從血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體調(diào)控角度探討地黃梓醇促血管新生作用及分子機(jī)制研究

周霞，張文倩，劉炬，李麗，劉付紅，劉炳男

研究表明，神經(jīng)保護(hù)劑在臨床上未達(dá)到理想的治療效果［1］，但其促使神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）成為缺血性損傷新的治療方向并受到臨床廣泛關(guān)注［2］。NVU 由LO 等于2002 年提出，指由神經(jīng)元、微血管、星形膠質(zhì)細(xì)胞及其軸突和其他支持細(xì)胞共同組成的復(fù)合體，是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能單位［3］。神經(jīng)元的修復(fù)必須依賴(lài)能量，而微血管網(wǎng)絡(luò)是能量輸送的基礎(chǔ)，這可能是單純應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)劑未達(dá)到理想治療效果的癥結(jié)所在?；诖耍R床上提出了通過(guò)促進(jìn)缺血后病灶區(qū)血管新生及微循環(huán)網(wǎng)絡(luò)重建而保護(hù)NVU 的構(gòu)想。血管內(nèi)皮細(xì)胞既是微血管的基本結(jié)構(gòu)，又具有復(fù)雜的代謝及內(nèi)分泌功能。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促血管生長(zhǎng)因子，可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及局部毛細(xì)血管新生等；此外，其還是一個(gè)多效性神經(jīng)保護(hù)因子，具有促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）分泌［4］、抗凋亡［5］及促進(jìn)軸突生長(zhǎng)、神經(jīng)再生、遷移等作用［6］。因此，通過(guò)調(diào)控VEGF、促進(jìn)微血管新生可保護(hù)NVU的主要成分［7］。

地黃是治療中風(fēng)經(jīng)典方劑中的常用藥，如地黃飲子（宋·《圣濟(jì)總錄》）、大秦艽湯（金·劉完素《素問(wèn)病機(jī)氣宜保命集》）等。梓醇是地黃的主要有效成分，以生地黃含量最高。既往采用地黃梓醇干預(yù)局灶性腦缺血大鼠模型的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后大鼠腦缺血周?chē)鷧^(qū)皮質(zhì)微血管數(shù)量明顯增加，提示地黃梓醇具有促血管新生作用［8-9］，但其具體機(jī)制尚未明確。筆者所在課題組前期研究結(jié)果顯示，腦出血急性期采用生地注射液治療有助于神經(jīng)功能恢復(fù)，尤其對(duì)陰虛風(fēng)動(dòng)型腦出血效果更明顯［10］。本研究旨在從VEGF 及其受體調(diào)控角度探討地黃梓醇促血管新生作用及分子機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2019 年4—8 月，人臍靜脈 內(nèi) 皮 細(xì) 胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。在含有1%雙抗、10% DMEM 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)HUVECs，培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為37 ℃恒溫，二氧化碳（CO2）含量為5%。

1.2 主要試劑與儀器 梓醇購(gòu)自上海源葉科技有限公司（純度≥98%，分子量為362.33），以終濃度為1 mg/ml的梓醇溶液作為神經(jīng)保護(hù)最佳濃度［11］；VEGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1（VEGFR-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR-2）引物購(gòu)自鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司，兔抗VEGF（AF5131）、兔抗VEGFR-1（H00002321）、兔抗VEGFR-2（92006）及兔抗GAPDH（14C10）購(gòu)自Affinity biologicals 公 司，VEGFR-1、VEGFR-2 抗 體 購(gòu)自Abcam 公司，MTT 試劑盒購(gòu)自索萊寶公司，RNA 提取試劑盒（Qiagen）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA 試劑盒（Applied Biosystems）及ViiA ? 7 Real-Time PCR System（Applied Biosystems）購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MTT 法 采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，具體如下：將對(duì)數(shù)期HUVECs 以1×105ml 的密度接種于96 孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%后更換不含血清的培養(yǎng)基并分別加入0.9%氯化鈉溶液（對(duì)照組）、梓醇溶液1 mg/ml（實(shí)驗(yàn)組）繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后向待測(cè)孔中加入MTT 溶液5 mg/ml，4 h 后向每孔加入二甲基亞砜（DMSO），搖床振蕩10 min 后在490 nm 波長(zhǎng)下測(cè)量每孔吸光度值（OD 值），并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。

1.3.2 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 采用細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，具體如下：將HUVECs 均勻接種于6 孔板中，鋪板前在板的背面用記號(hào)筆劃5～6 道平行的橫線，細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%后采用無(wú)菌200 μl 槍頭管尖（約0.7 mm）在各培養(yǎng)板相同位置劃垂直或平行直線，與以上橫線垂直，造成幾條“傷口”。之后采用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2 次，去除被槍頭管尖破壞而脫落的細(xì)胞并拍照，然后更換不含血清的培養(yǎng)基并分別加入0.9%氯化鈉溶液（對(duì)照組）、梓醇溶液1 mg/ml（實(shí)驗(yàn)組）進(jìn)行處理，培養(yǎng)0、12、24 h 后觀察細(xì)胞遷移情況，并計(jì)算100 倍顯微鏡下4 個(gè)獨(dú)立視野中超過(guò)劃線的細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次并取平均值。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 分別采用0.9%氯化鈉溶液（對(duì)照組）、梓醇溶液1 mg/ml（實(shí)驗(yàn)組）干預(yù)HUVECs 36 h，之后采用qRT-PCR 檢測(cè)VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 mRNA 表達(dá)情況，具體如下：分別采用RNA 提取試劑盒和RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑提取RNA 及合成cDNA，采用ViiA ? 7 Real-Time PCR System 進(jìn)行qRT-PCR 分析。95 ℃ 30 s，95℃ 10 s、60 ℃ 32 s 重復(fù)40 個(gè)循環(huán)，將GAPDH 作為內(nèi)參計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，qRT-PCR 重復(fù)3 次并取平均值。VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 及GAPDH 引物序列見(jiàn)表1。

表1 VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 及GAPDH 引物序列Table 1 Primer sequences of VEGF，VEGFR-1，VEGFR-2 and GAPDH

1.3.4 免疫印跡法 qRT-PCR 后采用免疫印跡法檢測(cè)VEGF、VEGFR-1、VEGFR-2 蛋白表達(dá)情況，具體如下：（1）提取蛋白：采用4 ℃預(yù)冷的PBS 沖洗細(xì)胞2 次，根據(jù)培養(yǎng)面積不同加入一定體積的0.1% SDSRIPA 裂解液及100 μM PMSF，其中RIPA:PMSF 比例為100:1，將其靜置于冰上15 min，然后將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP 管中反復(fù)吹打。4 ℃環(huán)境下13.8×g 離心15 min，收取上清液并提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。（2）采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。（3）蛋白變性：向蛋白質(zhì)樣品中加入一定體積的上樣緩沖液，95 ℃環(huán)境下加熱5 min使蛋白變性。（4）電泳：將蛋白質(zhì)加入聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn)樣孔，并于80 V 恒壓下電泳約30 min，然后在120 V恒壓下電泳約60 min，當(dāng)有色染料移至聚丙烯酰胺凝膠末端時(shí)停止電泳。（5）轉(zhuǎn)膜：配制1×轉(zhuǎn)膜液，制作轉(zhuǎn)膜“三明治”結(jié)構(gòu)，280 mA 恒流轉(zhuǎn)膜合適時(shí)間。（6）封閉：采用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h，封閉完成后采用TBS-T 緩沖液洗滌15 min，共洗滌3 次。（7）抗體孵育：采用抗體稀釋液按比例配制一抗工作液，4 ℃孵育過(guò)夜，第2 天孵育二抗。（8）顯影：將PVDF 膜浸入ECL 發(fā)光液中進(jìn)行顯影和分析，采用Image J 軟件定量分析蛋白，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（± s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗(yàn)，兩組間比較采用成組t 檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 地黃梓醇對(duì)HUVECs 增殖能力的影響 對(duì)照組HUVECs 的OD 值 為（0.366±0.103），低 于 實(shí) 驗(yàn) 組的（0.674±0.135），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.12，P=0.04）；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HUVECs 相對(duì)增殖率為（1.871±0.152）%。

2.2 地黃梓醇對(duì)HUVECs 遷移能力的影響 以培養(yǎng)0 h為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組HUVECs 培養(yǎng)12、24 h 遷移細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組HUVECs 培養(yǎng)24 h 遷移細(xì)胞數(shù)量均多于培養(yǎng)12 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。

表2 兩組HUVECs 培養(yǎng)12、24 h 遷移細(xì)胞數(shù)量比較（±s）Table 2 Comparison of number of migrating cells between the two groups 12，24 hours after culture

表2 兩組HUVECs 培養(yǎng)12、24 h 遷移細(xì)胞數(shù)量比較（±s）Table 2 Comparison of number of migrating cells between the two groups 12，24 hours after culture

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2.3 地黃梓醇對(duì)HUVECs VEGF 及其受體表達(dá)的影響 兩組HUVECs VEGFR-1 的mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組HUVECs VEGF、VEGFR-2 的mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)圖1～2）。

3 討論

圖1 兩組HUVECs VEGF 及其受體mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較Figure 1 Comparison of relative mRNA expression quantity of VEGF and its receptors between two groups

圖2 兩組HUVECs VEGF 及其受體蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Figure 2 Comparison of relative protein expression quantity of VEGF and its receptors between the two groups

美國(guó)神經(jīng)疾病和腦卒中研究院曾指出，在細(xì)胞、分子、基因?qū)用嫜芯磕X卒中后NVU 的變化及其機(jī)制將為缺血后腦保護(hù)研究提供新的方向，但NVU 作為一個(gè)功能單位，因細(xì)胞間存在大量信號(hào)傳導(dǎo)及對(duì)話而使研究者較難找準(zhǔn)研究的切入點(diǎn)。筆者所在課題組認(rèn)為腦缺血后微血管網(wǎng)絡(luò)重建與神經(jīng)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)在結(jié)構(gòu)和功能上密切相關(guān)，其中血管新生是微循環(huán)重建的主要途徑。

血管新生包括內(nèi)皮細(xì)胞激活、增殖及遷移等一系列過(guò)程，其中內(nèi)皮細(xì)胞遷移是血管新生的必要環(huán)節(jié)。VEGF 可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面相應(yīng)受體并激活相關(guān)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而促進(jìn)血管新生，但其配體及受體類(lèi)型較多，既往研究表明，血管生產(chǎn)效應(yīng)主要與兩個(gè)酪氨酸激酶結(jié)合有關(guān)，即VEGFR-1 和VEGFR-2［6］。盡管與VEGFR-1 相比，VEGFR-2 與VEGF 結(jié)合能力較弱，但VEGF/VEGFR-2 激活的細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)仍是VEGF信號(hào)通路的主要生物學(xué)效應(yīng)［8］，因此VEGFR-1 常被認(rèn)為是假受體［12］。

生地黃是祖國(guó)醫(yī)學(xué)中治療中風(fēng)的主要藥物之一，現(xiàn)代研究表明其主要有效成分梓醇具有一定神經(jīng)保護(hù)作用［11，13］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》明確記載，“生地味甘寒，主折跌絕筋、傷中、逐血痹?！陨哂攘??！钡笫啦怀Ｓ闷洹盎钛隆⒅鹧浴敝π?。正如近代醫(yī)家張山雷在《本草正義》中記載：“惟唐宋以降，破血逐瘀諸方，已無(wú)復(fù)采用及此者”，張山雷認(rèn)為：“地黃……，惟破血一層，似乎寒涼粘滯性質(zhì)必?zé)o破瘀導(dǎo)滯之功，誤認(rèn)為其膩滯物質(zhì)而遂疑古人之言”［14］。藥理學(xué)研究表明，生地黃炮制成熟地黃的過(guò)程主要為梓醇逐減及糖類(lèi)遞增，且梓醇隨著炮制、加熱程度加深而逐漸分解或丟失［15-16］。因此，筆者認(rèn)為生地黃具有活血生新功效，其中梓醇是體現(xiàn)其“活血生新”功效的有效成分［17］。

現(xiàn)代醫(yī)家認(rèn)為，“生新”包括“生新血”和“生新脈”兩方面，其中“生新脈”具有促血管新生、微循環(huán)重建等內(nèi)涵。本研究結(jié)果顯示，對(duì)照組HUVECs 的OD值低于實(shí)驗(yàn)組，且與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組HUVECs 相對(duì)增殖率為（1.871±0.152）%，提示地黃梓醇能有效提高HUVECs 增殖能力；以培養(yǎng)0 h 為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組HUVECs 培養(yǎng)12、24 h 遷移細(xì)胞數(shù)量多于對(duì)照組，提示地黃梓醇能有效提高HUVECs 遷移能力，進(jìn)而促進(jìn)血管新生。本研究結(jié)果還顯示，兩組HUVECs VEGFR-1 的mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但實(shí)驗(yàn)組HUVECs VEGF、VEGFR-2 的mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，提示地黃梓醇通過(guò)特異性上調(diào)VEGF 及VEGFR-2 表達(dá)而發(fā)揮促血管新生作用，這也從分子生物學(xué)層面闡示了地黃“活血生新”功效的內(nèi)涵：地黃梓醇通過(guò)調(diào)控VEGF 和VEGFR-2 靶向性結(jié)合而促進(jìn)血管新生。

綜上所述，地黃梓醇通過(guò)上調(diào)VEGF、VEGFR-2表達(dá)而促進(jìn)HUVECs 增殖、遷移，進(jìn)而發(fā)揮促血管新生作用，但VEGF 與VEGFR-2 結(jié)合后如何激活下游因子及受哪種上游因子調(diào)控尚未明確，仍有待課題組進(jìn)一步探究。

作者貢獻(xiàn)：周霞、張文倩進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；張文倩、劉炬、李麗進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；張文倩、劉炳男進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；周霞、張文倩、劉付紅負(fù)責(zé)撰寫(xiě)論文；周霞對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。