固定化細(xì)胞提高熱帶假絲酵母菌的噻吩耐受性及降解效率

傅悅，張雪晴，李飛，劉安，張朝正

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

汽車尾氣排放是空氣中PM2.5顆粒物的重要來源之一，而汽車尾氣中的SOx可引起尾氣處理系統(tǒng)的催化劑中毒，會(huì)進(jìn)一步加重尾氣中污染物的排放[1]。因此，脫除燃油中的含硫化合物是減少汽車尾氣污染物排放的重要途徑。汽油中含硫化合物的種類很多，主要有硫醇、硫醚、噻吩、甲基噻吩等。我國(guó)汽油中噻吩及其衍生物所含硫約占汽油中總硫含量的83%[2]，所以脫除噻吩是提高我國(guó)汽油品質(zhì)的關(guān)鍵，在我國(guó)汽油的脫硫研究中應(yīng)選取噻吩作為模式化合物。噻吩及其衍生物是石油中的主要含硫化合物，也是人們重點(diǎn)研究的含硫化合物[3-4]。噻吩環(huán)上硫原子的電子云密度由大到小依次為二苯并噻吩>苯并噻吩>二甲基噻吩>甲基噻吩>噻吩，電子云密度越小越不容易氧化，而噻吩是電子云密度最低的，也是最難于降解的[5]，所以噻吩的降解是實(shí)現(xiàn)油品深度脫硫的關(guān)鍵所在。微生物脫硫具有成本低廉、無二次污染的特點(diǎn)，已經(jīng)成為降解有機(jī)硫的主要手段[6-9]。

固定化技術(shù)是提高菌體濃度和減少細(xì)胞傷害的有效方法[10-12]。Li等[13-14]分離得到一株Mycobacterium goodie X7B，發(fā)現(xiàn)：利用固定化細(xì)胞技術(shù)，在24 h后，使模擬汽油中總硫從227 μg/g降到71 μg/g；在兩步連續(xù)反應(yīng)后，使汽油中總硫降到54 μg/g。Dinamarca等[15-16]把Rhodococcusrhodochrous固定在硅膠上，然后置于生物反應(yīng)器中循環(huán)操作,他們發(fā)現(xiàn)在大粒徑硅膠和較長(zhǎng)填充高度下，脫硫效率達(dá)到84%。這些研究表明，固定化技術(shù)可降低有機(jī)物對(duì)細(xì)胞的毒性，在增加細(xì)胞濃度的同時(shí)，也提高了細(xì)胞的活性。

在前期的研究中，本課題組利用自行開發(fā)的電場(chǎng)輔助篩選裝置[17]篩選得到了一株降解噻吩的熱帶假絲酵母菌，但是在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)噻吩的耐受度低[18]。本工作采取固定化細(xì)胞的方法，以解決噻吩對(duì)菌體的毒性問題。采用海藻酸鈉包埋的方法固定化菌體細(xì)胞，優(yōu)化了固定化的方法和條件。然后將固定化的細(xì)胞用于降解水相中的噻吩，考察了固定化熱帶假絲酵母菌降解噻吩的實(shí)驗(yàn)條件，為固定化熱帶假絲酵母菌用于汽油中噻吩的降解研究提供了技術(shù)支撐。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 菌 種

實(shí)驗(yàn)所用菌株為熱帶假絲酵母菌TCCC 30004，天津科技大學(xué)微生物菌種保藏管理中心保存。

1.2 主要試劑

無水氯化鈣，天津市化學(xué)試劑供銷公司；海藻酸鈉、無水葡萄糖，天津市福晨化學(xué)試劑廠；噻吩、蛋白胨、氯化鈉，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；酵母浸粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無水乙醇，天津市化學(xué)試劑一廠；色譜甲醇，天津市康科德公司；除色譜甲醇外其他試劑均為生化試劑或者分析純?cè)噭?/p>

1.3 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基：酵母粉1 g/100 mL、蛋白胨2 g/100 mL、無水葡萄糖2 g/100 mL，pH 7.0，121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min，接種前加入5 mL/100 mL噻吩-乙醇溶液(噻吩-乙醇溶液：1 mL噻吩溶于100 mL無水乙醇中)，噻吩終質(zhì)量濃度為500 mg/L。制備固體培養(yǎng)基時(shí)，需另加2%瓊脂。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞固定化

配置固定化載體溶液：將不同配比的海藻酸鈉和聚乙烯醇，加熱溶解至均一膠狀液體，靜置降至室溫，備用。

將保藏在斜面上的熱帶假絲酵母菌轉(zhuǎn)接到固體斜面培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)過夜，進(jìn)行活化；從活化的斜面培養(yǎng)基中挑一環(huán)酵母菌轉(zhuǎn)接入滅菌的YEPD液體培養(yǎng)基，置于180 r/min搖床中，30 ℃下培養(yǎng)12 h；將培養(yǎng)液中的菌液以5%的接種量轉(zhuǎn)接到100 mL新鮮的YEPD培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)12 h，得到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的熱帶假絲酵母菌細(xì)胞；取100 μL培養(yǎng)液菌落計(jì)數(shù)，剩余培養(yǎng)液在4 ℃，5 000 r/min條件下離心收集菌體。

將離心收集到的菌體用少量生理鹽水溶解，倒入10 mL包埋液溶液中攪拌均勻。用注射器吸取包埋液與菌體的混合液，逐滴滴入0.1 mol/L氯化鈣溶液中，室溫下鈣化2 h，置于4 ℃過夜，形成固定化細(xì)胞微球(每個(gè)微球約0.2 g)，置于生理鹽水中4 ℃冷藏備用。微球內(nèi)的菌落數(shù)以培養(yǎng)液的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算平均值約為5×1010個(gè)/g微球。

1.4.2 固定化微球性質(zhì)的表征

將微球從生理鹽水溶液中取出，用超純水洗滌微球3次，將洗凈的微球置于-80 ℃冰箱中冷凍5 h以上。然后將凍硬的微球置于冷凍干燥機(jī)中凍干。取凍干的微球，把其中的部分樣品切開，以便于觀察微球內(nèi)部狀態(tài)。樣品噴金后，使用掃描電鏡(FEI Apreo HIVac,Czech，捷克)觀察微球表面和內(nèi)部的菌體情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化細(xì)胞材料的確定

實(shí)驗(yàn)中選取向海藻酸鈉中添加聚乙烯醇作為固定化材料[19]。向海藻酸鈉中添加聚乙烯醇是為了增大固定化微球的孔隙，以便于微球內(nèi)菌體和外界環(huán)境中的物質(zhì)交換。但是在實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，向海藻酸鈉中添加聚乙烯醇會(huì)使固定液中產(chǎn)生很多氣泡，制備的微球孔隙較大，在固定化微球的過程中，細(xì)胞容易游離出微球，電鏡觀察時(shí)只觀察到少量細(xì)胞。而只有2%海藻酸鈉制備的微球表面和內(nèi)部均能看到大量的酵母細(xì)胞(圖1)，而且微球表面形成了一層緊密的薄膜，將細(xì)胞包裹在微球里，使細(xì)胞不能脫離(圖1a)。固定化微球的內(nèi)部結(jié)構(gòu)致密，菌體量也很豐富，固定化效率很高(圖1b)，證明固定化實(shí)驗(yàn)是成功的。固定化熱帶假絲酵母所具有的明顯優(yōu)勢(shì)是由于固定化材料保護(hù)菌體不受高濃度底物的毒害，且在溶液中具有較高的菌體密度。

圖1 固定化微球表面(a)和內(nèi)部(b)電子掃描電鏡照片

2.2 接種量的確定

把制好的微球用無菌水沖洗后，接種到初始pH=7.0含有噻吩的YEPD液體培養(yǎng)基中，選擇不同的接種量于30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)24 h，平行樣品3個(gè)，采用高效液相色譜檢測(cè)噻吩含量，計(jì)算噻吩的降解率[20]，結(jié)果見圖2。

圖2 不同接種量下噻吩的降解率

由圖2可知，較佳的接種量為7 g/100 mL。噻吩的降解率隨著接種量的增加呈先增大后平穩(wěn)的趨勢(shì)，當(dāng)接種量達(dá)到7 g/100 mL時(shí)，接種菌體密度達(dá)3.5×109/mL。接種量引起的降解率的變化是和菌體的量和培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞相關(guān)的，降解率會(huì)隨著培養(yǎng)液中菌體密度增加而增加，但是當(dāng)培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不能滿足大量的菌體的需求時(shí)，降解率趨于平衡。

2.3 培養(yǎng)基初始pH值的確定

配置不同初始pH值的培養(yǎng)基，滅菌后按照7 g/100 mL的接種量接入固定化微球，在30 ℃，120 r/min條件下，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)噻吩的降解情況，結(jié)果見圖3。

由圖3 可知，在當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值在8.5～9.0之間時(shí)噻吩的降解率最大。這主要是由于噻吩是酸性物質(zhì)在堿性條件下更容易成鹽，有利于傳導(dǎo)進(jìn)微球內(nèi)部，從而增加降解率。

圖3 不同初始pH值下的降解率

2.4 培養(yǎng)溫度的確定

培養(yǎng)溫度是菌株活性非常重要的因素，由于該菌株在游離狀態(tài)下的培養(yǎng)溫度在30 ℃時(shí)最佳[11]，因此在考察固定化后的培養(yǎng)溫度時(shí)選取了25、30、35 ℃進(jìn)行培養(yǎng)操作，考察在3個(gè)溫度下的固定化細(xì)胞對(duì)噻吩的降解率，結(jié)果見圖4。由圖4可知，固定化細(xì)胞后，熱帶假絲酵母菌的最適降解溫度并為改變，依然為30 ℃，也說明海藻酸鹽作為固定化載體對(duì)熱帶假絲酵母菌的培養(yǎng)溫度并無明顯影響。

圖4 溫度對(duì)降解率的影響

2.5 降解時(shí)間的確定

在確定的降解條件下，將固定化微球接種到培養(yǎng)基中，在30 ℃、120 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，取樣時(shí)間間隔4 h，分析在不同降解時(shí)間下固定化熱帶假絲酵母對(duì)噻吩的降解效率，確定最佳降解時(shí)間。

配置液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)初始pH值為8.5～9.0，在30 ℃、120 r/min條件下，搖床培養(yǎng)，分別在不同時(shí)間取樣，分析噻吩含量，設(shè)立平行實(shí)驗(yàn)3份，空白1份。由于取樣涉及到過夜，將實(shí)驗(yàn)分成兩個(gè)階段進(jìn)行,即0～16 h為第一階段，12～24 h為第二階段。降解率結(jié)果見圖5。由圖5可知，降解率隨著時(shí)間的增加一直在增加，當(dāng)16 h以后降解率增加變緩慢，16～24 h之間幾乎沒增加，因此選擇降解操作的時(shí)間為16 h，降解率達(dá)62.3%。降解效率高的主要原因是由于固定化細(xì)胞使相對(duì)細(xì)胞濃度增加，從而加快了噻吩的降解。

圖5 降解效率和降解時(shí)間之間的關(guān)系

3 結(jié) 論

a.熱帶假絲酵母菌可以包埋在2%海藻酸鈉中，且微球表面堅(jiān)韌緊密，菌體難以游離出微球。掃描電鏡照片顯示微球內(nèi)菌體含量豐富，包埋效果良好。將固定化微球接種到含噻吩的培養(yǎng)基中，微球內(nèi)部菌體可有效降解高濃度噻吩，解決了熱帶假絲酵母在高濃度噻吩條件下沒有降解活性的難題。

b.固定化細(xì)胞技術(shù)的應(yīng)用不僅提高了培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度，而且增加菌株的耐受性，提高了降解效率。噻吩初始濃度500 mg/L時(shí)降解效率依然不低于60%。前期研究中噻吩初始濃度2.2 mg/L時(shí)降解效率達(dá)到99.6%[20]，噻吩初始濃度為100 mg/L時(shí)降解效率達(dá)到66%[18]，但是當(dāng)初始噻吩濃度高于100 mg/L時(shí)降解效率均非常低。固定化細(xì)胞技術(shù)解決了細(xì)胞對(duì)有機(jī)物的耐受性低的問題，同時(shí)提高了菌體密度，為固定化技術(shù)在汽油脫硫中的進(jìn)一步應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。