基于肝臟微結(jié)構(gòu)的豬肝祛毒方法的建立和祛毒豬肝食品的初步研發(fā)

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(1 山東省數(shù)字醫(yī)學(xué)與計算機輔助手術(shù)重點實驗室，青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島 266003；2 山東省數(shù)字醫(yī)學(xué)臨床診療與營養(yǎng)健康協(xié)同創(chuàng)新中心；3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院小兒外科；4 青島大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)室；5 青島大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；6 青島大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科;7 青島萬福集團股份有限公司)

肝臟是機體儲存營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官。豬肝富含維生素A、蛋白質(zhì)及鐵、鋅、硒等礦物質(zhì)，是兒童、孕婦、老年人、貧血人群、呼吸道感染患者等特殊人群補充營養(yǎng)的必備食品[1]，可為提升人體免疫力提供重要物質(zhì)保障[2]，也常被營養(yǎng)學(xué)家推薦食用[3]。然而，肝臟也是機體重要的解毒器官，許多學(xué)者在肯定豬肝營養(yǎng)價值的同時，也表示了對豬肝殘留毒素的憂心[4-6]。營養(yǎng)學(xué)家建議豬肝在烹調(diào)前必須徹底清洗干凈[6-7]。

從肝臟正常代謝和肝臟微結(jié)構(gòu)形態(tài)來看，動物肝臟中內(nèi)毒素及病原菌的含量遠(yuǎn)比肌肉高[8-9]。肝臟“解毒”主要是依靠肝臟內(nèi)的枯否細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)和其他免疫細(xì)胞吞噬肝臟中的內(nèi)毒素和病原菌[10-11]，這些“吞噬”毒素的枯否細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞主要聚集在肝臟內(nèi)肝血竇中的血液中[12]，如不將肝血竇中的血液清除干凈，就無法實現(xiàn)豬肝最大程度“祛毒”。據(jù)文獻(xiàn)報道，豬肝祛毒常用的方法有整體浸泡法和切片清洗法[6]。雖然，上述方法有一定的祛毒作用，但肝臟離體后，部分血液會快速凝固在微小的肝血竇中，無法實現(xiàn)徹底清除，因此并不能最大程度地祛除毒素。

肝臟灌注是活體肝移植手術(shù)中較常用的肝臟保存方法[13-14]，然而能否利用肝臟灌注實現(xiàn)生鮮豬肝祛毒，目前尚未見相關(guān)報道。本研究利用肝臟灌注技術(shù)進(jìn)行豬肝祛毒，通過肝臟超微結(jié)構(gòu)三維重建圖像來評價祛毒效果，利用感官品質(zhì)評分方法評價灌注祛毒方法對豬肝性狀和口感的影響，最后利用祛毒豬肝初步開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 主要材料

新鮮豬肝由青島萬福集團股份有限公司提供。

1.2 儀器與試劑

灌注液為含有1 g/L檸檬酸鈉的生理鹽水；蘇木精-伊紅(HE)染色液(北京九州柏林生物有限公司)；自制流量可控灌注泵、灌注臺、灌注管和灌注頭各一套；全自動脫水機ASP300S(Leica，德國)；切片掃描顯微鏡(Nikon，日本)。

1.3 新鮮豬肝祛毒方法

所有豬肝灌注祛毒過程均在青島萬福集團股份有限公司豬屠宰產(chǎn)線旁進(jìn)行。豬肝在離體后1 min內(nèi)實施灌注處理。取表面被膜完整的生鮮豬肝平鋪于灌注臺上，立即將灌注液通過門靜脈和肝動脈血管灌注，直至肝靜脈流出的灌注液清澈、肝臟表面呈黃白色無花斑為止。灌注在亞低溫(20 ℃)條件下進(jìn)行，灌注流量設(shè)置為280 mL/s。豬肝灌注完成后，切除膽囊，置于4 ℃控水過夜待用[15]。傳統(tǒng)浸泡法祛毒豬肝按文獻(xiàn)方法制備[6]。

1.4 豬肝微結(jié)構(gòu)三維重建和祛毒效果評價方法

1.4.1豬肝微結(jié)構(gòu)圖像采集 取灌注清洗后距離肝臟表面0.5 cm的肝實質(zhì)，切成約1 cm3小塊，放置于4%多聚甲醛液中固定(過夜)，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，4m厚切片。在40 ℃溫水中展片、撈片后烘干，HE染色，常規(guī)脫水、透明、封片后晾干。最后用切片掃描顯微鏡收集圖像數(shù)據(jù)。

1.4.2豬肝微結(jié)構(gòu)三維重建 先將所有圖像利用基于B樣條的形變配準(zhǔn)方法進(jìn)行配準(zhǔn)。將配準(zhǔn)后圖片輸入VTK三維重建工具包進(jìn)行重建，重建后對圖像進(jìn)行著色和渲染，模型建立后保存。

1.4.3豬肝祛毒效果評價 利用豬肝微結(jié)構(gòu)二維顯微圖像和三維圖像，觀察豬肝肝細(xì)胞形態(tài)和豬肝肝小葉內(nèi)所有微血管、肝血竇等微結(jié)構(gòu)的潔凈程度，來判斷灌注祛毒方法的有效性。

1.5 祛毒豬肝食品加工制作方法

1.5.1鹵豬肝制備方法 取經(jīng)傳統(tǒng)浸泡法祛毒處理生鮮豬肝和經(jīng)灌注祛毒處理生鮮豬肝各2個，分別在兩個蒸汽夾層鍋中同時加料鹵制至全熟，撈出晾涼，去除大血管，用切片機將豬肝1 cm厚切片，將長寬均小于5 cm的豬肝小塊裝袋，每袋3～5片，高溫高壓殺菌備用。

1.5.2無淀粉豬肝火腿(簡稱豬肝火腿)和維也納豬肝香腸(簡稱豬肝香腸)制備方法 取豬肉和雞肉按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.65∶0.35制作豬肝火腿和豬肝香腸的配料，取經(jīng)灌注處理生鮮豬肝，制作3種不同豬肝含量的餡料作為3個實驗組，即豬肝和配料質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.15∶0.85(A組)、0.25∶0.75(B組)和0.35∶0.65(C組)來制作最終的灌裝用餡料。餡料加調(diào)味料斬拌后，進(jìn)行灌裝-蒸煮-封裝-滅菌處理。在研發(fā)初期，豬肝火腿和豬肝火腿及香腸灌裝餡料相同，豬肝火腿使用纖維素腸衣，每根350 g，豬肝香腸使用羊腸腸衣，每根50 g。

1.6 祛毒豬肝產(chǎn)品感官品質(zhì)評價方法

新冠肺炎疫情期間，豬肝火腿和豬肝香腸產(chǎn)品被送至武漢，為前線醫(yī)護人員提供一定的膳食營養(yǎng)保障，同時設(shè)計簡單問卷調(diào)查，對131名武漢新冠肺炎抗疫醫(yī)護人員和307名普通人群進(jìn)行了問卷，初步評判豬肝火腿和豬肝香腸產(chǎn)品的大眾接受度。產(chǎn)品問卷以微信小程序形式推送，所有問題為單選。具體評分內(nèi)容和標(biāo)準(zhǔn)見表1～3。

表1 鹵豬肝感官品質(zhì)評價標(biāo)準(zhǔn)

表2 豬肝火腿及香腸感官品質(zhì)評價標(biāo)準(zhǔn)

表3 祛毒豬肝產(chǎn)品接受度調(diào)查問卷

2 結(jié) 果

2.1 豬肝肝小葉微結(jié)構(gòu)三維重建結(jié)果

通過對灌注清洗豬肝肝小葉的三維圖像重建，觀察發(fā)現(xiàn)豬肝肝小葉的形態(tài)呈典型的多面棱柱狀(圖1A)，內(nèi)部微型管路清晰可見，被測豬肝肝小葉直徑約1.5 mm。肝小葉三維重建模型可以任意角度旋轉(zhuǎn)觀察肝細(xì)胞狀態(tài)以及微小血管管路、肝板、肝血竇等微結(jié)構(gòu)的情況(圖1B、C，視頻1)。

2.2 豬肝祛毒效果評價

與未處理豬肝(圖2A)相比，經(jīng)灌注祛毒后的豬肝呈黃白色(圖2B)，兩者有明顯差別。經(jīng)灌注祛毒后，豬肝質(zhì)量增加約0.5 kg，經(jīng)4 h控水后，豬肝質(zhì)量減輕至初始值。

經(jīng)豬肝組織切片觀察，浸泡祛毒的豬肝肝血竇內(nèi)仍然存在大量的血細(xì)胞和含有內(nèi)毒素的巨噬細(xì)胞等雜質(zhì)(圖3A)；豬肝經(jīng)過灌注祛毒后，肝竇內(nèi)部未見血細(xì)胞和其他雜質(zhì)(圖3B、C)，經(jīng)高倍顯微鏡圖像(圖3C)和三維重建圖像(圖3D)觀察豬肝細(xì)胞形態(tài)良好，高灌注壓和亞低溫灌注對豬肝細(xì)胞無影響，且灌注祛毒豬肝肝小葉內(nèi)部微血管等微結(jié)構(gòu)內(nèi)部也未見血細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等雜質(zhì)。

A：肝小葉三維立體圖；B：肝小葉表面局部放大圖；C：肝小葉血管局部放大圖像

A：未祛毒豬肝；B：灌注祛毒豬肝

2.3 豬肝灌注祛毒對豬肝性狀、口感等的影響

A組色澤、軟硬度、腥味以及苦味平均得分顯著低于B組(t=4.97～22.87，P<0.01)；B組的綜合評分顯著高于A組(t=25.89，P<0.01)。見表4。

2.4 豬肝火腿和豬肝香腸的感官品質(zhì)評價結(jié)果

A、B以及C組綜合評分分別為(73.47±1.67)、(77.33±2.63)、(56.60±2.63)分，3組比較差異有顯著性(F=46.35，P<0.01)；B組綜合評分與A組比較差異無顯著性(P>0.05)；A、B組綜合評分與C組比較差異有顯著性(P<0.01)。

A：10倍物鏡觀察下浸泡祛毒豬肝組織切片；B：10倍物鏡觀察下灌注祛毒豬肝組織切片；C：40倍物鏡觀察下灌注祛毒法豬肝組織切片；D：豬肝肝小葉血管內(nèi)壁細(xì)胞立體結(jié)構(gòu)
圖3 豬肝微結(jié)構(gòu)的二維和三維圖像

表4 兩種鹵制豬肝各項指標(biāo)以及綜合評分結(jié)果比較(n=30，分，

2.5 祛毒豬肝火腿和豬肝香腸產(chǎn)品初步調(diào)查問卷結(jié)果

對豬肝質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25的豬肝火腿和豬肝香腸產(chǎn)品進(jìn)行了問卷，97%醫(yī)護人員和普通人群認(rèn)為兩款豬肝產(chǎn)品口感好；61%的人認(rèn)為豬肝香腸口感更好；67%的人認(rèn)為可以嘗到豬肝的香味；83%的人認(rèn)為兩款豬肝產(chǎn)品沒有腥味，16%的人認(rèn)為兩款豬肝產(chǎn)品有一點腥味，1%的人認(rèn)為兩款豬肝產(chǎn)品腥味大；91%的人認(rèn)為兩款豬肝產(chǎn)品沒有苦味，9%的人認(rèn)為有一點苦味。

3 討 論

本研究通過對豬肝超微結(jié)構(gòu)二維和三維重建圖像觀察，證明豬肝灌注清洗方法可以有效地清除肝血竇內(nèi)的血液，從而有效地祛除肝竇血液內(nèi)含有毒素的枯否細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞。不同于傳統(tǒng)肝臟三維重建方法[16-17]，本研究采用的微結(jié)構(gòu)三維重建算法能夠立體、多角度展現(xiàn)肝臟微小結(jié)構(gòu)，從而可以直觀地評價豬肝祛毒效果。

與臨床中器官移植肝臟灌注方法[14]相比，本研究對生鮮豬肝灌注的目的是在不破壞肝細(xì)胞形態(tài)的前提下祛除肝臟內(nèi)毒素，不考慮肝細(xì)胞的活性及各類酶的水平，因此選用的灌注液成分較為簡單。另外，本研究中使用的灌注流量是臨床肝臟灌注流量的28倍[18]，高流量沖洗能夠快速清除豬肝細(xì)胞間隙內(nèi)殘存的血液等雜質(zhì)，組織學(xué)分析結(jié)果證實高流量灌注沒有破壞豬肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，這為祛毒豬肝批量生產(chǎn)提供了充分的實驗依據(jù)。

豬肝富含維生素A。研究表明維生素A對保護和修復(fù)呼吸道黏膜組織具有非常重要的作用[19]。當(dāng)體內(nèi)維生素A水平下降時，鼻、咽、喉和其他呼吸道黏膜角質(zhì)化，導(dǎo)致機體易被細(xì)菌侵襲和感染，特別是嬰幼兒，可由此引發(fā)支氣管肺炎，嚴(yán)重者會導(dǎo)致呼吸衰竭死亡[20-21]。另外，豬肝內(nèi)還含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、B族維生素及鐵、鋅、硒等營養(yǎng)元素，對提高人體免疫力也有非常重要的作用[2]。新冠肺炎疫情期間，在膳食中適當(dāng)增加豬肝的攝入，對抗擊疫情具有一定的輔助作用。本研究制作的豬肝質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25的豬肝火腿和豬肝香腸被送往武漢，為醫(yī)護人員補充膳食營養(yǎng)，得到醫(yī)護人員的一致好評。

本研究感官評價結(jié)果表明，經(jīng)灌注祛毒的豬肝色澤和口感都有極為顯著的改善，為豬肝食品的研發(fā)奠定了實驗基礎(chǔ)。問卷調(diào)查顯示，醫(yī)護人員與普通人群對兩款祛毒豬肝產(chǎn)品評價良好，從數(shù)據(jù)來看兩款豬肝產(chǎn)品不論口味還是產(chǎn)品形式，都得到被調(diào)查人員一定程度的認(rèn)可，這為祛毒豬肝產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化奠定了實驗基礎(chǔ)。本文采用的生鮮動物肝臟祛毒技術(shù)，以及基于祛毒動物肝臟的食品加工方法、嬰幼兒輔食食品加工方法以及老年人保健食品加工方法等內(nèi)容已獲得4項中國及2項國際專利保護[15,22-26]，這對產(chǎn)品擴展研發(fā)和向國內(nèi)外市場轉(zhuǎn)化都有非常重要的意義。本研究是祛毒豬肝技術(shù)和相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)的初步實驗研究，今后將重點對祛毒豬肝含有營養(yǎng)素的情況，以及基于祛毒豬肝的嬰幼兒輔食、老年人干粉等產(chǎn)品展開深入的研究。

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視頻1 豬肝肝小葉微結(jié)構(gòu)三維重建視頻