苦木藥材中總生物堿的含量測(cè)定及聚類分析和判別分析

劉明穎，廖小菁，徐 瀅，劉地發(fā)，呂武清，鄧雙炳*

(1.江西青峰藥業(yè)有限公司，江西 贛州 341000；2.創(chuàng)新天然藥物與中藥注射劑國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 贛州 341000)

苦木為苦木科苦木屬植物Picrasmaquassioides(D.Don)Benn，又名苦樹，以其干燥枝和葉入藥。本品苦寒，有小毒，歸肺、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、祛濕的功效，主要用于風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、濕熱瀉痢、濕疹、瘡癤、蛇蟲咬傷等病癥的治療[1]。日本學(xué)者Kondo和Takemoto[2]首次從苦木藥材中分離得到兩個(gè)β-咔巴啉型生物堿，之后中外學(xué)者發(fā)現(xiàn)苦木藥材中的主要化學(xué)成分為生物堿，苦味素次之。其中生物堿類成分有61個(gè)，包括β-咔巴啉型生物堿38個(gè)，鐵屎米酮型生物堿12個(gè)，生物堿二聚體11個(gè)，苦味素類成分44個(gè)[3-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，苦木藥材中的主要活性成分為生物堿，具有抗菌[5]、抗炎[6]、抗瘧[7]、抗腫瘤[8]、降壓[9]、抑制cAMP磷酸酯酶活性[10]、抑制骨質(zhì)疏松[11]等作用。2015年版《中國(guó)藥典》中苦木質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未收載含量測(cè)定項(xiàng)，而2014年版江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[12]則是通過(guò)氯仿多次萃取后稱重進(jìn)行測(cè)定，此法步驟繁多，平行性差，操作誤差大，檢測(cè)限高，且氯仿屬于二類溶劑，毒性較大。苦木藥材質(zhì)量研究報(bào)道多為HPLC法測(cè)定其單個(gè)或若干個(gè)生物堿的含量[13-14]，其總生物堿含量測(cè)定的研究鮮有報(bào)道。本文以苦木含量較高且為主要活性成分的苦木酮為對(duì)照品，建立紫外分光光度法測(cè)定不同產(chǎn)地不同部位30批次苦木藥材中總生物堿的含量，通過(guò)聚類分析和偏最小二乘法判別分析的方法對(duì)苦木藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為苦木及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考和借鑒。

1 材料

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-2550(島津)；電子分析天平XS105DU、ML204T(梅特勒-托利多科技有限公司)；超聲清洗器KQ-300DE(昆山市超聲儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋HHS-11-2(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)；無(wú)水乙醇、鹽酸均為分析純(廣東光華科技股份有限公司)；水為超純水(Mili-Q自制)。

苦木酮(5-Hydroxy-4-methoxycanthin-6-one)為自制，經(jīng)光譜學(xué)鑒定結(jié)構(gòu)，質(zhì)量平衡法檢測(cè)其含量為98.8%?？嗄緶y(cè)試樣品共30批，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所龔洵研究員鑒定為苦木科苦樹屬植物苦木Picrasmaquassioides的莖和粗枝，于江西青峰藥業(yè)有限公司留存。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

取苦木酮對(duì)照品適量，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加80%乙醇制成每1 mL中含苦木酮0.1 mg的溶液，即得。

2.2 供試品溶液制備

取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放置至室溫，再稱定重量，用80%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。過(guò)濾后濾渣再精密加入80%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放置至室溫，再稱定重量，用80%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)。分別精密移取上述過(guò)濾液25 mL，合并置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，用10 mL 2%鹽酸溶液分3次溶解提取物，并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，超聲10 min使之溶解，加2%鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)。精密移取上述濾液的續(xù)濾液1 mL，置于20 mL容量瓶中，加入2%鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 吸收波長(zhǎng)選擇

取空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液分別在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，記錄光譜圖，結(jié)果表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在318 nm處均有最大吸收。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取對(duì)照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，加入2%鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，以2%鹽酸溶液為空白，采用紫外-可見(jiàn)分光光度法，在318 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(y)，濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5 測(cè)定法

依法測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，即得。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性考察 取空白溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液，分別在190 ～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，記錄光譜圖。結(jié)果顯示空白溶劑無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。

2.6.2 線性范圍考察 按照“2.4”項(xiàng)下制備標(biāo)準(zhǔn)曲線供試品，于318 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(y)，濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=0.045 968 0x+0.006 073 00，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。表明苦木酮在0.004～0.02 mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.6.3 精密度試驗(yàn) (1)儀器精密度試驗(yàn)。取同一對(duì)照品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下方法重復(fù)測(cè)定6次，得到苦木酮吸光度RSD為0.3%，表明儀器精密度良好。

(2)重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批號(hào)樣品共6份，按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，測(cè)定總生物堿的含量，計(jì)算得到總生物堿的含量RSD值為1.3%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

(3)中間精密度試驗(yàn)。由不同分析人員在不同日期，按照“2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液的制備方法制備對(duì)照品溶液。取同一批號(hào)樣品6份，按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，測(cè)定總生物堿的含量，計(jì)算得到總生物堿的含量與上述重復(fù)性的結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，得到RSD(n=12)值為2.9%，說(shuō)明該方法中間精密度良好。綜上所述，本方法的精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，室溫保存，按照“2.5”項(xiàng)下測(cè)定法測(cè)定，分別于放置0 h、1 h、2 h、4 h、5 h、24 h時(shí)測(cè)定其的吸光度，測(cè)得供試品溶液吸光度的RSD為0.2%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。對(duì)照品溶液在冰箱放置7天內(nèi)，吸光度RSD為0.5%，含量RSD為0.9%，表明對(duì)照品溶液在7天內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入苦木酮對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按照“2.2”“2.4”和“2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率(n=9)。結(jié)果表明苦木酮的平均回收率為100.22%，各濃度項(xiàng)下的平均回收率均在90%～108%范圍內(nèi)，且回收率的RSD為2.8%(≤5.0%)，表明本方法的準(zhǔn)確度良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6.6 耐用性考察(1)不同波長(zhǎng)。取供試品溶液，分別于316 nm、318 nm、320 nm處進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)各波長(zhǎng)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到不同波長(zhǎng)處總生物堿的含量。不同波長(zhǎng)下測(cè)得的含量RSD為0.7%，本法在檢測(cè)波長(zhǎng)±2 nm下耐用性良好。

(2)不同酸濃度。在“2.3”項(xiàng)下分別用1.8%、2.0%、2.2%鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。對(duì)照品溶液的制備同重復(fù)性試驗(yàn)，依法進(jìn)行測(cè)定。不同酸濃度下，苦木藥材莖總生物堿含量的RSD為2.6%(<3.0%)，表明本法在酸濃度±0.2%下耐用性良好。

2.7 樣品測(cè)定

取不同批號(hào)苦木藥材莖樣品，按照“2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中總生物堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

2.8 聚類分析

采用IBM SPSS Statistics 21.0軟件對(duì)總生物堿含量進(jìn)行聚類分析，聚類方法為組間聯(lián)接，度量標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間為平方Euclidean距離，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，見(jiàn)圖1。通過(guò)分析可將上述30批次藥材分為兩類，湖北荊門莖和廣東英德莖可以歸為一類，廣西河池莖、貴州都勻莖、湖北荊門粗枝和廣西河池粗枝可以歸為一類。由表2和圖1中可以看出，不同產(chǎn)地和不同部位苦木藥材總生物堿含量差異較為明顯。

圖1不同產(chǎn)地不同部位苦木藥材的聚類分析

2.9 偏最小二乘法-判別分析

采用SIMAC-P 11.5軟件對(duì)總生物堿含量進(jìn)行判別分析，以批號(hào)、產(chǎn)地、部位為自變量，總生物堿含量為應(yīng)變量，得到貢獻(xiàn)率圖和得分散點(diǎn)圖，如圖2、圖3所示。通過(guò)貢獻(xiàn)率圖，可以得出苦木藥材的用藥部位對(duì)總生物堿的影響最大，其次是產(chǎn)地；但是因部分產(chǎn)地苦木藥材的總生物堿含量水平較低，其貢獻(xiàn)率不突出。

圖2PLS-DA法分析貢獻(xiàn)率

分散點(diǎn)圖可以很好地將粗枝和莖進(jìn)行分別，但是由于不同產(chǎn)地苦木藥材莖的總生物堿含量差異較為顯著，產(chǎn)地方面無(wú)法很好地進(jìn)行分類。

圖3PLS-DA法得分散點(diǎn)圖

3 討論

本文建立了苦木藥材中總生物堿的含量測(cè)定方法，結(jié)果表明本方法操作簡(jiǎn)便，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率均較好。本研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地苦木中總生物堿含量差異較大，其中湖北荊門苦木的總生物堿含量最高(0.75%)，廣西河池次之(0.40%)，而廣東英德最低(0.32%)，可能由于生長(zhǎng)環(huán)境、氣候、植物生長(zhǎng)年限的不同導(dǎo)致其含量存在差異；且苦木不同藥用部位總生物堿含量差異也較大，莖的總生物堿含量明顯高于粗枝，可能由不同藥用部位組成不同引起含量差異?？嗄咀鳛榫哂兄匾幱脙r(jià)值的天然藥物資源，研究其主要活性成分總生物堿的含量，可為苦木及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考，為苦木藥材的合理開發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。