七氟烷暴露對發(fā)育大鼠海馬神經元可塑性的影響及機制*

宗川曰，李茂

(1.徐州醫(yī)科大學附屬淮安醫(yī)院麻醉科，淮安 223002；2.江蘇省淮安市婦幼保健院麻醉科，淮安 223002)

七氟烷是一種常用的揮發(fā)性麻醉藥，其麻醉作用可能是活化γ-氨基丁酸A型(gama-aminobutiric acid A，GABA-A)受體和(或)抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體，從而抑制突觸傳遞，并導致遺忘、意識不清和鎮(zhèn)痛相關的麻醉狀態(tài)[1]。GABA-A受體功能增強，也可以抑制神經元的可塑性并導致認知障礙[2]。研究發(fā)現(xiàn)，當發(fā)育中的大腦暴露于七氟烷時，可以導致實驗大鼠廣泛神經變性和神經認知功能障礙[3-4]。全身麻醉對兒童手術后的影響是醫(yī)療界關注的焦點[5-8]，尤其是神經細胞凋亡和神經損傷在介導學習記憶障礙中的作用[9]，推測突觸發(fā)育和神經元可塑性的缺陷是認知異常的基礎[10]。筆者在本研究以SD大鼠為動物模型，采用3%七氟烷對大鼠進行麻醉(濃度接近于臨床上嬰幼兒七氟烷麻醉劑量)，觀察大鼠海馬興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)、突觸融合蛋白、人突觸相關蛋白25(SNAP25)及突觸素α-突觸核蛋白及樹突棘密度等指標，探討七氟烷對發(fā)育中大腦神經元可塑性的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 無特定病原體(SPF)級20 d Sprague-Dawley雄性幼鼠60只，體質量(45±4.7) g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(滬)2018-0006。

1.2試藥 七氟醚(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號：16043031)；小鼠抗大鼠突觸融合蛋白單克隆抗體(批號：2018-AA4562)，小鼠抗大鼠SNAP-25單克隆抗體(批號：2018-AC8520)，小鼠抗大鼠突觸速單克隆抗體，小鼠抗大鼠α-突觸核蛋白單克隆抗體，均購自上海碧云天生物科技有限公司；Golgi-Cox染色試劑盒(上海起發(fā)實驗試劑有限公司，批號：502997)。

1.3儀器 標準Morris水迷宮(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)；TG22-WS臺式高速離心機(長沙湘銳離心機有限公司)；奧林巴斯DSX100光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；賽默飛桌面型透射電子顯微鏡(賽默飛公司)；新物體識別測試系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)。

1.4實驗分組 實驗大鼠出生后第7天使用隨機數(shù)字表法分為對照組、3%七氟烷1 h組(Sev 1 h組)和3%七氟烷6 h組(Sev 6 h組)，每組20只。將仔鼠麻醉[11]，置于用3.0%七氟烷、空氣通風的盒中，并以約1 L·min-1的流速處理，氣體采樣管線連續(xù)監(jiān)測麻醉箱內的氣體。密封箱內的溫度用加熱墊保持在(30±1)℃，大鼠6 h麻醉總存活率為100%；對照組接受空氣，無麻醉劑暴露。在體實驗在干預完成后第2天實施，在體實驗結束后取標本進一步檢測。

1.5大鼠學習記憶能力

1.5.1定位航行實驗測試學習能力 將大鼠置標準Morris水迷宮(MWM)實驗記錄大鼠逃避潛伏期，測試海馬依賴的空間認知[12]。每只大鼠每天進行4次試驗(間隔30～35 min)，連續(xù)5 d。每個實驗包括將鼠面向池壁放入水中，動物逃上平臺的時間(逃避潛伏期)試驗持續(xù)時間為60 s，所有實驗都進行錄像，用ANY-maze跟蹤系統(tǒng)記錄大鼠游泳路徑。

1.5.2空間探索實驗 實驗第6天時進行空間探索實驗，撤去平臺，大鼠面向池壁放入水中，記錄仔鼠在60 s內平臺象限游泳時間及經過平臺次數(shù)。

1.6仔鼠腦組織取材 認知功能實驗完成第2天，對各組仔鼠進行取材。經大鼠腹腔注射2%戊巴比妥(50 mg·kg-1)麻醉，取尾靜脈血后處死大鼠，夾閉腹主動脈、剪開右心耳，4 ℃，灌注大鼠4%多聚甲醛50～100 mL、速度先快后慢，共用30 min，至右心耳流出液體基本澄清；冰上分離腦組織，剝離雙側海馬，一側海馬浸入4%多聚甲醛溶液中，置4 ℃固定24 h后備切片；另一側海馬組織勻漿后離心20 min、轉速3000 r·min-1，收集上清液。

1.7突觸融合蛋白(syntaxin)、SNAP25及突觸素α-突觸核蛋白檢測 取海馬組織1 g進行勻漿，以4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并濕電轉移到硝酸纖維素膜5%脫脂牛奶封閉1 h，4 ℃下用抗突觸融合蛋白(1：200)、抗SNAP25(1：4 000)、抗突觸素(1：1 000)、抗-α-突觸核蛋白(1：1 000)及第一抗體孵育過夜，與相應的第二抗體在室溫孵育1 h，化學發(fā)光顯影，Gel-Pro分析儀吸光度量化[11-13]。

1.8高爾基染色檢測樹突棘密度 取海馬組織切片，用FD Rapid GolgiStainTMKit進行Golgi-Cox染色，用光學顯微鏡觀察[14-15]，從每個錐體神經元中隨機檢查10 μm頂端樹突5個，以量化樹突棘密度，計算每10 μm樹突長度的脊柱密度。

1.9透射電子顯微鏡觀察海馬突觸的超微結構 取海馬組織切片，用樹脂包埋，3%醋酸鈾酰染色20 min和0.5%檸檬酸鉛染色5 min。透射電子顯微鏡觀察海馬突觸的超微結構變化，使用圖像軟件Image Pro Plus 6分析[16-17]。

1.10海馬切片fEPSP 參照文獻[18]制備海馬組織切片[Leica VT 1200 S切片系統(tǒng)(厚400 μm)]，切片移到32 ℃的接口室，灌注充氧ACSF，細胞外記錄海馬CA1區(qū)fEPSP。將雙極涂覆搪瓷的鉑刺激電極置于Schaffer側支/連合纖維中，并在顯微鏡下將裝有ACSF的玻璃記錄電極置于CA1的錐形細胞中，收集1 min內fEPSP，用fEPSP最大初始斜率30%～50%的刺激強度刺激CA1區(qū)錐形細胞，記錄5 min內fEPSP，取平均值。對于區(qū)域CA1中長時程增強(long-term potentiation，LTP)誘導以5 min的間隔交付3個高頻刺激(high frequency stimulation，HFS)陣列(100 Hz，1 s)，長時程抑制(long-term drepression，LTD)誘導低頻刺激(low frequency stimulation，LFS，1 Hz，15 min)；在HFS或LFS后，記錄fEPSP幅度的變化，用Clampex 9.0和Clampfit 9.0(AXON、USA)記錄和分析數(shù)據(jù)。

1.11通過新物體識別任務測量相對時間的辨別指數(shù)(discrimination index，DI) 參照文獻[19-21]。在完成MWM測試后，在新物體識別測試中評估大鼠，評估背景是兩個相同大小，且獨立的領域(方底61 cm、墻高50 cm)，背景1有黃色的墻壁和一個覆蓋著木質效果的乙烯襯里的基地，而背景2則有黑色的墻壁和一個黑色的塑料基地，視覺線索被放置在每個環(huán)境中3個不同的墻上。在測試之前，受試動物先要習慣背景。對一個物體的調查被定義為嗅探或將鼻子放在1 cm的范圍內，動物適應實驗環(huán)境2 d，確定探索實踐后開始測試；先進行一次單獨的試驗，其中一半在背景1中測試，另一半在背景2中測試。每個試驗的測試階段都發(fā)生在相反的環(huán)境中，表示探索每個對象所花費的相對時間的DI=(新對象調查時間-熟悉對象調查時間)/調查總時間。

2 結果

2.1突觸蛋白表達 Sev 6 h組中syntaxin和SNAP-25表達較對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Sev 1 h 組syntaxin表達較對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；SNAP-25表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較，Sev 1 h組和Sev 6 h組突觸素、α-突觸核蛋白水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2樹突棘密度 在高爾基染色下檢測到全浸滲的CA1錐體細胞，在光學顯微鏡下用100倍油浸物鏡分析頂端樹突的棘突。本研究只確定樹突棘的密度，因為一些不同類型的棘并不總是清晰可見，如樹枝狀的細枝狀、蘑菇狀或分枝狀的樹突。對照組脊柱密度為(12.51±0.38)/10 μm，Sev 6 h 組和Sev 1 h 組分別為(9.81±0.21)/10 μm和(10.53±0.29)/10 μm，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3七氟烷誘導海馬突觸的超微結構改變 海馬突觸七氟烷暴露2周后，使用TEM檢查海馬的突觸超微結構。與對照組比較，Sev 6 h組突觸數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，突觸間隙明顯增寬(P<0.01)，見圖2和表1。另外，Sev 6 h組海馬突觸前端部分線粒體出現(xiàn)腫脹、皺縮、空泡化等病理改變。Sev 1 h組，突觸間隙的寬度與對照比較亦增加(P<0.01)，而突觸的數(shù)量保持不變。3組突觸后密度(PSD)和突觸曲率的厚度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4對LTP和LTD的影響 電生理結果顯示，對照組、Sev 1 h組和Sev 6 h組EPSP斜率基線比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，HFS后EPSP斜率明顯升高。Sev 6 h組EPSP斜率明顯低于對照組和Sev 1 h組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示Sev 6 h海馬DG區(qū)的LTP功能受損，見圖3，表2；相反，單次脈沖LFS誘導NMDA受體依賴性LTD在Sev 6 h組海馬切片中完整。在應用LFS之前，對照組、Sev 1 h組和Sev 6 h組EPSP斜率基線差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，連續(xù)15 min LFS，LTD在3組所有海馬腦片成功誘導。EPSP斜率下降，穩(wěn)定后對照組、Sev 1 h組和Sev 6 h組EPSP斜率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

圖2 3組大鼠海馬突觸超微結構(×10 000)

表1 3組大鼠海馬突觸界面的參數(shù)結果

組別突觸數(shù)目/[個·(mm2)-1]PSD厚度突觸間隙寬度nm突觸曲率/%對照組0.52±0.07145.73±4.1217.64±0.971.016±0.005Sev 1 h組0.43±0.03141.17±1.7120.33±048①1.015±0.003Sev 6 h組0.34±0.03243.78±2.0721.80±0.61①1.011±0.003

①與對照組比較，P<0.05。

①Compared with control group，P<0.05.

表2 3組LTP后EPSP斜率

組別基線EPSP斜率HFS后EPSP斜率穩(wěn)定后EPSP斜率對照組100.58±1.63201.41±12.50171.20±6.91Sev 1 h組102.13±1.01215.36±14.99181.24±12.59Sev 6 h組100.30±2.92171.58±14.55141.48±7.97

表3 3組LTD后EPSP斜率

組別基線EPSP斜率LFS后EPSP斜率穩(wěn)定后EPSP斜率對照組100.82±1.5964.36±3.8870.77±4.47Sev 1 h組100.44±2.0761.43±3.7573.74±3.10Sev 6 h組101.81±1.2862.77±4.5471.85±6.01

2.5大鼠的學習和記憶能力

2.5.1Morris水迷宮任務 Morris水迷宮測試數(shù)據(jù)顯示，七氟烷暴露大鼠1～3 d逃避潛伏期無顯著影響(P>0.05)。從第4天起，Sev 6 h組大鼠探測時間和逃避潛伏期較對照組延長(P<0.05)，見圖4A、B，平臺象限區(qū)(1.67±0.37)的入口數(shù)量少于Sev 1 h組(3.11±0.39)和對照組(3.12±0.45)(P=0.027)，見圖5C和D，提示新生大鼠暴露于3.0%七氟烷6 h后P60-65的空間學習和記憶能力受損。對照組和Sev 1 h組大鼠逃避潛伏期比較差異無統(tǒng)計學意義。

圖4 3組Morris水迷宮測試逃避潛伏期

Fig.4 Detection time in Morris test of three groups

2.5.2新物體識別任務 通過增加新物體的探查時間，對照組大鼠能夠區(qū)分熟悉的和新穎的物體，Sev 1 h組和Sev 6 h組大鼠對于熟悉的物體記憶回憶受損。新對象識別的對照組DI>0(P=0.004)，高于Sev 6 h組(P<0.05)，而Sev 1 h組與Sev 6 h組DI值之間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P= 0.876，0.121)，見圖5。

A，B.新物體；C，D.物體背景

圖5 3組大鼠新物體識別和辨別指數(shù)結果

A,B.novel object; C,D.object-contex

Fig.5 Result of the novel object and object-contex recognition and discrimination index in three groups of rats

3 討論

海馬錐體神經元的樹突棘一直被認為是突觸可塑性的形態(tài)基礎[22]。脊柱形狀和密度的改變是與多種人類神經疾病相關的認知功能改變的最一致的解剖相關性[23]。這種結構可塑性可以被吸入麻醉藥阻斷，這被認為與阻斷基于肌動蛋白的運動有關[24]。相反，BRINER等[25]發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥和靜脈麻醉藥急性增加P16大鼠內側前額葉皮質的樹突棘密度[26]。但在另一項研究中，YANG等[27]發(fā)現(xiàn)異氟醚對1個月齡小鼠皮層樹突棘的發(fā)育和可塑性無明顯影響。早期暴露于常用的全身麻醉藥誘導海馬超微結構顯著損傷[29-30]。透射電子顯微照片顯示，七氟烷暴露組的突觸超微結構受到負面影響，包括突觸數(shù)目減少、突觸間隙增寬等病理特征。以前的研究表明，七氟烷可以降低突觸后密度蛋白95的水平。然而，本研究沒有觀察到3組間PSD的厚度差異。這可能是因為PSD-95表達水平不能完全反映PSD的厚度。本研究發(fā)現(xiàn)突觸囊泡相關蛋白(SVAPs)的表達，涉及對接，融合和突觸小泡的再循環(huán)，以及神經遞質釋放(胞吐作用)。在這項研究中，表達的SNAP-25和syntaxin，蛋白質所需的膜融合和錨定在囊泡運輸膜，在Sev 6 h組與對照組相比顯著升高。這些蛋白質是SNARE(可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性融合蛋白質附著蛋白質受體)的兩個組分，其對于刺激突觸中的囊泡神經遞質釋放是強制性的。雖然適度升高，但它們的表達水平可能影響SNARE復合物形成的規(guī)則偶聯(lián)。突觸和α-突觸核蛋白在調控胞吐過程中發(fā)揮作用，在七氟烷暴露后沒有發(fā)現(xiàn)變化。本研究只測量所有SVAP中4個，因此七氟烷暴露后囊泡總數(shù)的變化是否仍然有待研究。筆者推測，突觸結合蛋白的相對水平存在不平衡，這可能與突觸破壞的形態(tài)學指標相平行。因此，記憶儲存和突觸傳遞的解剖基質的改變意味著長期受到干擾的突觸發(fā)育的可能性，其導致認知過程中的長期損害。麻醉后LTP抑制可能解釋術后認知功能障礙，因為LTP被廣泛認為是記憶鞏固和回憶的相關因素。有研究報道七氟烷可能會增加海馬的LTP，濃度范圍從亞臨床到臨床。本研究的電生理結果顯示3%七氟烷暴露6 h顯著抑制海馬切片制劑中的LTP。突觸可塑性通常伴隨著突觸的結構修飾，例如，LTP需要樹突棘的功能完整性。七氟烷引起P21突觸形態(tài)和結構發(fā)生的改變可能與LTP抑制P35-42有關，導致P60-75的學習和記憶障礙。在LTP沒有變化的情況下，Sev 1 h組樹突棘密度也有所減少，表明七氟烷引起的LTP損傷是由于突觸發(fā)育的多重而非單一作用所致。

新生兒在嚙齒動物和非人靈長類動物中接觸全身麻醉會產生持續(xù)到成年期的神經行為缺陷。最近的流行病學研究也表明，年幼兒童的麻醉藥物治療可能與晚年的神經認知障礙有關。鑒于過多的研究支持海馬突觸可塑性在記憶獲取和編碼中的作用，本研究測試新生大鼠七氟烷暴露是否會影響兩種不同形式的海馬依賴性學習和記憶。本研究僅在Schaffer側支CA1途徑中顯示LTP，與對照組和Sev 1 h組比較，Sev 6 h組能夠解釋空間學習和記憶障礙。由于早期神經發(fā)育的復雜性和全身麻醉藥的多效性，其不良行為表型可能由于劑量，時間和暴露時間的細微差異而產生。長時間的吸入性麻醉劑暴露導致樹突棘形態(tài)改變，突觸丟失[29]，空間參考記憶和空間工作記憶，且與短期相比有神經認知缺陷。本研究還觀察到七氟烷暴露持續(xù)時間對突觸可塑性和認知能力的影響，發(fā)現(xiàn)突觸結構和形態(tài)學改變顯示出類似的損傷，盡管Sev 6 h組中SNAP-25的表達與Sev 1 h組相比更高。然而，LTP是突觸可塑性替代物的損害僅限于Sev 6 h組的大鼠。因此，本研究發(fā)現(xiàn)在Morris水迷宮測試中，只有Sev 1 h組，而不是Sev 1 h組的空間記憶獲得受損。在新物體識別任務中，來自七氟烷處理組的大鼠均未能將新物體與熟悉的物體區(qū)分開來，這表明即使是單一的短暫麻醉經驗也會損害簡單的非空間任務表現(xiàn)。“閾值效應”的概念可以解釋暴露持續(xù)時間對突觸可塑性的功能差異，即兩個七氟烷組的成年期結構和形態(tài)學變化的相似性可歸因于部分突觸恢復與神經發(fā)育。

綜上所述，麻醉暴露持續(xù)時間可能對神經可塑性和神經認知表現(xiàn)有不同的影響。