不同療程電針對放射性腦損傷模型小鼠認(rèn)知功能及海馬神經(jīng)元凋亡的影響＊

王冬慧，武 鑫，孫寧寧，高劍峰

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450046；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 鄭州 450046）

近年來，隨著癌癥發(fā)病率的不斷增高，放射線治療成為了治療腫瘤的一個重要手段，但放射線治療所引起的腦部損傷已成為限制放療的重要因素[1-2]，臨床研究表明放射線照射可引起學(xué)習(xí)記憶與認(rèn)知功能受損，并且受損程度與照射劑量密切相關(guān)[3]，因此探討放射性腦損傷發(fā)病機(jī)制，以及電針干預(yù)對放射性腦損傷的防治具有重要意義。已有實驗發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)是對放射線照射最敏感的區(qū)域，X 射線照射可造成神經(jīng)元受損并引起腦退行性病變[4-5]。海馬區(qū)神經(jīng)元功能的損傷直接影響放射性腦損傷的程度和恢復(fù)過程。

有研究發(fā)現(xiàn)2.3Gy 的X 射線可損傷Long-Evans 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[6]，本課題組發(fā)現(xiàn)不同劑量的X 射線照射后可不同程度地引起實驗小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降，主要表現(xiàn)為在曠場實驗和Morris 水迷宮實驗中受照射小鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損，即8Gy 以上放射劑量即建立腦輻射損傷模型[7-8]。電針在頭頸部腫瘤放療后的輔助治療中有廣泛運(yùn)用，如對放射線治療后的口干、嘔吐等癥狀具有明顯改善效果[9-10]。電針對其他腦損傷的神經(jīng)元凋亡具有一定抑制作用，對于阿爾茨海默病，電針通過抑制Bax同時上調(diào)Bcl-2可抑制阿爾茨海默病小鼠神經(jīng)元凋亡，電針還可通過Notch3 信號通路抑制腦卒中小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡[7,11-12]。因此，本實驗采用電針干預(yù)“百會”、“風(fēng)府”及雙側(cè)“腎俞”穴，觀察不同療程電針對放射性腦損傷小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響，從神經(jīng)元凋亡的角度探討不同療程電針干預(yù)對放射線照射小鼠腦損傷的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1 月齡 SPF 級雄性 C57BL/6J 小鼠 50 只，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號為SCXK（京）2016-0006。將小鼠置于7:00-19:00 光照和19:00-7:00 黑暗的實驗室，水食不限，飼養(yǎng)環(huán)境溫度24℃，濕度為50%-60%。將小鼠隨機(jī)分為對照組、放射線照射組（8Gy）、電針組1（1 周）、電針組2（2 周）和電針組3（3 周），每組10 只。本實驗已通過河南中醫(yī)藥大學(xué)倫理審查，動物倫理審查批準(zhǔn)編號為：DWLL16020034。

1.2 主要儀器與試劑

無菌針灸針（0.30 mm ×13.00 mm，蘇州醫(yī)療用品廠）；直線加速器（Varian Clinac 600 CD，Radiation Oncology Systems，SanDiego，CA，USA）；圖像分析系統(tǒng)Image-Pro plus6.0（Media Cybemetics Inc.USA，型號41N5100-44800）；石蠟切片機(jī)（Leica，型號2235）；曝光檢測系統(tǒng)（Fujifilm，Tokyo，Japan）；兔抗AIF 單克隆抗體（ab32516，abcam，USA）；新物體識別（湖南百眾生物科技有限公司，型號BZ-XX117）；POD 凋亡試劑盒(11684817910，Roche)；兔 抗 caspase-3 多 克 隆 抗 體（TA312442，ORIGENE，USA）。

1.3 造模與干預(yù)方法

X 射線照射方法：具體方法參考文獻(xiàn)對放射線照射組、電針組1、電針組2、電針組3 進(jìn)行造模[7]。按照0.01 ml·g-1劑量給與實驗動物2%戊巴比妥鈉，將實驗動物麻醉，將小鼠俯臥置于放射平臺進(jìn)行X 線照射，照射劑量為8Gy，射線源距離腦99.5 cm。照射過程持續(xù)約10 min。造模結(jié)束后第二天進(jìn)行電針干預(yù)，使用小鼠固定器對各組小鼠進(jìn)行固定，對電針組小鼠按照《實驗針灸學(xué)》取穴方法進(jìn)行針刺[13]，回路1 取百會和風(fēng)府；回路2取雙側(cè)腎俞。用針灸針刺入1mm左右，連接電針儀設(shè)置參數(shù)[8]，電壓1.5 V，頻率10 Hz，波寬1 ms，針刺時間為30 min/次，每天1 次，依據(jù)分組連續(xù)針刺1周、2周和3周。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 新物體認(rèn)知實驗

對照組與放射線照射組于造模后第2天進(jìn)行新物體認(rèn)知實驗；電針組1（1周），電針組2（2周），電針組3（3周）分別于針刺7天、14天、21天進(jìn)行新物體認(rèn)知實驗，具體方法參考文獻(xiàn)[14-15]。第一天為適應(yīng)期：將小鼠放入測試箱（40×40×40 cm3）內(nèi)適應(yīng)3 min，使其適應(yīng)測試環(huán)境；第二天為訓(xùn)練期：將完全相同的物體A（OA）和物體B（OB）放入測試箱內(nèi)一側(cè)壁的左右兩端，然后將小鼠背朝物體放入場地內(nèi)同時保證小鼠與兩物體距離相等，使其自由探索物體3 min。結(jié)束立即將小鼠放回到原來的鼠籠內(nèi)。測試期：在訓(xùn)練期結(jié)束后90 min和24 h分別進(jìn)行測試。測試時將一個完全不同的物體C（OC）替代物體B，然后將小鼠按照同樣的方法剛?cè)霚y試箱內(nèi)，使其探索物體3 min。在訓(xùn)練期和測試期，分別記錄實驗對象對OA、OB 以及OC 的探索時間。將小鼠對OC 的探索時間記為TN；對OA 的探索時間記為TF，將認(rèn)知指數(shù)（RI，recognition index）RI =［TN/(TF+TN)×100%］作為衡量實驗對象的認(rèn)知能力的指標(biāo)。錄像記錄整個實驗過程。

1.4.2 細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的檢測

各組小鼠于新物體認(rèn)知實驗后取材，制備石蠟切片。采用3.5%水合氯醛，0.01 ml·g-1麻醉動物，打開胸腔暴露心臟，穿刺針刺入左心室后剪開右心耳，用PBS液30 ml 灌注約10 min 直至右心耳流出液體逐漸清亮后改用4%多聚甲醛灌注，牽拉動物四肢有僵硬感或尾巴翹起為灌注成功，斷頭并于冰床上取腦，經(jīng)4%多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，切片（厚約4μm）并貼附于載玻片上，65℃烤箱過夜干燥備用。

（1）TUNEL染色檢測DNA斷裂情況

石蠟切片脫蠟至水，3%蛋白酶K 消化組織，PBS清洗后加入TUNEL 檢測液后室溫下孵育60 min，PBS清洗后加入 POD 轉(zhuǎn)換劑 37℃下 20 min，PBS 清洗后DAB染色。TUNEL 陽性細(xì)胞核染成棕黃色，每張切片選5 個高倍視野觀察記錄，計算凋亡指數(shù)[AI=（陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%]，計算平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。

（2）免疫組化檢測caspase-3 和AIF 細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)

圖1 不同療程電針對各組小鼠新物體認(rèn)知功能的影響（，10只鼠/組）

梯度酒精、二甲苯脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)。山羊血清30 min 封閉非特異性抗原，滴加caspase-3（1∶50）和AIF（1∶50）一抗，PBS 液沖洗后，滴加相對應(yīng)二抗，室溫下孵育，顯色用DAB 顯色液及ABC Elite 試劑盒。樹膠封片并拍照留存，檢測海馬區(qū)免疫陽性細(xì)胞的平均光密度值MOD。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，新物體認(rèn)知實驗結(jié)果采用重復(fù)測量方差分析進(jìn)行處理，其它實驗結(jié)果采用單因素方差分析結(jié)合Tukey's兩兩比較進(jìn)行檢驗。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同療程電針對各組小鼠認(rèn)知功能的影響

本實驗采用新物體認(rèn)知檢測放射線照射對海馬區(qū)認(rèn)知功能的影響以及不同療程電針干預(yù)的作用。具體實驗流程見圖1A。實驗結(jié)果表明放射線照射可顯著損傷小鼠新物體認(rèn)知能力，其中在兩個測試點，與對照組比較，放射線照射組小鼠探索新物體OC 時間均顯著減少（P＜ 0.01，P＜ 0.001），而與放射線照射組比較，電針1、2 和3 組小鼠在90 min 時探索新物體時間均顯著增加（P ＜0.05，P ＜0.05，P＜ 0.01），同時在24 h 測試點時探索新物體時間均顯著增加（P＜0.01，P＜ 0.01，P＜ 0.05）；而在24 h 測試點，與對照組比較，放射線照射組小鼠的認(rèn)知指數(shù)明顯下降（P＜0.05），電針1、2 和3 組小鼠認(rèn)知指數(shù)均不同程度升高（P＜0.05，P＜ 0.01，P＜ 0.05）。

2.2 不同療程電針對各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響

海馬區(qū)被公認(rèn)為是參與調(diào)節(jié)認(rèn)知及學(xué)習(xí)記憶的中心核團(tuán)。因此，我們用TUNEL法檢測各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目，TUNEL 陽性細(xì)胞呈深棕色，并可見細(xì)胞核固縮，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，即凋亡細(xì)胞。實驗結(jié)果顯示與對照組比較，放射線照射組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)量顯著升高（P＜0.01），說明隨著放射線照射可誘導(dǎo)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡。而與放射線照射組比較，電針各組神經(jīng)元凋亡數(shù)量均有所減少，其中電針組2 和電針組3 具有顯著性差異（P＜ 0.01，P＜0.05）；不同電針組比較發(fā)現(xiàn)，與電針組1 比較，電針組2 表達(dá)明顯增加（P＜ 0.05）；電針組3 與電針組2 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果見圖2。

2.3 不同療程電針對各組小鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡因子表達(dá)的影響

2.3.1 各組小鼠海馬區(qū)caspase-3的表達(dá)

圖2 不同療程電針對各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響（TUNEL法，，10只鼠/組，SP染色400倍）

圖3 不同療程電針對各組小鼠海馬區(qū)caspase-3表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)法，，10只鼠/組，SP染色400倍）

各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元caspase-3 表達(dá)檢測結(jié)果顯示caspase-3 陽性細(xì)胞呈棕褐色，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。其中與對照組比較，放射線照射組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元caspase-3表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。而與放射線照射組比較，電針組2和電針組3小鼠海馬區(qū)caspase-3 表達(dá)顯著減少，并存在顯著性差異（P＜ 0.01，P＜0.05）；與電針組 1 比較，電針組 2 表達(dá)明顯增加（P＜0.001）；電針組3與電針組2比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果見圖3。

2.3.2 各組小鼠海馬區(qū)AIF的表達(dá)

各組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元AIF 表達(dá)檢測結(jié)果顯示AIF 蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞呈棕黃色，并且主要表達(dá)在細(xì)胞核內(nèi)。實驗結(jié)果表明與對照組比較，放射線照射組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元AIF 表達(dá)顯著增加（P＜0.001）；而與放射線照射組比較，電針各組小鼠海馬區(qū)AIF 表達(dá)顯著減少（P＜ 0.001，P＜ 0.01，P＜ 0.01）；不同電針組比較發(fā)現(xiàn)，與電針組1 比較，電針組2 和電針組3 表達(dá)顯著增加（P＜ 0.01，P＜ 0.01），電針組2 與電針組3 差異無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果見圖4。這一實驗結(jié)果與caspase-3表達(dá)結(jié)果具有一致性，說明放射線照射可誘導(dǎo)海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，而不同療程的電針干預(yù)具有一定的改善作用，其中電針2周和電針3周效果顯著。

圖4 不同療程電針對各組小鼠海馬區(qū)AIF表達(dá)的影響（免疫組織化學(xué)法，，10只鼠/組，SP染色400倍）

3 討論

學(xué)習(xí)記憶是大腦的一種高級神經(jīng)活動，海馬區(qū)被認(rèn)為與空間學(xué)習(xí)記憶、物體認(rèn)知和情感恐懼記憶密切相關(guān)[16,17]。此外研究發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)對放射線較為敏感[18]，因此有研究認(rèn)為海馬區(qū)是X 射線照射導(dǎo)致行為學(xué)改變的關(guān)鍵調(diào)節(jié)區(qū)域，海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡、突觸數(shù)目的下降、血腦屏障的損傷等可能與腦區(qū)放射線照射后的認(rèn)知及學(xué)習(xí)記憶功能改變有關(guān)[19-21]。本實驗前期行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)不同劑量X 射線照射可不同程度損傷小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能。在本實驗中我們利用新物體認(rèn)知實驗檢測不同療程電針干預(yù)對放射性腦損傷小鼠認(rèn)知功能的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針1 周、2 周和3周均顯著增加小鼠探索新物體時間，并且認(rèn)知指數(shù)較放射線照射小鼠顯著提高。上述實驗結(jié)果說明放射線照射損傷了海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知能力，而電針干預(yù)可顯著改善放射線照射所導(dǎo)致的認(rèn)知功能損傷。

細(xì)胞凋亡又被稱為細(xì)胞程序性死亡，參與調(diào)節(jié)分化及正常細(xì)胞的更新，并與多種疾病密切相關(guān)[22-24]。本實驗利用TUNEL 法檢測不同療程電針干預(yù)對放射線照射后小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響。實驗結(jié)果表明給予放射線照射可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，而電針2 周和3周顯著減少神經(jīng)元凋亡數(shù)量。這一實驗結(jié)果與前期行為學(xué)結(jié)果相符，說明放射線照射所引起的認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶功能下降與海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡所致的海馬區(qū)功能受損相關(guān)，而電針干預(yù)可通過抑制神經(jīng)元凋亡改善放射線所致的整體認(rèn)知行為損傷。caspase-3 被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡信號通路中的主要效應(yīng)因子之一，是細(xì)胞遭受到各種損傷后啟動凋亡信號通路的執(zhí)行蛋白，也是研究細(xì)胞凋亡的常用指標(biāo)[24]。caspase-3屬于半胱氨酸蛋白酶家族，直接參與并執(zhí)行細(xì)胞凋亡程序。因此本實驗將其作為檢測指標(biāo)，實驗結(jié)果表明給予放射線照射處理可誘導(dǎo)海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)活化caspase-3蛋白表達(dá)水平的增加，與對照組比較具有顯著性差異。這一實驗結(jié)果說明放射線照射可誘導(dǎo)caspase-3 信號通路介導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。而給予電針干預(yù)后，caspase-3 表達(dá)均有所下降，其中電針2 周和3周與放射線照射組比較具有顯著性差異，說明不同療程電針干預(yù)可不同程度的抑制caspase-3的表達(dá)，從而發(fā)揮抗放射線損傷的作用。此外，除了caspase-3參與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程外，線粒體也在其中起到了決定性的作用[25-26]。凋亡誘導(dǎo)因子AIF 是位于線粒體膜間隙的一類黃素蛋白，其不依賴于caspase-3 信號通路直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)AIF既具有細(xì)胞凋亡活性又具有氧化還原酶活性，細(xì)胞在受到凋亡的刺激后，AIF 會從線粒體易位到細(xì)胞核，并且與細(xì)胞核中的染色體結(jié)合使其發(fā)生凝集斷裂，同時也可破壞細(xì)胞骨架蛋白、核蛋白等，最終引起細(xì)胞凋亡[27-29]。而在本實驗中，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，給予放射線照射可導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)AIF的表達(dá)顯著增加。這一結(jié)果表明放射線照射不但可以通過caspase-3 通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時也可以誘導(dǎo)非caspase-3 途徑的AIF 釋放，從而促使神經(jīng)元凋亡增加、數(shù)目減少以及功能受損，最終導(dǎo)致了整體行為學(xué)的改變。而給予不同療程電針干預(yù)均顯著抑制放射線照射所誘導(dǎo)的AIF表達(dá)及神經(jīng)元凋亡。

綜上所述，不同療程電針干預(yù)可通過抑制caspase-3 和AIF 的表達(dá)，減少海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，從而從整體水平改善放射線照射小鼠的認(rèn)知及學(xué)習(xí)記憶功能，其中電針2 周及3 周作用效果較顯著。放射性腦損傷是神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤放療后出現(xiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明了[30]。本實驗研究結(jié)果提示放射線照射可通過caspase-3 和AIF 兩條途徑誘導(dǎo)小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡，致使神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)目以及功能均受到損傷，而給予不同療程的電針干預(yù)可不同程度的改善上述損傷作用，其中電針2周和電針3周作用最為顯著。因此，在今后的預(yù)防和治療放射性腦損傷時，抑制凋亡因子的釋放以及保護(hù)線粒體功能具有重要的臨床意義，為臨床合理采用電針防治放射性腦損傷提供了理論依據(jù)。