表面活性劑對汽爆小麥秸稈高固體含量酶解的影響

李棟梁 舒月力 韓琳潔

摘要：以蒸汽爆破預處理（2.2 MPa，6 min）的小麥秸稈（SEPW）作為原料，對其進行高固體含量酶解。經(jīng)過一系列的單因素試驗及雙因素正交試驗，發(fā)現(xiàn)添加表面活性劑聚乙二醇6000（PEG6000）使SEPW的酶解效率在低纖維素酶添加量下有明顯提高。在反應體系為30 g、葡聚糖添加量為10%、纖維素酶添加量為10 FPU/g葡聚糖時，SEPW的葡聚糖及木聚糖轉化率分別達到54.43%、52.63%，相比于對照組的45.79%、22.75%，分別提高18.87%、131.34%。

關鍵詞：小麥秸稈;蒸汽爆破預處理;酶解;表面活性劑;高固體含量

中圖分類號： S188+.3 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2020）03-0266-07

小麥秸稈產(chǎn)量豐富，但是利用效率極低，現(xiàn)階段主要通過粉碎還田、喂養(yǎng)牲畜及堆肥發(fā)酵進行處理[1-14]。隨著科技進步，新型的物理、化學及生物預處理技術給高效利用這種高產(chǎn)量的生物質能源提供了便利。如微波粉碎預處理、熱水預處理、蒸汽爆破（汽爆）預處理、堿處理、酸處理、生物預處理及綜合預處理等[2]。蒸汽爆破預處理被廣泛應用于生物質預處理，其具有不產(chǎn)生廢棄物、無需額外添加化學試劑、預處理成本低、環(huán)境友好等特點。經(jīng)過汽爆預處理后小麥秸稈的表面結構被破壞，極大提高了纖維素酶與纖維素的結合效率[4]。研究如何減少纖維素酶用量及提高纖維素酶利用率，從而降低酶解過程的成本，一直以來受到極大關注[5]。

目前大多數(shù)研究表明，表面活性劑主要通過降低木質素對纖維素酶的無效吸附，提高纖維素酶的酶解效果[6]。本試驗通過研究表面活性劑聚乙二醇6000（PEG6000）對汽爆小麥秸稈酶解的影響[13-16]，并通過一系列的單因素試驗及正交試驗優(yōu)化搖瓶酶解的條件[17-21]，從而提高高固體含量汽爆小麥秸稈的酶解效率[15]，以期為高固體含量下生物質糖化發(fā)酵成本的降低做出貢獻[7-9]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、主要儀器及試劑

小麥秸稈采自河北省滄州市滄縣。纖維素酶（19.89 FPU/mL）由湖南尤特爾生化有限公司友情提供。

主要儀器：臺式連續(xù)投料粉碎機（DF-15），購自溫嶺市林大機械有限公司;電子天平（FA2004）、分析天平（JH1102）、pH計（PHSJ-4A）等，均購自上海精密科學儀器有限公司;水分儀（MJ33），購自梅特勒-托利多;蒸汽爆破設備（QBS-200B），購自鶴壁市正道生物能源有限公司;搖床（ZWYR-D2401），購自上海智城分析儀器制造有限公司;真空泵[SHZ-D（Ⅲ）]，購自鞏義市予華儀器有限責任公司;紅外激光成像系統(tǒng)（Odyssey），購自美國 LI-COR 公司;電熱鼓風干燥箱（DH-101）、電熱恒溫干燥箱（DH-204），均購自天津市中環(huán)實驗電爐有限公司;高速冷凍離心機（CR22G），購自日本日立公司;臺式高速離心機（TGL-16G），購自上海醫(yī)用分析儀器廠;恒溫水浴鍋（HH-2），購自常州市凱航儀器有限公司;掃描電鏡（JSM-6360），購自日本電子株式會社（JEOL）。

主要試劑：氫氧化鈉，購自天津市化學試劑一廠;酒石酸鉀鈉、鹽酸，均購自天津市北方天醫(yī)化學試劑廠;濃硫酸，購自國藥集團化學試劑有限公司;十二烷基磺酸鈉，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;檸檬酸、檸檬酸鈉、木糖，均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;疊氮化鈉，購自北京索萊寶科技有限公司;葡萄糖、木聚糖酶，均購自Sigma公司;阿拉伯糖，購自VETEC公司;微晶纖維素、蛋白測定試劑盒，均購自天津鼎國生物技術有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 小麥秸稈預處理 小麥秸稈剪切至2～3 cm 長的小段，備用。蒸汽爆破設備為5 L的反應釜，每次加入秸稈200 g，設定處理時間為6 min，處理壓力為2.2 MPa。蒸汽爆破后收集物料用去離子水清洗至中性，晾干粉碎過40目篩，4 ℃保存。

1.2.2 纖維素酶活性測定 纖維素酶活性采用二硝基水楊酸（DNS）法[8]進行測定。

1.2.3 酶解 將經(jīng)預處理的小麥秸稈粉末加入到100 mL的三角瓶中，加入pH值為4.8的檸檬酸鈉緩沖液，反應條件為50 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)（本研究中除非特定說明，反應體系、葡聚糖添加量、纖維素酶添加量分別為20 g、10%、10 FPU/g葡聚糖）。酶解反應120 h，反應結束后，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。取上清，通過高效液相色譜法測定葡萄糖、木糖的含量[11]。正交試驗因素水平見表1。

1.2.4 成分分析 纖維素原料的化學成分分析采用美國國家能源部可再生能源實驗室（NREL）的試驗方法。

1.2.5 掃描電鏡分析 掃描電鏡觀察預處理前后及酶解過程中纖維素底物的表面結構。樣品觀察前先噴金處理，電壓為5 kV。

1.2.6 X射線衍射儀分析 用X射線衍射方法分析預處理前后及酶解過程中纖維素底物的纖維素結晶度的變化規(guī)律，在2θ=10°～40°范圍內掃描，變化速率為2 °/min。結晶度計算公式如下：

結晶度=I002-IamI002×100%。

式中：I002為002衍射晶面2θ=22.8°的強度;Iam為2θ=18.0°散射峰的強度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)作圖均采用Origin 9.0制圖軟件。

2 結果與分析

2.1 預處理前后小麥秸稈主要成分變化

多次稱量可知，固體平均回收率為39.47%，根據(jù)表2計算得出，葡聚糖回收率為76.21%，木聚糖回收率為19.70%，木質素回收率為53.37%，說明汽爆預處理小麥秸稈（SEPW）能夠去除大量半纖維素及木質素，并對纖維素有一定的破壞作用。從表2可以看出，經(jīng)汽爆預處理后，小麥秸稈的葡聚糖及木質素含量升高，但木聚糖含量降低，原因在于木聚糖及其他物質如水溶性物質及小分子物質等在汽爆過程中被去除，因此導致葡聚糖及木質素的含量有所上升。大量研究表明，木質素及半纖維素的存在會對纖維素的酶解產(chǎn)生負面影響[9]。

2.2 預處理及酶解前后小麥秸稈表觀形態(tài)變化

如圖1所示，未處理的小麥秸稈表面平整光滑，纖維排列規(guī)則有序，物理結構致密（圖1-a）。在蒸汽爆破預處理后，小麥秸稈的微觀結構有了較大的變化，致密的物理結構消失，結構變得疏松，纖維呈無規(guī)則排列，細胞內部纖維外露（圖1-b），說明蒸汽爆破破壞了纖維素鏈之間的氫鍵網(wǎng)絡，使纖維素鏈呈散亂排列。

2.3 預處理及酶解前后小麥秸稈結晶度變化

如圖2所示，通常天然纖維素（纖維素Ⅰ）的結晶區(qū)具有4個特征峰，分別為101、10ī、002、004，其中101峰和10ī峰的布拉格角分別為14.3°、16.8°，002峰的布拉格角為22.3°，004峰的布拉格角為34.7°，無定型纖維素特征峰的布拉格角為 18.7°。從圖2中可以看出，蒸汽爆破預處理的小麥秸稈（SEPW）和酶解后汽爆小麥秸稈（ESEPW）的101結晶峰的形狀變得尖銳，002結晶峰的形狀變得平緩，通過計算得知蒸汽爆破預處理的小麥秸稈（SEPW）和酶解后汽爆小麥秸稈（ESEPW）纖維素結晶度分別為47.80%、46.54%，而未處理的小麥秸稈的結晶度為36.47%（表3）。這說明與未處理的樣品相比，蒸汽爆破預處理的小麥秸稈（SEPW）的纖維素結晶度增大了，這可能是由于預處理過程對小麥秸稈中其余組分如木聚糖、水提物的去除造成的。

2.4 補料時間對汽爆小麥秸稈（SEPW）酶解的影響

補料策略如下：初始加入底物小麥秸稈總量的40%，隨后2次補料分別添加底物總量的30%，共4種補料策略，分別為（6，12）、（6，18）、（6，24）、（12，24） h，括號中為補料時間。從圖3中可以看出，（6，12） h的補料策略下，SEPW的酶解效率略高于其他的補料策略，這是可能是由于補料間隔較長時，酶解產(chǎn)物葡萄糖會對酶解產(chǎn)生較強抑制。所以選?。?，12） h作為最佳的補料時間。

2.5 反應體系總質量對SEPW酶解的影響

從圖4中可以看出，隨著反應體系總質量的增大，葡聚糖轉化率先升高后降低，在反應體系總質量為30 g時達到最高，為49.46%，相比反應體系總質量為20 g的46.41%，增長6.57%。筆者認為，在高固體含量的木質纖維素酶解中，反應體系總質量為30 g時，能量損失最低，混合效率最高。

2.6 纖維素酶添加量對SEPW酶解的影響

從圖5可以看出，隨著纖維素酶添加量的增加，葡聚糖及木聚糖的轉化率均在增加，在30 FPU/g葡聚糖的酶添加量后，基本趨于平緩。在纖維素酶添加量增加到50 FPU/g葡聚糖時，轉化率并沒有明顯增長（60.11%），這與何珣等的研究結果[15]相似。從圖6可以看出，纖維酶添加量的變化過程中，葡聚糖與木聚糖的轉化率具有很強的相關性。因此不考慮成本，纖維素酶添加量為50 FPU/g葡聚糖時，葡聚糖轉化率最高。

2.7 葡聚糖添加量對SEPW酶解的影響

當纖維素酶添加量為10 FPU/g葡聚糖時，從圖7可以看出，隨著葡聚糖添加量的增加，葡聚糖轉化率呈先上升后下降的趨勢，當葡聚糖的添加量為5%時達到最大。為滿足精餾分離的經(jīng)濟性要求，乙醇發(fā)酵液的濃度須>4%（質量體積比）。為滿足該乙醇濃度的要求，糖的總濃度需要高于8%（質量體積比）[22]。但高固體含量酶解時反應體系會存在無法液化的嚴重問題，這種問題會使酶與底物無法混合均勻，進而嚴重影響酶解效率。本研究發(fā)現(xiàn)，當葡聚糖添加量為11%時，液化時間延遲的現(xiàn)象出現(xiàn)。因此，本研究選取葡聚糖添加量為10%作為底物添加量。

從圖8可以看出，在不同的葡聚糖添加量時，葡聚糖轉化率與木聚糖轉化率之間有較強的相關性。后續(xù)研究僅參考葡聚糖轉化率作為確定最佳條件的依據(jù)。

2.8 表面活性劑種類對SEPW酶解的影響

從圖9可以看出，PEG6000對汽爆小麥秸稈葡聚糖轉化率有較明顯的影響，相對于不添加表面活性劑的對照組，葡聚糖轉化率增加8.62%。有研究指出，表面活性劑會通過提高酶的活性進而提高降解效率[23]。但在本研究中，當?shù)孜锸俏⒕Юw維素時，表面活性劑的加入并沒有改變酶解效率（圖10）。另一種觀點認為在木質纖維素的酶解過程中，表面活性劑的加入能降低木質素與纖維素酶的無效吸附，從而增加纖維素與纖維素酶的接觸概率，進而提高酶解效率[24-25]，本研究結果符合后者的觀點。

2.9 PEG6000添加量對SEPW酶解的影響

從圖11可以看出，PEG6000添加量為0.10%時，SEPW的酶解效果最佳;在PEG6000的添加量低于0.10%時，酶解效率隨PEG6000添加量的增加而提高;繼續(xù)增加PEG6000的添加量，酶解效率反而下降。從圖12可以看出，PEG6000對微晶纖維素的酶解沒有明顯的作用。所以本研究最佳的PEG6000添加量為0.10%，此時葡聚糖的轉化率為54.43%。

2.10 SEPW酶解雙因素正交試驗結果

從表4可以得知，纖維素酶添加量為30 FPU/g葡聚糖、反應體系為30 g、PEG6000添加量為0.10%時，SEPW的酶解效率最高。經(jīng)計算得知，在30 g的反應體系中，添加0.10% PEG6000后，在纖維素酶添加量分別為10、15、20、25、30 FPU/g葡聚糖時，酶解效率分別提高14.19%、7.37%、4.36%、4.28%、2.95%。可以發(fā)現(xiàn)，隨著纖維素酶添加量的增加，表面活性劑的作用越來越不明顯。筆者認為，隨著纖維素酶添加量的增加，對于整個反應體系，纖維素酶是過量的。在較高的纖維素酶添加量時，木質素對酶的無效吸附在酶解中的影響變低。

3 討論與結論

筆者發(fā)現(xiàn)，小麥秸稈經(jīng)過蒸汽爆破預處理后，化學成分發(fā)生變化，纖維素及木質素的含量升高，半纖維素的含量降低。小麥秸稈致密的物理結構消失，結構疏松，纖維呈無規(guī)則排列，細胞內部纖維外露。

小麥秸稈經(jīng)過汽爆預處理后，增加纖維素酶添加量以及表面活性劑的添加量，能夠有效降低木質素對酶解的影響，特別是表面活性劑，能夠有效地在低纖維素酶添加量下，提高纖維素酶與纖維素的結合率，進而提高酶解效率。

在最佳反應體系下，纖維素酶添加量分別為10、15、20、25、30 FPU/g葡聚糖時，添加0.10%的PEG6000后，酶解效率分別提高14.19%、7.37%、4.36%、4.28%、2.95%。其中，纖維素酶添加量為10 FPU/g葡聚糖時，PEG6000對酶解效率的提高最明顯，SEPW的葡聚糖及木聚糖轉化率分別為54.43%、52.63%，相比于對照組的45.79%、22.75%，分別提高14.19%、131.34%。

在汽爆小麥秸稈高固體含量的酶解過程中，仍然存在許多問題，如汽爆過小麥秸稈中抑制物的去除，木質素的分離成本，酶解過程中過量的二糖和三糖不能被完全降解，汽爆后小麥秸稈結晶度的提高等，都是需要解決的問題。

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