制腦組織細(xì)胞的凋亡，起到腦組織保護作用，且高劑量組效果顯著，與位庚等[17]報道通心絡(luò)在受損心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的效用相似。

綜上所述，通心絡(luò)可保護腦缺血再灌注對大鼠腦組織產(chǎn)生的損傷，可能與下調(diào)TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)；但本研究僅在動物水平探討，尚需開展細(xì)胞實驗作進一步驗證。