外源性硫化氫對(duì)2型糖尿病大鼠心肌纖維化及TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響①

曾奇虎 翁靜飛 李小林 楊 萍 白 雪 范忠才

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院,瀘州 646000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者心臟最主要的慢性并發(fā)癥之一，早期表現(xiàn)為無(wú)癥狀性心室舒張功能減退、順應(yīng)性下降，逐漸發(fā)展到心室收縮功能障礙而出現(xiàn)心力衰竭的癥狀，最終發(fā)展為有明顯癥狀的充血性心力衰竭，病理表現(xiàn)為心肌微血管病變、心肌細(xì)胞肥大、心肌膠原重構(gòu)、心肌間質(zhì)纖維化和進(jìn)行性心肌細(xì)胞壞死和凋亡，其中以心肌膠原重構(gòu)和心肌間質(zhì)纖維化為DCM特征性病理改變[1]。目前認(rèn)為外源性硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)可能通過(guò)抑制ROS、NF-κB、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、凋亡、氧化應(yīng)激等信號(hào)通路改善糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化，延緩糖尿病心肌病的進(jìn)展[2-4]，但其機(jī)制未完全闡明。眾所周知，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)是一種多功能細(xì)胞因子，參與調(diào)控多種細(xì)胞的免疫、生長(zhǎng)、分化、凋亡、自噬、腫瘤抑制等生物學(xué)進(jìn)程，是致心肌纖維化關(guān)鍵因子。研究表明，TGF-β1可以調(diào)控下游Smads信號(hào)蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)基因調(diào)控和聚集，參與心臟、腎臟、肺、肝臟等器官纖維化過(guò)程[5-8]。目前對(duì)外源性H2S是否參與糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化過(guò)程及其機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型，觀察外源性H2S對(duì)糖尿病心肌病大鼠心臟功能、心肌纖維化及TGF-β1/Smads信號(hào)通路蛋白影響，探討外源性H2S對(duì)糖尿病心肌病作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 STZ(S0130)、NaHS(13590)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。一抗：Ⅰ型膠原蛋白兔抗大鼠多克隆抗體(ab34710)、TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗體(ab92486)、Smad7兔抗大鼠多克隆抗體(ab216 428)、GAPDH(ab37168)均購(gòu)自Abcam公司。p-Smad2/3兔抗大鼠單克隆抗體(#8828)購(gòu)自美國(guó)CST公司。HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(SA00001-2)購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(P0012)，RIPA裂解液(P0013B)和苯甲基磺酰氟 (PMSF，ST506) 等Western試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，全自動(dòng)生化分析儀(Beckman CX7，美國(guó))。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及藥物處理 SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠47只，10～16周齡(體質(zhì)量200～220 g)，由西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證編號(hào)為SCXK(川) 2013-17，使用許可證編號(hào)為SYXK(川)2013-181，所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，后續(xù)實(shí)驗(yàn)在醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度 23～26℃，相對(duì)濕度50%～60%，晝夜循環(huán)12 h，飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食和飲水。醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)本研究實(shí)施，符合動(dòng)物倫理相關(guān)規(guī)定。 27只成年SD雄性大鼠和20只成年SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后分別予以高糖高脂飼料(成都達(dá)碩飼料公司按配方配制：10%豬油、20%蔗糖、6%蛋白粉、3%蛋黃粉、61%常規(guī)飼料)和普通飼料飼養(yǎng)4周，禁食12 h，高糖高脂飲食大鼠單次腹腔注射STZ 40 mg/kg(溶解于檸檬酸鈉緩沖液中，pH=4.4)，普通飲食大鼠予以同等劑量檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射。注射后3 d 和5 d采尾靜脈血測(cè)血糖，血糖≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠，且出現(xiàn)多食、多尿、多飲，提示構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型成功。造模成功后選取糖尿病大鼠20只，正常大鼠20只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分組為：正常對(duì)照組(Control組)、硫氫化鈉對(duì)照組(NaHS組)、糖尿病組(DM組)、糖尿病+硫氫化鈉組(DM+NaHS組),每組10只。造模成功后予以DM+NaHS組和NaHS組大鼠腹腔注射NaHS溶液100 μmol/(kg·d)，NaHS作為外源性H2S供體，予以Control組和DM組腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)12周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)抽取空腹尾靜脈血，使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)空腹血糖(FBG)。各組大鼠予以腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，應(yīng)用GE Vivi-E9心血管超高端彩超行心臟左心室功能評(píng)價(jià)。然后收集各組大鼠左心室心肌組織標(biāo)本，部分用4%多聚甲醛溶液中固定，用于石蠟切片制備，余切成豌豆?fàn)罘湃?80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2左心室功能評(píng)價(jià) 測(cè)量各組大鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)，計(jì)算短軸縮短率(LVFS)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和E/A ratio。

1.2.3Masson染色測(cè)定心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù) 各組石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水，按照Masson試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行Masson染色。大鼠心肌細(xì)胞染色呈紅色，心肌膠原纖維呈藍(lán)色，使用光鏡觀察大鼠心肌結(jié)構(gòu)及纖維化程度，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)量測(cè)定各組心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。

1.2.4使用Western blot法檢測(cè)心肌組織蛋白表達(dá)水平 取出-80℃保存的心肌組織，每100 mg加入預(yù)冷組織裂解液1 ml，超聲破碎儀中(冰浴)勻漿后離心取上清液，使用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。充分混合的上清加5×蛋白上樣緩沖液后于100℃煮沸變性 10 min，保存于-20℃冰箱。將變性好的組織樣品冰上溶解后以10 μl總蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳后使用半干法轉(zhuǎn)膜至PDVF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗去封閉液，洗膜3次，每次8 min。分別將已稀釋一抗Ⅰ型膠原蛋白(1∶1 000)、TGF-β1(1∶1 000)、Smad7(1∶1 000)、p-Smad2/3(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，用TBST(pH=7.6)洗膜3次，每次8 min；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶3 000)37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次8 min，ECL顯色、曝光，保存膠片。使用Image J 1.8軟件分析目的條帶光密度值(OD)，使用GAPDH條帶進(jìn)行OD校正。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠血糖及心功能影響 與Control組相比，DM組和DM+NaHS組大鼠FBG明顯升高(P<0.05)。NaHS干預(yù)后，DM+NaHS組FBG較DM組降低(P< 0.05)，提示H2S能改善糖尿病心肌病大鼠血糖水平及心臟功能。見表1。

2.2各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果 Control組CVF為(6.83±0.98)%，與Control組相比，DM組大鼠心肌組織排列紊亂，間質(zhì)膠原纖維量顯著增多，CVF(18.57±1.60)%明顯增大(P<0.05)。與DM組相比，DM+NaHS組心肌組織排列紊亂和間質(zhì)纖維化程度有明顯改善，CVF(16.06±1.80)%明顯減少(P<0.05)。見圖1。

GroupsFBG(mmol/L)LVEDD(mm)LVESD (mm)LVFS(%)LVEF(%)E/A ratioControl4.36±0.567.20±0.693.94±0.6745.45±6.5476.50±2.681.56±0.12NaHS4.86±1.037.23±0.143.97±0.4245.08±6.3177.10±1.961.54±0.12DM25.13±2.581)7.80±0.361)4.79±0.291)38.54±2.921)64.8±2.941)1.25±0.131)DM+NaHS22.49±2.451)2)7.63±0.571)2)4.30±0.392)43.70±4.242)71.5±2.011)2)1.37±0.121)2)

Note:1)P<0.05 vs Control group；2)P<0.05 vs DM group.

圖1 左心室Masson染色圖片和心肌CVF定量分析

Fig.1 Representative images of left ventricular tissue sections stained with Masson′s Trichrome and Quantitative analysis of myocyte

Note: *.PPn=10.

圖2 H2S對(duì)糖尿病大鼠TGF-β1/Smads信號(hào)通路蛋白及Ⅰ型膠原蛋白水平影響Fig.2 Effect of H2S on expression of TGF-β1/Smads signaling pathway and CollagenⅠprotein were measured by Western blot in diabetic ratsNote: *.P P

2.3各組心肌組織Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad7、p-Smad2/3蛋白表達(dá)的比較 與Control組相比，DM組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1表達(dá)水平和Smad2/3磷酸化水平明顯增加，Smad7表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05)。與DM組相比，DM+NaHS組心肌組織Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1表達(dá)水平和Smad2/3磷酸化水平明顯下調(diào)，Smad7表達(dá)水平增加(P<0.05)。見圖2。

3 討論

目前糖尿病患者以2型糖尿病為主，是DCM主要人群，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建2型糖尿病大鼠模型，研究2型糖尿病的DCM病理生理學(xué)及分子機(jī)制。糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，認(rèn)為能量代謝障礙、線粒體的損傷與功能障礙、鈣調(diào)節(jié)損傷、活性氧形成、炎癥、細(xì)胞凋亡、心臟肥大和纖維化等參與心力衰竭的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)STZ聯(lián)合高糖高脂飼料構(gòu)建2型糖尿病，外源性H2S供體NaHS干預(yù)2型糖尿病模型12周，檢測(cè)DM大鼠心臟彩超參數(shù)，心臟LVEDD、LVESD明顯升高，LVEF、LVFS和E/A ratio明顯降低，提示糖尿病大鼠心臟收縮和舒張功能明顯下降；Masson染色顯示，DM組大鼠心肌組織排列紊亂，間質(zhì)膠原纖維量顯著增多，CVF明顯增加。以上證據(jù)符合DCM心肌功能及纖維化表現(xiàn)，提示DCM造模成功。

TGF-β1/Smads信號(hào)通路介導(dǎo)心肌間質(zhì)纖維化已經(jīng)成為目前研究熱點(diǎn)，在心臟膠原合成與心臟纖維化起著關(guān)鍵性的作用。TGF-β1作為TGF-β的最重要生物學(xué)功能亞型，通過(guò)激活基于經(jīng)典的Smads和非Smads信號(hào)通路誘導(dǎo)纖維化，導(dǎo)致肌成纖維細(xì)胞激活，ECM的過(guò)量產(chǎn)生和ECM降解的抑制[9]。阻斷TGF-β1/Smads信號(hào)通路可以抑制Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白合成、肌成纖維細(xì)胞的增殖與分化，從而緩解心肌纖維化。Smad7是TGF-β1/Smads信號(hào)通路起負(fù)調(diào)控作用的關(guān)鍵信號(hào)分子，通過(guò)與TGF-β1受體結(jié)合阻止招募Smad3、Smad2及其磷酸化，抑制細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物形成，從而改善纖維化[10]。Yuan等[11]研究表明醛脫氫酶2酶活性的激活通過(guò)TGF-β1/Smads信號(hào)通路抑制成纖維細(xì)胞分化，從而改善心肌間質(zhì)纖維化。曾強(qiáng)林等[12]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smads信號(hào)通路是環(huán)孢素腎病模型小鼠腎間質(zhì)纖維化重要機(jī)制之一。Shen等[13]研究證實(shí)，參松養(yǎng)心膠囊通過(guò)抑制糖尿病大鼠心肌TGF-β1、p-Smad2/3表達(dá)，上調(diào)Smad7表達(dá)，抑制心肌纖維化和改善心臟功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌TGF-β1、p-Smad2/3明顯上調(diào)，Smad7明顯下調(diào)，CVF增加和心肌間質(zhì)纖維化程度加重，心臟功能惡化。經(jīng)H2S干預(yù)后，明顯上調(diào)Smad7表達(dá)，下調(diào)TGF-β1、p-Smad2/3表達(dá)，使DCM大鼠CVF減低，心肌間質(zhì)纖維化和心功能改善，提示H2S可能通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)通路，改善DCM心肌纖維化，從而保護(hù)心臟功能。

眾所周知，H2S是繼一氧化氮和一氧化碳體內(nèi)重要的細(xì)胞信號(hào)調(diào)控分子，內(nèi)源性H2S可由半胱氨酸在多種酶催化作用下產(chǎn)生,具有松弛血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞張力等作用[14]。近年來(lái)，大量研究證據(jù)表明，H2S在心血管系統(tǒng)病理學(xué)與生理學(xué)中扮演著重要作用[15]。外源性H2S可以通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激、凋亡等信號(hào)通路，抑制心臟成纖維細(xì)胞合成Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原，減緩ECM在心臟間質(zhì)沉積，改善心臟纖維化，從而改善糖尿病心肌病大鼠心功能[2,3]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)外源性H2S可以減少Ⅰ型膠原表達(dá)，改善糖尿病大鼠心肌間質(zhì)纖維化，改善糖尿病大鼠心臟功能。

綜上所述，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)研究，筆者認(rèn)為外源性H2S可能通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)通路，介導(dǎo)心肌間質(zhì)纖維化進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)心臟的效應(yīng)，為DCM治療提供新的途徑和靶點(diǎn)。但本研究?jī)H初步探討外源性H2S對(duì)DCM作用及機(jī)制，需要繼續(xù)對(duì)Smads家族其他信號(hào)蛋白分子和可能存在其他信號(hào)通路參與介導(dǎo)H2S對(duì)心臟保護(hù)作用機(jī)制深入研究。