CD14、MD-2在LPS致乳腺上皮細(xì)胞炎癥中的作用①

王萬林 高 月 謝雪艷 李天珍 易 瓊 王 魯

(貴州大學(xué)藥學(xué)院,貴陽 550025)

乳腺上皮細(xì)胞(mammary epithelial cells，MECs)主要作用是生乳，與免疫細(xì)胞不同。當(dāng)LPS侵入時，其卻能做出免疫反應(yīng)，分泌細(xì)胞炎性因子[1]。Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)信號通路已在先天免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中得到充分體現(xiàn)[2]，白細(xì)胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)、髓樣分化蛋白2(myeloid differential protein-2，MD-2)在免疫細(xì)胞的胞外LPS-TLR4炎癥信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著巨大作用，LPS激活TLR4胞外信號通路，需要與LPS結(jié)合蛋白結(jié)合后傳遞給細(xì)胞膜上的CD14，再與MD-2相互作用將跨膜信號轉(zhuǎn)入細(xì)胞，激活免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)而誘發(fā)炎癥反應(yīng)[3]，但是該過程在乳腺上皮細(xì)胞中未見報道。我們前期研究證明 MECs中有TLR4表達(dá)[4]，LPS促進(jìn)MECs胞內(nèi)的TLR4、MyD88、IRAK-1、TRAF6、TAK-1、NIK mRNA的表達(dá)[5]，抑制IκB mRNA的表達(dá)[6]，最終促進(jìn)細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8，說明MECs的TLR4胞內(nèi)信號通路與免疫細(xì)胞是一致的。但是MECs胞外是否也存在CD14和MD-2蛋白，且是否發(fā)揮著免疫細(xì)胞相似的作用未見報道，因此本實驗體外培養(yǎng)小鼠MECs，分析該基因在小鼠MECs胞外LPS至TLR4信號途徑中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級昆明小白鼠購自解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心[動物許可證號：SCXK(渝)-2012-0011]。在貴州大學(xué)貴州省生化工程中心SPF級動物實驗室[動物許可證號：SYXK(黔) 2013-0001]飼養(yǎng)至妊娠中后期。

1.1.2主要藥物及試劑 胎牛血清(FCS)、DMEM/F12培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶購自Thermo scientific公司；rhEGF、霍亂毒素、胰島素、脂多糖(LPS)、異硫氰酸熒光標(biāo)記FITC-LPS購自Sigma公司；L-谷氨酰胺購自SAB公司；MTT購自Solarbio公司；TIAN Script RT kit、RNA pure Tissue kit、2×Taq PCR Master Mix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Power SYBR Green PCR Master Mix購自AB公司；mouse TNF-α ELISA kit、mouse IL-1β ELISA kit、mouse IL-6 ELISA kit購自武漢基因美生物公司；Anti-CD14、anti-MD-2、抗anti-Rat IgG-Alexa 594、抗anti-Rabbit IgG-Alexa 488購自Abcam公司。

1.1.3主要實驗儀器 Thermo Nano Drop ND-2000微量紫外分光光度計、Multiskan Go型全波段酶標(biāo)儀、Thermo Fisher 3111儲水型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo公司；倒置相差顯微鏡購自日本Olympus公司；Biosciences FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼；實時熒光定量RT-PCR儀購自德國jena公司；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)、梯度PCR儀購自Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測LPS對MECs增殖的影響 參照文獻(xiàn)[1]的方法，制備小鼠MECs，細(xì)胞濃度1×106個/ml 接種96孔板，隨機分成空白對照組和LPS 終濃度1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、20 μg/ml、30 μg/ml、40 μg/ml、50 μg/ml刺激組(n=3)，對照組加入等體積培養(yǎng)基。在加入LPS刺激后的1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h時，按照MTT法操作，計算490 nm下各孔的OD值。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)篩選LPS與MECs的最佳結(jié)合條件 應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的LPS (FITC-LPS)與細(xì)胞結(jié)合能力。按照1.2.1方法制備細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度到1×106個/ml密度鋪板，分成空白對照組、LPS組?？瞻讓φ战M只加500 μl細(xì)胞培養(yǎng)液，LPS組加入含帶有異硫氰酸熒光素標(biāo)記LPS的培養(yǎng)基500 μl，熒光素標(biāo)記LPS終濃度分別為：1 μg/ml、5 μg/ml、10 μg/ml、15 μg/ml、20 μg/ml(n=3)，在熒光素標(biāo)記LPS刺激后3 h、6 h、12 h、24 h，分別加入胰蛋白酶消化，終止消化收集各組細(xì)胞4℃離心1 000 r/min，加入少量D-Hanks液吹打混勻，參照文獻(xiàn)[7]方法上機檢測，異硫氰酸酯(FITC)是常用的熒光標(biāo)記物，作為一種陽離子熒光染料,其標(biāo)記原理主要是與生物大分子上的NH2基團(tuán)結(jié)合，LPS的磷酸基團(tuán)可攜帶大量的負(fù)電荷，使LPS可與陽離子發(fā)生強烈的相互作用，在波長為530 nm下，F(xiàn)ITC-LPS所發(fā)出的綠色熒光表示細(xì)胞內(nèi)的LPS，檢測細(xì)胞平均熒光量，就代表細(xì)胞結(jié)合FITC-LPS的多少。計算細(xì)胞結(jié)合率，篩選出最佳結(jié)合條件。細(xì)胞結(jié)合率=結(jié)合熒光LPS的細(xì)胞數(shù)/總的檢測細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3PCR檢測CD14、MD-2 mRNA的表達(dá) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中小鼠CD14(NM_009841)、MD-2(NM_016923)mRNA序列，分別設(shè)計CD14和MD-2引物，見表1。按1.2.1方法制備小鼠MECs，提取各組細(xì)胞RNA，用TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄，并于-20℃保存?zhèn)溆茫荻萈CR測mRNA的表達(dá)并篩選最佳退火溫度。PCR反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，55～65℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃ 2 min。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測MECs上CD14、MD-2蛋白的表達(dá) 參照1.2.1制備小鼠MECs，分成空白對照組、CD14和MD-2組。CD14組、MD-2組每孔分別先加入60 μl Anti-CD14(1∶100倍稀釋)或60 μl Anti-MD-2(1∶100)4℃孵育30 min，抽凈一抗后用PBS洗滌。常溫下10%羊血清封閉液孵育10 min，抽凈羊血清后用PBS洗滌，分別加入100 μl anti-Rat IgG-Alexa 594(1∶200)、anti-Rabbit IgG-Alexa 488于室溫下避光孵育1 h，PBS 洗滌。對照組不加抗體，其余操作相同。操作完成后，胰蛋白酶消化離心，加入培養(yǎng)基混勻，流式細(xì)胞儀檢測蛋白表達(dá)。

表1 引物的核苷酸序列

Tab.1 Sequences of primers for qPCR

GenePrimer sequence(5′→3′) Length(bp)CD14Forward:AGCACACTCGCTCAACTTTTC88Reverse:GCCCAATTCAGGATTGTCAGACMD-2Forward:GAATCTGAGAAGCAACAGTGGT144 Reverse:CTCAACATGCACAAATCCATTGGGAPDHForward:GCAACTCCCACTCTTCCA158 Reverse:GTCCAGGGTTTCTTACTCC

1.2.5qPCR檢測篩選siRNA最佳轉(zhuǎn)染條件 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中小鼠CD14(NM_009841)、MD-2(NM_016923)mRNA序列，分別設(shè)計CD14和MD-2的qPCR引物(表1)和siRNA引物片段(表2)。制備小鼠MECs，分成空白組、20 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L 終濃度組(n=3)。于轉(zhuǎn)染前24 h，換為無雙抗細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，按照賽默飛公司Lipo-2000轉(zhuǎn)染試劑說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。提取各組RNA進(jìn)行qPCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，自變性開始三步為一個循環(huán)，共設(shè)40個循環(huán)；72℃ 2 min。使用2-ΔΔCt法計算各組mRNA相對表達(dá)量，根據(jù)轉(zhuǎn)染抑制率篩選基因最佳轉(zhuǎn)染濃度。其中：轉(zhuǎn)染抑制率=1-2-ΔΔCt。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)轉(zhuǎn)染后-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參)轉(zhuǎn)染前。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測CD14、MD-2基因沉默后對LPS與細(xì)胞結(jié)合的影響 制備小鼠MECs，分為對照組、LPS刺激組、CD14轉(zhuǎn)染組、MD-2轉(zhuǎn)染組和CD14+MD-2同時轉(zhuǎn)染組，參照1.2.5中方法最佳條件轉(zhuǎn)染24 h后，抽去孔中培養(yǎng)基，除對照組外各組分別加入帶熒光LPS終濃度為5 μg/ml的生長培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h。流式細(xì)胞儀檢測各組中結(jié)合熒光LPS的細(xì)胞數(shù)，計算細(xì)胞結(jié)合率。

1.2.7ELISA法檢測MECs上CD14、MD-2基因沉默后對LPS致細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6及IL-1β的影響 參照1.2.5中最佳沉默條件對小鼠MECs采用相同沉默處理，收集細(xì)胞培養(yǎng)板各組孔中細(xì)胞培養(yǎng)液，按照ELISA試劑盒說明書的檢測方法，分別測定各組中細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-6及IL-1β的含量。

2 結(jié)果

2.1LPS對MECs增殖的影響 在同一作用時間下(24 h)，隨著LPS濃度增加(>10 μg/ml)，細(xì)胞OD490 nm值低于空白組，當(dāng)濃度達(dá)到50 μg/ml時其與空白組之間呈現(xiàn)極顯著的差異(P<0.01)。如圖1A所示：LPS作用于小鼠MECs(24 h)IC50為76.83 μg/ml。如圖1B所示:10 μg/ml LPS作用于細(xì)胞，6 h之后，各個時間點空白組以及LPS組的OD490 nm值與1 h相比差異極顯著性上升(P<0.01)，在24 h之后細(xì)胞增殖緩慢。

2.2LPS與細(xì)胞最佳結(jié)合的條件 結(jié)果如圖2所示，MECs與LPS的結(jié)合率與濃度呈明顯的對數(shù)關(guān)系，在LPS濃度≤5 μg/ml之前，細(xì)胞與LPS的結(jié)合以穩(wěn)定的幾何級數(shù)極快增長，之后細(xì)胞與LPS的結(jié)合增長緩慢，呈現(xiàn)飽和狀態(tài)。圖2C、D所示，小鼠MECs與LPS的結(jié)合率同LPS的刺激時間呈明顯的對數(shù)關(guān)系，當(dāng)LPS刺激細(xì)胞≤6 h時，細(xì)胞與LPS的結(jié)合以穩(wěn)定的幾何級數(shù)極快增長，當(dāng)>12 h之后，細(xì)胞與LPS的結(jié)合緩慢呈現(xiàn)穩(wěn)定的平臺期。

2.3乳腺上皮細(xì)胞中CD14、MD-2 mRNA表達(dá)的結(jié)果 圖3分別是CD14、MD-2兩對引物PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，根據(jù)設(shè)計引物片段的大小分別在88 bp、144 bp處有明亮的條帶，說明細(xì)胞中有這2個基因的表達(dá)，它們的最佳退火溫度均為59.7℃。

2.4小鼠MECs上CD14、MD-2蛋白表達(dá)的結(jié)果 圖4結(jié)果所示，空白組沒有目的蛋白表達(dá)，CD14孵育組有微量CD14的蛋白表達(dá)，MD-2孵育組有一定量的MD-2蛋白表達(dá)。

2.5CD4、MD-2基因轉(zhuǎn)染最佳的條件 CD14-mus-905片段在50 nmol/L濃度下的轉(zhuǎn)染率最高(圖5A)，MD-2-mus-234片段在30 nmol/L濃度下轉(zhuǎn)染率最高(圖5B)。與空白組相比，三個轉(zhuǎn)染濃度下CD14、MD-2的mRNA表達(dá)均被極顯著抑制(P<0.01)。

表2 CD14及MD-2的siRNA序列

Tab.2 siRNA nucleotide sequences data of CD14 and MD-2

siRNAsiRNA sequences(5′→3′)CD14-mus-905Forward:CCUUAGACCUGUCUGACAATTReverse:UUGUCAGACAGGUCUAAGGTTMD-2-mus-234Forward:CAUGUUGAGUUCAUUCCAATTReverse:UUGGAAUGAACUCAACAUGTT

圖1 不同濃度及不同時間LPS對小鼠MECs增殖影響Fig.1 Effects of proliferation of mouse MECs at different concentrations and times of LPSNote: A.Compared with control，**.P PP

圖2 不同濃度及不同作用時間的熒光LPS流式相關(guān)強度Fig.2 Relation fluorescence intensity of fluorescence LPS at different concentrations and time

圖3 PCR反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis images of PCR reaction productNote: The TM of Lane 1-Lane 7 correspons to 62℃，60.8℃，59.7℃，58.3℃，57.2℃，56.1℃ and 55℃ respectively.

圖4 CD14、MD-2蛋白表達(dá)流式相關(guān)強度Fig.4 Relation fluorescence intensity of protein expression of CD14 and MD-2

圖5 siRNA片段各轉(zhuǎn)染組對小鼠MECs中目的基因mRNA表達(dá)的抑制率Fig.5 Inhibitory effect of siRNA fragments on expression of target gene mRNA in mouse MECsNote:Compared with control,**.P

2.6CD14、MD-2基因沉默后LPS與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)果 空白組、LPS組、MD-2轉(zhuǎn)染組、CD14轉(zhuǎn)染組、CD14+MD-2轉(zhuǎn)染組熒光LPS與小鼠MECs的流式相關(guān)強度圖(圖6A)。同空白組相比，LPS組、各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的結(jié)合率都極顯著升高(P<0.01)；同LPS組相比，MD-2轉(zhuǎn)染組、CD14轉(zhuǎn)染組、CD14+MD-2轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞結(jié)合率都極顯著下降(P<0.01)，且分別下降了3.00%、7.88%、13.41%(圖6B)。

圖6 基因沉默后熒光 LPS 與細(xì)胞流式相關(guān)強度、細(xì)胞結(jié)合率Fig.6 Relation fluorescence intensity and rate of binding with LPS after gene silencingNote: Compared with control,**.P P

圖7 基因沉默后LPS致細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6及IL-1β量Fig.7 Content of TNF-α,IL-6,IL-1β in each group with LPS after gene silencingNote: Compared with control,*.P PP P

2.7基因沉默后對LPS致細(xì)胞分泌炎性因子TNF-α、IL-6及IL-1β的結(jié)果 ELISA檢測顯示，同空白組相比，LPS組細(xì)胞分泌TNF-α(圖7A)、IL-6(圖7B)、IL-1β(圖7C)的量呈極顯著升高(P<0.01)；同LPS組相比，MD-2轉(zhuǎn)染組、CD14轉(zhuǎn)染組、CD14+MD-2轉(zhuǎn)染組分泌炎性因子量呈極顯著下降(P<0.01)。

3 討論

病原微生物侵入MECs時，MECs釋放趨化因子使中性粒細(xì)胞(PMN)局部募集，同時先天免疫系統(tǒng)通過病原體相關(guān)分子模式(PAMP)與膜上的識別受體TLR4相互作用[8]，進(jìn)而分泌各種細(xì)胞炎性因子，發(fā)揮天然免疫保護(hù)作用。其中，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)已經(jīng)得到了廣泛的研究，CD14和MD-2在LPS-TLR4炎性信號通路中的作用已經(jīng)明確，但是在MECs中未見驗證。CD14為脂多糖的受體，分為膜結(jié)合mCD14和分泌型sCD14，前者主要通過糖基磷脂酰肌醇尾部連接到骨髓細(xì)胞表面，分布于成熟單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面，后者主要分布于非髓樣細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞表面，幫助LPS信號在缺乏膜結(jié)合mCD14的細(xì)胞中傳遞。MD-2是一種具有脂多糖結(jié)合口袋的分泌型糖蛋白，可以提高 TLR4對LPS的敏感性，增加TLR4受體的穩(wěn)定性[9]。MD-2在結(jié)構(gòu)上存在兩個相對獨立的功能結(jié)構(gòu)域，其在LPS激活TLR4中作為細(xì)胞外銜接蛋白[10]，結(jié)合LPS和TLR4配體，從而激活NF-κB通路。而最新研究表明可溶性TLR4(sTLR4) 可與MD-2形成復(fù)合體，競爭性抑制細(xì)胞膜上TLR4與其配體結(jié)合[11]，作為TLR4的一種負(fù)調(diào)節(jié)機制。LBP和CD14之間的相互作用是LPS介導(dǎo)的TLR4/MD-2信號傳遞所必需的，LBP-N缺乏LPS轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域或mCD14表達(dá)減少，會導(dǎo)致LPS結(jié)合減弱[12]。

LPS刺激細(xì)胞后，LPS結(jié)合蛋白LBP通過N端堿性貼片與LPS膠束結(jié)合，在C末端[13]與分泌型sCD14及膜結(jié)合型mCD14形成CD14/LBP/LPS三元復(fù)合物，之后CD14與LBP發(fā)生解離，從而使LPS能夠轉(zhuǎn)移到由TLR-4組成的LPS受體復(fù)合物L(fēng)PS/TLR4/MD-2中，最終啟動一系列激酶調(diào)節(jié)的磷酸化反應(yīng)。

小鼠的敲除研究表明，MD-2是TLR4信號傳導(dǎo)中必不可少的輔助分子，缺乏MD-2基因的小鼠對LPS沒有反應(yīng)[14]。Yang等[15]發(fā)現(xiàn)在TLR4陽性細(xì)胞中表達(dá)的MD-2可以使LPS/CD14誘導(dǎo)的NF-κB的活化提升，共表達(dá)TLR4/MD-2能活化MAPK通路、增強Elk-1的刺激信號，說明TLR4-MD-2復(fù)合體可以增強LPS介導(dǎo)的NF-κB通路和MAPK通路。Viriyakosol等[16]發(fā)現(xiàn)MD-2與LPS結(jié)合，無需LBP和CD14的輔助，同時MD-2能增強轉(zhuǎn)染了TLR4的倉鼠卵巢細(xì)胞LPS的生物活性，說明MD-2是真正的LPS結(jié)合蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)CD14、MD-2基因的沉默，影響了LPS與細(xì)胞的結(jié)合，同時LPS致細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6或IL-1β的量都顯著或極顯著下降。說明CD14、MD-2在胞外LPS至TLR4段的信號途徑中起重要作用，這也與文獻(xiàn)報道是一致。

前期研究發(fā)現(xiàn)MECs在LPS刺激下[5]，其胞內(nèi)信號的傳遞途徑與文獻(xiàn)[7]報道的免疫細(xì)胞的信號途徑是一致，這增加了我們對“MECs胞外LPS-TLR4信號途徑與免疫細(xì)胞是否一致”這個問題的探討。我們首先重新摸索了LPS刺激小鼠MECs最佳條件，結(jié)果顯示LPS刺激細(xì)胞的濃度在5～50 μg/ml 之間時對細(xì)胞的生長不會產(chǎn)生毒害作用。其濃度在5～10 μg/ml之間，刺激時間在6～12 h之間時，細(xì)胞與LPS的結(jié)合可以達(dá)到飽和；其次我們確認(rèn)MECs上有CD14、MD-2基因和蛋白的存在；最后我們發(fā)現(xiàn)MECs上的CD14、MD-2基因沉默能造成LPS-TLR4信號傳遞受阻，說明CD14、MD-2在MECs胞外LPS至TLR4段的信號途徑中起重要作用，這一結(jié)果將為胞外LPS-TLR4信號途徑的研究增加了MECs的研究數(shù)據(jù)。至于MECs上的CD14、MD-2與LPS/TLR4的關(guān)系如何，是否與免疫細(xì)胞完全一致，MECs中的CD14是m型還是s型等等問題，都有待進(jìn)一步深入研究。