土壤支撐培養(yǎng)下的‘玫瑰香’葡萄組培快繁

王雪彤，柴慈江，郭靜，朱霖，賀祥素

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384）

‘玫瑰香’是我國葡萄主栽品種，因其獨特的風(fēng)味和多重用途而深受消費者喜愛。天津濱海地區(qū)是‘玫瑰香’葡萄的主栽地區(qū)之一，以“茶淀牌”命名的‘玫瑰香’葡萄，以其優(yōu)良的品質(zhì)，在我國乃至國際市場上占有一席之地[1]。但是在‘玫瑰香’葡萄的長期栽培中，出現(xiàn)了嚴(yán)重的品種退化現(xiàn)象，這導(dǎo)致了大多數(shù)果品質(zhì)量達不到標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)重影響了果農(nóng)的經(jīng)濟效益，所以‘玫瑰香’葡萄的提純復(fù)壯是一項重要的任務(wù)[2]。而‘玫瑰香’優(yōu)選單株快速推廣的關(guān)鍵在于提高其苗木的繁育速度，其中組織培養(yǎng)快繁技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢。

目前，國內(nèi)關(guān)于葡萄組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)的研究已有許多報道，如齊向麗等研究了‘紅國王’葡萄組培快繁體系的建立[3]，韓旭等對美國‘紅地球’葡萄無毒苗快繁技術(shù)進行了研究[4]，徐美隆等對釀酒葡萄‘赤霞珠’組培快繁技術(shù)進行了優(yōu)化[5]，蔡文博等報道了‘玫瑰香’等葡萄的組培快繁[6]。迄今為止，國內(nèi)已經(jīng)對至少50個不同葡萄的基因型進行了組培快繁技術(shù)的研究，其中包括不同的種、品種和品系。葡萄組培快繁技術(shù)也已經(jīng)比較成熟。但是，成本過高歷來是限制葡萄組培快繁技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)的主要因素之一。柴慈江等以土壤做培養(yǎng)基支撐物培養(yǎng)選拔巨峰葡萄試管苗，并將試管苗帶坨移栽，簡化了移栽程序并降低了試管苗的成本[7]。對‘玫瑰香’葡萄試管苗的土壤支撐培養(yǎng)目前未見報道，為此開展本項研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自‘玫瑰香’葡萄（Vitis vinifera‘Muscat Hamburg’）成年結(jié)果樹，該葡萄樹種植于天津農(nóng)學(xué)院試驗園內(nèi)。生根培養(yǎng)用土取自本校地被植物園的黏壤土，經(jīng)雨水淋洗、風(fēng)干后過1 mm篩備用。生根培養(yǎng)所用蛭石購自花卉市場，同樣過1 mm篩備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 ‘玫瑰香’葡萄莖段滅菌培養(yǎng)研究

不同次氯酸鈉滅菌時間的研究：6月27日取‘玫瑰香’當(dāng)年生新梢，去葉片后剪成單節(jié)莖段，用洗衣粉清洗和自來水沖洗后在 70%酒精中浸泡20 s，再在2%次氯酸鈉中浸泡10、15、20 min，無菌水沖洗5次后接種于培養(yǎng)基中。每處理接種22個莖段。培養(yǎng)基為附加IBA 0.2 mg/L的GS培養(yǎng)基。在培養(yǎng)室培養(yǎng)1周后調(diào)查莖段的污染率、褐化率及萌芽率等指標(biāo)。

不同取材時期的研究：9月27日再取玫瑰香當(dāng)年生新梢，所取新梢已半木質(zhì)化，顏色仍為綠色。去葉片并剪成單節(jié)莖段，洗衣粉清洗和自來水沖洗后，用70%酒精浸泡20 s，在2%次氯酸鈉中浸泡10、15 min，無菌水沖洗5次后接種，每處理接種24個莖段。所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)時間及調(diào)查指標(biāo)均與6月27日取材的相同，并與之比較。

上述兩項研究中培養(yǎng)室的培養(yǎng)條件為溫度24～27℃，光照強度1 500～2 000 lx，每天光照14 h。

1.2.2 ‘玫瑰香’葡萄試管苗增殖培養(yǎng)研究

在GS培養(yǎng)基中分別添加0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L的IBA，并添加1 g/L的活性炭和7 g/L的瓊脂，分裝于100 mL的三角瓶中，121 ℃下滅菌20 min，每瓶接種4個‘玫瑰香’葡萄試管苗單節(jié)莖段，每個處理接種5瓶。在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同試驗1.2.1。培養(yǎng)30 d后調(diào)查試管苗的莖長、繁殖系數(shù)及生根率等指標(biāo)。

1.2.3 ‘玫瑰香’葡萄試管苗土壤支撐生根培養(yǎng)研究

該項研究設(shè)以下3個處理：

土壤支撐培養(yǎng)Ⅰ：將黏壤土與蛭石按照1∶2的體積比混合，將100 mL混合物加入到方形PC培養(yǎng)瓶，再加入成分為15 g/L蔗糖和0.2 mg/L IBA的培養(yǎng)液60 mL，培養(yǎng)液pH為6.5，121℃下滅菌20 min，然后接種‘玫瑰香’葡萄試管苗單節(jié)莖段，每瓶接種8個莖段，接種4瓶。

土壤支撐培養(yǎng)Ⅱ：培養(yǎng)基配制及滅菌方法同土壤支撐培養(yǎng)Ⅰ，培養(yǎng)基滅菌后接種‘玫瑰香’葡萄試管苗雙節(jié)莖段，接種莖段數(shù)量同土壤支撐培養(yǎng)Ⅰ。

瓊脂支撐培養(yǎng)（對照）：在含有0.2 mg/L IBA的GS培養(yǎng)基中加入7 g/L瓊脂做培養(yǎng)基支撐物，并添加1 g/L活性炭，121℃下滅菌20 min，滅菌后接種‘玫瑰香’葡萄試管苗單節(jié)莖段，每瓶接種4個莖段，接種8瓶。

以上各處理接種后均在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同試驗1.2.1。培養(yǎng)40 d后對試管苗的生根率、根長、根數(shù)、莖長、葉數(shù)等生根與生長指標(biāo)進行調(diào)查。

1.2.4 ‘玫瑰香’葡萄試管苗移栽試驗

以黏壤土與蛭石體積比為1∶1的混合物作為移栽基質(zhì)，對2種不同移栽方法進行比較。

帶坨移栽：采用土壤支撐培養(yǎng)Ⅱ方法的試管苗，先將營養(yǎng)缽內(nèi)加入約1/2的移栽基質(zhì)，使用提苗片將試管苗提起后，帶坨移入營養(yǎng)缽中，移栽后用土將土坨四周填滿，再澆透水至營養(yǎng)缽底部有水流出。

常規(guī)移栽：采用瓊脂支撐生根培養(yǎng)的試管苗，先將根上瓊脂洗凈，然后將試管苗裸根移入營養(yǎng)缽中。然后填土并澆透水。

移栽后用塑料薄膜保濕，放在向陽的房間內(nèi)，移栽3周后調(diào)查試管苗成活率。

上述各項試驗，對調(diào)查的生根率、成活率等百分?jǐn)?shù)指標(biāo)均按照卡平方法進行獨立性測驗，對其他各項指標(biāo)均按照完全隨機試驗單向分組資料的方法進行方差分析，用鄧肯氏新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時間與‘玫瑰香’莖段的滅菌效果

不同次氯酸鈉浸泡時間對‘玫瑰香’莖段滅菌培養(yǎng)的效果如表1所示。

表1 次氯酸鈉浸泡時間對‘玫瑰香’莖段的滅菌效果

從表1可見，從污染率來看，次氯酸鈉浸泡10、15、20 min 3個處理之間無顯著差異，污染率在20%左右，滅菌效果較好。但是3個浸泡時間處理的莖段都出現(xiàn)不同程度的褐化現(xiàn)象，其中浸泡20 min處理的褐化率高達81.8%，顯著高于10、15 min處理，10、15 min處理之間的褐化率差異不顯著。與褐化率相反，10、15 min處理萌芽率較高，且這兩個處理之間差異不顯著，但均顯著高于20 min處理。上述結(jié)果表明，用2%次氯酸鈉浸泡10、15 min可以獲得較好的滅菌效果，且褐化率較低、萌芽率較高，而浸泡20 min時對葡萄莖段傷害較大，導(dǎo)致萌芽率顯著降低。因此，對于6月下旬采集的‘玫瑰香’葡萄當(dāng)年生新梢莖段，用2%次氯酸鈉浸泡10～15 min為宜。

次氯酸鈉浸泡不同時間后‘玫瑰香’葡萄莖段的生長狀況見圖1。

圖1 次氯酸鈉浸泡時間對‘玫瑰香’莖段滅菌培養(yǎng)的影響

2.2 取材和時間與‘玫瑰香’莖段的滅菌效果

表2為不同取材時間對‘玫瑰香’莖段滅菌培養(yǎng)的效果。

由表2可見，無論是次氯酸鈉浸泡10 min，還是浸泡15 min，9月取材的莖段的污染率均顯著高于6月取材的，而且污染率高達91.6～95.8%，其原因可能是莖段的帶菌量過高的緣故。此外，9月取材的莖段無褐化現(xiàn)象，顯著低于6月取材的莖段，可能與 9月的莖段比較成熟有關(guān)，但是 9月取材的莖段萌芽率為0，顯著低于6月，可能與9月的芽已將進入休眠期有關(guān)。

表2 不同取材時間對‘玫瑰香’莖段滅菌培養(yǎng)的影響

綜合上述，9月27日取材的莖段，污染率過高且不能萌芽，因此，不適合用于組培快繁。而應(yīng)在6月取材。

2.3 不同濃度IBA對‘玫瑰香’葡萄試管苗的增殖和生長的影響

表3為不同濃度IBA對‘玫瑰香’葡萄試管苗增殖培養(yǎng)的效果。

表3 IBA濃度對‘玫瑰香’葡萄試管苗增殖的影響

由表3可見，不同IBA濃度處理的‘玫瑰香’葡萄試管苗的生根率、莖長和繁殖系數(shù)等各項指標(biāo)均無顯著差異。這一結(jié)果表明，添加IBA對‘玫瑰香’葡萄試管苗的增殖沒有明顯的促進作用。在不含IBA的培養(yǎng)基中，試管苗的生根率仍然可以達到 90%，這可能與‘玫瑰香’葡萄枝條容易生根有關(guān)。在不含IBA的培養(yǎng)基中，試管苗的繁殖系數(shù)達到3.6，可以滿足快速繁殖的要求。因此，為了降低成本，在‘玫瑰香’試管苗增殖培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中可不添加激素。

圖2為不同IBA處理的‘玫瑰香’葡萄試管苗生長狀況。

圖2 不同IBA濃度對‘玫瑰香’葡萄試管苗增殖培養(yǎng)的影響

2.4 土壤支撐物培養(yǎng)下的‘玫瑰香’葡萄試管苗的生長特性

表4為‘玫瑰香’葡萄試管苗生根培養(yǎng)試驗結(jié)果。

表4 ‘玫瑰香’葡萄試管苗土壤支撐生根培養(yǎng)效果

由表4可見，土壤支撐生根培養(yǎng)中，接種單節(jié)莖段時的生根率、根長、莖長、葉數(shù)等各項指標(biāo)都顯著低于瓊脂培養(yǎng)基中的試管苗。表明土壤支撐物對‘玫瑰香’葡萄試管苗的生根及生長具有明顯的抑制作用。但是，土壤支撐培養(yǎng)接種雙節(jié)莖段時，生根率達到84.4%，根長為31.9 mm，這些指標(biāo)都與瓊脂培養(yǎng)基無顯著差異，都顯著高于單節(jié)莖段處理，這說明在土壤支撐培養(yǎng)條件下，接種雙節(jié)莖段明顯促進了根系的發(fā)生與生長，并且達到了瓊脂培養(yǎng)基中試管苗生長的水平，但是接種雙節(jié)莖段試管苗的莖長和葉數(shù)仍然顯著低于瓊脂培養(yǎng)基，表明土壤對地上部的生長仍然有明顯的抑制作用。

通過對根系表面的觀察發(fā)現(xiàn)，兩個土壤支撐處理的試管苗的根系都具有根毛，而瓊脂支撐培養(yǎng)的試管苗無根毛，由于根毛可以明顯增加根系的吸收面積，增強根系的吸收能力，從這個角度看，土壤支撐培養(yǎng)的試管苗的根系結(jié)構(gòu)優(yōu)于瓊脂支撐培養(yǎng)。

綜合上述，土壤做培養(yǎng)基接種雙節(jié)莖段處理，雖然莖和葉片的生長還達不到瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的水平，但是生根率、根長及根數(shù)等指標(biāo)已經(jīng)達到了瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)的水平，而且根系具有根毛，根系結(jié)構(gòu)優(yōu)于對照。所以，在‘玫瑰香’葡萄試管苗的生根培養(yǎng)中，在接種雙節(jié)莖段的情況下，可以用土壤替代瓊脂做培養(yǎng)基支撐物，即可以獲得理想的培養(yǎng)效果，又可以節(jié)省成本。圖3為不同支撐物處理的‘玫瑰香’葡萄試管苗生根狀況。圖4為‘玫瑰香’葡萄試管苗根毛發(fā)生狀況。

圖3 ‘玫瑰香’葡萄土壤支撐生根培養(yǎng)效果

圖4 ‘玫瑰香’葡萄試管苗根毛發(fā)生狀況

2.5 ‘玫瑰香’葡萄試管苗帶坨移栽的效果

表5為‘玫瑰香’葡萄試管苗移栽試驗結(jié)果。

表5 移栽方法對‘玫瑰香’葡萄試管苗成活的影響

由表5可見，試管苗帶土坨移栽的成活率為75%，常規(guī)移栽試管苗的成活率為25%，2種移栽方法之間的成活率存在顯著差異。其原因可能與帶坨移栽后試管苗根際環(huán)境變化較小，根系吸收能力較強有關(guān)，也可能與土壤支撐培養(yǎng)的試管苗具有根毛，吸收面積較大有關(guān)。對此尚待進一步研究。

圖5為從培養(yǎng)瓶移出的帶土坨‘玫瑰香’葡萄試管苗。圖6為移栽成活的‘玫瑰香’葡萄試管苗。

圖5 從培養(yǎng)瓶移出的帶土坨‘玫瑰香’葡萄試管苗

圖6 移栽成活的‘玫瑰香’葡萄試管苗生長狀況

3 討論與結(jié)論

木本植物試管苗的增殖方式常見的有兩種，即促進腋芽分枝形成叢生枝和單節(jié)扦插形成單軸延長的莖。對于葡萄試管苗的增殖方式，一些研究中采用了形成叢生芽的方式[8-9]，另一些研究則采用了單節(jié)扦插單軸延長的方式[3-4，10-11]。在同一種增殖方式中，針對不同的葡萄種類、品種或品系所得出的最佳培養(yǎng)基和最佳激素種類和濃度不盡相同。例如，同樣采用單節(jié)扦插單軸延長增殖方式，齊向麗等研究認(rèn)為在 B5培養(yǎng)基中添加 0.5 mg/L IAA最適合‘紅國王’葡萄試管苗的增殖[3]，戴彩虹等研究認(rèn)為附加0.1 mg/L NAA的GS培養(yǎng)基最適合山葡萄試管苗的增殖[11]，沈傳進等研究認(rèn)為附加0.2 mg/L IBA的改良B5培養(yǎng)基對無核白和早熟紅無核葡萄試管苗的增殖最為有利[10]。造成這種不一致的原因，可能是不同的葡萄基因型之間在生理及生長方面存在的差異所致。本項研究中，‘玫瑰香’葡萄試管苗可在不含任何激素的GS培養(yǎng)基中達到90%的生根率和3.6的繁殖系數(shù)，可能與‘玫瑰香’葡萄枝條容易生根有關(guān)。

培養(yǎng)基中瓊脂的使用是導(dǎo)致試管苗成本增高的原因之一。葡萄試管苗的生根培養(yǎng)通常是在瓊脂培養(yǎng)基中進行的，這種生根方法不僅會增加成本，而且會造成試管苗移栽困難。柴慈江等以沙壤土或蛭石替代瓊脂進行葡萄試管苗生根培養(yǎng)，試管苗生根率達到 90%以上，對試管苗帶坨移栽可以獲得80%或90%以上的成活率[7，12]。但是在這兩項研究中，均在培養(yǎng)基中添加了GS培養(yǎng)基配方中的常量元素、微量元素及維生素等簡單有機物等成分。柴慈江等對栒子和無核棗試管苗的研究結(jié)果表明，以土壤做培養(yǎng)基支撐物時，不添加無機鹽和簡單有機物反而會促進試管苗的生長[13-14]。在對珠美海棠、矮溲疏等試管苗的土壤支撐培養(yǎng)中也都取得了類似的結(jié)果[15-16]。本項研究中，對‘玫瑰香’葡萄試管苗采用黏壤土與蛭石的混合物做培養(yǎng)基支撐物，培養(yǎng)基中只添加IBA和蔗糖，不添加無機鹽和維生素等簡單有機物，取得了較為理想的培養(yǎng)效果。與柴慈江等對選拔巨峰葡萄試管苗的研究結(jié)果相比[7]，由于培養(yǎng)基中省去了無機鹽和簡單有機物，因此，進一步降低了試管苗的成本。

綜上所述：6月27日取‘玫瑰香’葡萄當(dāng)年生新梢莖段，用2%次氯酸鈉浸泡10～15 min可以獲得較好的滅菌培養(yǎng)效果，9月下旬的枝條不適合用于組培快繁；‘玫瑰香’葡萄試管苗的增殖培養(yǎng)以使用不含激素的GS培養(yǎng)基為宜；以黏壤土與蛭石的混合物做培養(yǎng)基支撐物，接種雙節(jié)莖段，可使‘玫瑰香’葡萄試管苗的生根率達到84.4%，與瓊脂培養(yǎng)基對照無顯著差異，根系結(jié)構(gòu)優(yōu)于對照；土壤支撐培養(yǎng)的‘玫瑰香’葡萄試管苗帶坨移栽的成活率為 75%，顯著高于瓊脂支撐培養(yǎng)常規(guī)移栽的試管苗。