外泌體源性miRNA在卒中及卒中后抑郁中的治療作用及研究進展＊

林亮吟，李小黎，劉海鵬，陳弘婧，刁華瓊，丁海月，魏 丹

（北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院 北京 100029）

1 外泌體和外泌體源性miRNAs(microRNAs)

1.1 外泌體

外泌體是指細胞內的多囊泡體與細胞質膜融合后主動分泌到細胞外的一種小囊泡。外泌體直徑約為40-100 nm，呈均勻球形，存在于大多數生物液中，是細胞外最小的囊泡[1]。

外泌體由神經系統(tǒng)中幾乎所有細胞類型組成或依賴刺激釋放，包括神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞和小膠質細胞[2-3]。外泌體中存有各種核酸類物質，包括 mRNAs、miRNAs 和 ncRNAs。當外泌體在細胞間循環(huán)運輸時，這些外泌體RNA 可以被鄰近細胞或遠處細胞吸收利用，進而調節(jié)受體細胞。并且，外泌體能夠通過血腦屏障，將其內包含的物質信息傳遞到大腦中，這對外泌體源性miRNAs 治療神經精神疾病提供有力的基礎。

1.2 外泌體源性miRNAs

外泌體源性miRNAs 是一種存在于外泌體中，約17-24 個核苷酸（Nucleotide，nt）大小，非編碼的RNA。miRNAs 可以穩(wěn)定地存在于唾液、尿液、母乳、血液等多種體液中[4-6]，這些miRNAs通過與受體細胞作用，參與許多生物學活動，影響疾病的發(fā)生和發(fā)展。每個miRNA可以調控數百種不同的mRNAs，這表明約有一半的人類轉錄組受miRNAs 調控[7]，為miRNAs 調節(jié)人類基因表達提供有力的依據。

2 外泌體源性miRNA與腦卒中

2.1 腦卒中

2.1.1 腦卒中

腦卒中發(fā)病年齡大約在55-64歲之間。其中缺血性腦卒中占主體，約為87%左右[8]，隨著人類壽命的延長和人口老齡化的加快，我國發(fā)生缺血性腦卒中的比例越來越高，造成的危害日趨嚴重。腦卒中的治療主要以預防為主，找到更有效的治療方式成為現代腦血管病研究的重要方向。目前發(fā)現卒中與一氧化氮合酶基因、炎癥反應相關因子基因相關。最新研究表明，多個miRNAs 在腦卒中發(fā)生后表達水平均有改變[9]，提示外泌體源性miRNAs 可能在腦卒中的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。

2.1.2 外泌體源性miRNAs與缺血性腦卒中

缺血性腦卒中和其他類型的缺氧缺血再灌注損傷后的miRNA 表達在區(qū)域和時間上存在差異，利用這些差異對比，可以用于了解各樣miRNAs 水平的改變與卒中后不同階段的神經、血管系統(tǒng)的修復關系?，F已發(fā)現存在特定的miRNA 與卒中發(fā)病有關，如HsamiR-133a在卒中的病理生理學中起作用，它參與血管平滑肌細胞分化的調節(jié)，這可能與頸動脈斑塊有關[10]；miR-let-7 調控單核細胞TLR 信號通路，與神經樹突狀細胞分化相關[11]；miR-133b 可被轉移到鄰近的星形膠質細胞和神經元中調節(jié)基因的表達，有利于卒中后神經突的重建和功能恢復[12]；研究表明，缺血性腦卒中組血清miR-29 水平顯著降低，對缺血性腦卒中具有潛在的鑒別診斷價值[13]。通過研究外泌體源性miRNAs 與卒中發(fā)生發(fā)展的關系，對未來治療卒中提供新的方向。

（1）參與神經元重塑

首先，外泌體源性miRNAs 參與退化神經突的清除。當在缺血或缺氧環(huán)境下，誘導小膠質細胞miR-181c表達下調時，miR-181c可通過調控Toll-樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）及其下游核因子激活的B細胞κ-輕鏈增強蛋白質復合物（Nuclear factor-kgene binding，NF-kB）及炎性因子通路，使小膠質細胞去除退化的神經突，來調控神經元損傷[14]。有研究發(fā)現，miR-338 可以抑制負性調控神經元生長基因mRNAs的翻譯，當小膠質細胞與來自受刺激的神經母細胞瘤外泌體miR-338 預孵育時，神經突的清除速度加快，表明神經外泌體通過小膠質細胞的活化，起到清除神經突的作用，此作用有利于重組大腦中復雜的神經回路[15]。

其次，外泌體源性miRNAs 也參與調節(jié)神經細胞的生長。如miR-152 在中樞神經系統(tǒng)中表達，且自胚胎早期至出生后表達水平基本呈上升趨勢[16]。miR-21對缺氧缺血損傷的神經細胞有保護作用[17]。

最新研究表明，miR-9 和miR-124 可能是腦卒中后誘導神經發(fā)生的核心調控因子。miR-9、miR-124、核受體TLX、B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，BCL2）和組蛋白脫乙酰酶4基因（Histone deacetylase 4，HDAC4）之間相互作用，構成了腦缺血后神經再生的正反饋環(huán)路，從而參與神經重塑[18]。實驗表明，在眾多miRNAs 中，miR-124 在中樞神經系統(tǒng)中的表達最為豐富。在腦室區(qū)的神經祖細胞內，外泌體所含miR-124 的衰減會導致神經元分化減少，而表達升高則會促進神經元的生長[19]，并有神經保護的作用。另外，miR-17-92 可以通過抑制 PTEN 激活 PI3K 通 路 ,促進缺血半影區(qū)神經可塑性和神經功能的恢復[20]。如在卒中手術前2周天轉染含有miR-210的腺病毒表達載體可以促進局灶性腦缺血/再灌注大鼠損傷腦區(qū)的神經再生，改善神經功能[21]。

（2）參與神經血管生成

血管新生需要大量生長因子，如血管內皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor，FGF）。而外泌體能夠將所包含的miRNAs 遞送到腦內皮細胞中，促進內皮細胞遷移、增殖及血管生成。在腦缺血小鼠模型中，通過下調腦血管中miR-15a 的水平，可以提高FGF2 和VEGF 的表達，促進腦卒中周邊區(qū)域的血管生成[22]。除了腦內皮細胞外，循環(huán)內皮祖細胞也參與血管新生。循環(huán)內皮祖細胞分泌的外泌體可將促進血管生成有關的miR-126 和miR-296 轉移到受體內皮細胞中，促進血管生成[23]。研究表明，miR-126 的高表達可通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信號通路來提高內皮祖細胞血管形成的能力[24]。

另外，研究表明缺血性腦卒中后miR-124 在缺血半暗帶中的表達水平升高，外泌體中的miR-124 可促進神經血管生成[19]。

（3）參與神經炎癥反應

缺血性腦卒中后期繼發(fā)的免疫炎癥反應是造成腦損傷的重要原因之一。小膠質細胞是腦內介導炎癥和免疫的主要效應細胞，持續(xù)激活介導腦缺血慢性期的炎癥。激活的小膠質細胞有兩種類型，分別稱為經典激活的小膠質細胞和選擇性激活的小膠質細胞，一般認為，M1 型的小膠質細胞可釋放多種炎癥因子,對大腦神經功能恢復將產生有害作用；而M2 型的小膠質細胞被認為具有抗炎作用。因而調整小膠質細胞的激活狀態(tài)（分化類型）可以作為抗腦缺血損傷的治療靶點。

目前發(fā)現，miR-155 可直接參與巨噬細胞的炎癥反應，也可通過NF-κB 信號通路增強巨噬細胞促炎因子的表達。另外，miR-155 還可以通過靶向不同的炎癥介質,如細胞因子信號抑制物1（Suppressor of cytokine signaling1，SOCS1）、轉移生長因子β信號途徑轉導蛋白Smad2，起到促炎與抗炎的雙重作用[25]；miR-124 還具有重要的抗炎作用,在巨噬細胞內，miR-124可以通過減少信號傳導及轉錄激活因子3（Signal transducers and activators of transcription3，Stat3）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）促使抗炎；另外，miR-124-3p 可促進小膠質細胞向抗炎的M2 表型分化，有利于神經重塑[26]。在卒中手術前后經側腦室注射miR-210抑制劑則可以抑制炎癥反應和減輕腦損傷[27]。

3 外泌體源性miRNAs與卒中后抑郁

卒中后抑郁（Post-stroke depression，PSD）是卒中后的情緒障礙常見的并發(fā)癥，其因卒中造成的心境障礙，患者存在對事物喪失興趣、抑郁的情緒或其他伴隨的4個癥狀（睡眠障礙、身體不適、能力下降、悲觀無價值感），且這些癥狀持續(xù)多于2 周[28]。PSD 約占卒中患者的25%-40%[28]，在卒中發(fā)生后2 周內就有出現PSD 的報道。PSD 不僅影響患者的生存質量，也妨礙神經功能的恢復，并可能會加重腦卒中的發(fā)病率、殘疾率和死亡率。由于部分患者存在認知及言語障礙，所以PSD的發(fā)生不易察覺，但嚴重影響患者的預后。

PSD 的病理生理機制十分復雜，腦缺血引起的神經功能障礙和心理應激均參與其中。目前發(fā)現，PSD與單胺神經遞質的改變、下丘腦-垂體-腎上腺軸的異常、神經可塑性、神經炎癥和谷氨酸神經遞質等改變有關。

3.1 PSD的發(fā)病機制

目前廣泛認為PSD 與單胺類神經遞質水平的降低有關，由于腦部缺血阻斷了神經遞質從腦干向大腦皮質的運輸，導致了邊緣系統(tǒng)、額葉、顳葉、基底核區(qū)神經遞質利用率下降，破壞調節(jié)情緒的額葉-紋狀體-蒼白球-丘腦-皮質環(huán)路［29］，從而使得區(qū)域性5-羥色胺和去甲腎上腺素合成減少，誘發(fā)抑郁。

近年發(fā)現促炎/抗炎平衡的破壞與PSD 的發(fā)生有關。促炎因子可能通過上調吲哚胺2，3 雙加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase，IDO）編碼基因的表達（該基因的表達可以使色氨酸向犬尿酸代謝增加，從而減少5-羥色胺的合成）引起相關抑郁癥狀出現[30]。同時，促炎因子可刺激下丘腦-垂體-腎上腺皮質釋放皮質醇，皮質醇對中樞神經系統(tǒng)具有慢性損害作用，提示其與卒中患者病情惡化及死亡率升高有關。

神經元的再生與神經生長因子有關，其中重要的神經生長因子是腦源性神經營養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）。BDNF 是體內含量最多的神經營養(yǎng)因子，主要在中樞神經系統(tǒng)內表達，其中海馬和皮質的含量最高。目前已有實驗證實海馬神經元的萎縮及再生障礙與抑郁癥狀的產生密切相關，而抗抑郁藥物可增加海馬神經元再生[31]。另外，神經膠質細胞特別是星形膠質細胞的變性或功能障礙在抑郁的發(fā)病中也起著重要的作用，神經膠質細胞源性營養(yǎng)因子的主要功能是維護神經元和神經膠質細胞，保護其免受氧化應激的影響。

研究表明，外泌體源性miRNAs 參與到上述各個PSD 發(fā)病機制中，隨著miRNAs 在神經元中表達水平的改變，PSD 的神經遞質釋放、神經免疫炎癥反應、BDNF 含量等與PSD 相關的發(fā)病因素均發(fā)生了不同程度的改變，說明miRNAs 表達水平的改變對PSD 有重要意義。探討不同種類miRNAs 在PSD 中的作用，將更深入的在分子水平上發(fā)掘PSD的潛在機制。

3.2 外泌體源性miRNA在PSD中的作用

3.2.1 通過生物因子調節(jié)PSD

去甲腎上腺素能神經元和5-羥色胺能神經元的破壞可引起去甲腎上腺素和5-羥色胺減少，導致抑郁發(fā)生。miRNAs可通過上調5-羥色胺的信號轉導的作用調節(jié)PSD的發(fā)生發(fā)展。

此外，神經發(fā)生與PSD 中行為的恢復密切相關，海馬齒狀回中的新生細胞在卒中后顯著增加，助于改善PSD 患者的學習和記憶能力。卒中后神經元的新生，可能會轉移到受損部位并取代受損神經，從而改善卒中后的神經功能。大腦中存在豐富的miR-124，其可以調節(jié)信號傳導、促進胚胎干細胞分化為神經元，研究表明，大腦中的miR-12a 在卒中發(fā)生后顯著降低，將miR-124 引入到神經祖細胞當中，發(fā)現其抑制了神經組細胞的增殖，促進神經元的分化，并可調節(jié)5-羥色胺的釋放[32]。針對類似miR-124 對神經元的特定作用導致5-羥色胺的改變，miR-124 等其他miRNAs可能成為卒中后促進神經發(fā)生的重要因子。

3.2.2 通過炎癥因子調節(jié)PSD

卒中患者中，免疫介導的動脈粥樣硬化斑塊炎性侵潤被認為是動脈粥樣硬化的標志。同時，卒中通過啟動一系列的炎癥反應促進神經細胞死亡并誘導星形膠質細胞再生，促進受損神經的重塑。

炎癥細胞因子是PSD 發(fā)病機制中的重要因素。研究表明，特定miRNAs 可以作用于一些炎癥因子，通過激活這些因子從而激活5-羥色胺，增加其含量，這對于PSD 的治療有重要意義。在細菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激肥大細胞炎癥因子分泌過程中miRNAs 的表達差異研究中，發(fā)現miR-126、miR-155 在炎癥刺激前后存在差異性表達[33]。其中，miR-126 與血管內皮新生密切相關，能增強新生血管的生成，改善卒中腦缺血狀態(tài)來調節(jié)PSD[34]；miR-155能夠抑制血清白介素-4（Interleukin-4，IL-4）、白介素-5（Interleukin-5，IL-5）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-10（Interleukin-10，IL-10）的表達，促進海馬神經元再生，使得前額葉皮質神經可塑性功能得到恢復，從而抑制PSD的發(fā)展[35]。

通過研究卒中后神經炎性反應與外泌體中相關miRNAs 的關系，來調節(jié)大腦細胞間通訊，可能幫助延緩或降低PSD的發(fā)病幾率。

3.2.3 通過神經生長因子調節(jié)PSD

許多miRNAs 共同作用于BDNF 來影響PSD 的進展。同時BDNF也可以誘導部分miRNAs的合成，調節(jié)神經發(fā)生。BDNF 是腦內合成的一種蛋白質，與突觸及神經可塑性關系密切，研究證明BDNF 可調節(jié)突出結構、突觸連接和神經傳遞的數量，參與神經細胞的增殖和分化[36]。突觸中的miR-132通過調控GTP酶活化蛋白，增加對BDNF 的反應，從而調控神經發(fā)生，過度表達的miR-132可以增強突觸生長和軸突發(fā)生。

研究結果表明，卒中后抑郁患者血清BDNF 水平下降，miR-132 水平增加。當BDNF 水平較低時，能顯著上調神經元中的miR-132 表達，反之當抑制miR-132 時，可以提高BDNF 的轉錄水平[37]。表明miR-132與BDNF 間存在反饋作用。說明miRNAs 與BDNF 間的相互關系在PSD發(fā)病中起重要作用。

在PSD 的抑郁狀態(tài)患者中，神經膠質細胞源性營養(yǎng)因子及其mRNAs的表達水平均下降，且神經膠質細胞源性營養(yǎng)因子減少與PSD 的嚴重程度呈正相關［38］。其中，miR-124被發(fā)現通過與腦轉錄因子相結合，調節(jié)5-羥色胺依賴性突觸的可塑性，從而改善PSD 的抑郁狀態(tài)[32]。

3.2.4 其他方面

一些外泌體源性miRNAs，如miR-192、miR-219調節(jié)與晝夜節(jié)律相關的基因表達，這可能與PSD 的睡眠障礙和情緒障礙相關[39]。

研究表明，特定miRNAs 與應激性抑郁有關，其中包含miR-124，其增加可以下調糖皮質激素受體的表達，同時減少BDNF，可能對應激誘導的PSD 發(fā)揮作用。另外，miR-137 特異性結合于Grin2A mRNA 的3'非翻譯區(qū)，下調N-甲基-D-天氡氨酸離子能谷氨酸受體 2A（Recombinant Glutamate Receptor，Ionotropic，NMethyl-D-Aspartate 2A，Grin2A）蛋白表達，從而抑制與抑郁相關的N-甲基-D-天冬氨酸（N-MethylD-aspartic acid，NMDA）受體的過度激活，降低PSD 患者抑郁癥狀[40]。

就近幾年的研究結果來看，目前僅是發(fā)現了多種編碼的外泌體源性miRNAs 能通過調節(jié)體內因子的水平來影響卒中及卒中后抑郁的發(fā)展，對其調節(jié)過程的掌握及控制仍是一大難題。我們或許能通過發(fā)現特定miRNAs 在PSD 潛在人群中的表達異常，實現對PSD發(fā)生的及時預測，增強對PSD防治的實際意義。

3.3 PSD治療進展

3.3.1 藥物及非藥物治療

目前治療PSD 主要以抗抑郁藥物為主，分為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑、去甲腎上腺素再攝取抑制劑及特異性5-羥色胺能抗抑郁藥三類。此外，對于藥物依從性差、藥物應答不良和不宜藥物治療的患者常采用認知行為療法。

3.3.2 新的治療方向——外泌體源性miRNAs治療

在PSD 中，外泌體參與了神經可塑性及神經炎癥的過程，并且miRNAs 和mRNAs 的水平變化的異常表達可能影響神經重構及炎癥反應導致PSD 的加重?？紤]到近年來Notch 與JAK/STAT 信號串話及Notch 信號通路重塑小鼠神經的分子機制得到了進一步挖掘，加之對 miR-124、miR-126、miR-155 在神經元重塑、神經血管生成的方面也有較多研究，本文從外泌體源性miRNA 在卒中及卒中后抑郁的作用機制出發(fā)，為之后相關的臨床試驗提供理論依據，期望在不久的將來能出現針對這些miRNAs 作為PSD 的靶向基因標記的相關療法，這對PSD 及其他神經精神疾病的防治有重要意義。

4 中醫(yī)與外泌體源性miRNAs

中國傳統(tǒng)醫(yī)學治療方式，如中藥、針灸、艾灸等，被多次研究應用于PSD 治療，效果相較于對照組有明顯效果[41]。其中姜黃素外泌體已被發(fā)現可以使腦卒中大鼠的神經軸突重塑，并且其神經其功能也得到了改善；旋覆花內酯（Acetylbritannilactone，ABL）通過抑制miR-155 表達來下調 TNF-α和 IL-1β的水平，從而起到抑制炎癥反應的作用。旋覆花內酯通過抑制miR-155 介導的炎癥反應而發(fā)揮腦保護作用目的[19]；與抑郁癥發(fā)病相關的海馬內13 個特異性miRNAs 中，miR-125a 和miR-182 在中藥柴胡疏肝散干預后恢復正常,說明這兩個miRNAs 可能是中藥柴胡疏肝散抗抑郁的作用靶點[42]，其如何影響抗抑郁機制還有待進一步研究。

探討中醫(yī)治療對外泌體及內源性物質miRNAs、mRNAs、蛋白質的影響，對預防或延緩PSD 具有重要的臨床意義，對中醫(yī)藥的發(fā)展也具有重要的促進作用。