咪唑并[1,2-a]吡啶化合物的無溶劑合成及其抗氧化性能

席高磊,陳芝飛,楊金初,蔡莉莉,馬波波,楊 靜*,張曉平

(1.河南中煙工業(yè)有限責任公司 技術中心，河南 鄭州 450000；2.河南農業(yè)大學 煙草學院，河南 鄭州 450002)

自由基引發(fā)的氧化損傷是導致衰老及多種疾病的直接原因[1]，及時清除多余自由基是預防衰老和疾病的重要環(huán)節(jié)。目前，抗氧化研究已成為醫(yī)藥、食品、保健等領域的熱門課題，相關研究主要集中于抗氧化化合物的設計和測試[2]。由于天然化合物具有低毒性及多樣活性[3]，其結構成為設計多種活性先導化合物的優(yōu)先選擇。

Scheme 1

咪唑并吡啶化合物是將咪唑和吡啶兩種天然結構骨架集成于一個分子中的含氮稠雜環(huán)化合物，具有抗菌[4-5]、抗癌[6-7]、抗炎[8-9]等多種生理和藥理活性。因此，咪唑并吡啶化合物的合成及生物活性探索成為研究熱點之一[10-11]。然而關于咪唑并吡啶化合物的抗氧化性能的研究報道較少。Frett等[12-13]以2-氨基吡啶和鹵代醛酮為原料，通過氨基和醛酮縮合及分子內環(huán)化反應合成了咪唑并吡啶化合物；Yadav等[14]采用相似的反應機理，以2-氨基吡啶與醛酮反應制備了一系列咪唑并吡啶化合物；Groebke、Blackburn及Bienaymé等3個研究小組[15-17]幾乎同時報道了以2-氨基吡啶、醛和異氰為原料，采用三組分反應合成咪唑并吡啶化合物的方法。

由此，以G-B-B三組分法合成含氮稠雜環(huán)化合物成為熱點。2014年，Lacerda等[18]以乙醇為溶劑，在室溫下采用冰醋酸催化2-氨基吡啶、苯甲醛和異氰基乙酸乙酯之間發(fā)生反應合成了化合物1a，產率為65%，其是合成TNF-α抑制劑的重要中間體；2016年，Swami等[19]在80 ℃條件下，以甲苯為溶劑，In(OTf)3為催化劑，一鍋法合成了化合物1d。近年來，本課題組[20]針對G-B-B三組分反應進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)合成的二茂鐵基咪唑并[1,2-a]吡啶化合物具有一定的抗氧化劑活性，并對化合物1a～1f的反應溶劑和催化劑進行了篩選，發(fā)現(xiàn)在乙醇溶劑中，采用LaCl3催化制備產率較高，產率為85%～95%[21]。

本文在課題組研究基礎上，以2-氨基吡啶、芳香醛和異氰基乙酸乙酯為原料，LaCl3作催化劑，在無溶劑條件下實現(xiàn)了G-B-B三組分反應，高效合成了6個咪唑并[1,2-a]吡啶化合物(1a～1f,Scheme 1)，產率89%～97%,其結構經1H NMR,13C NMR和HR-MS(ESI)確證。采用自由基氧化DNA的反應體系檢測目標化合物抗氧化活性，并通過淬滅自由基實驗考察其還原自由基能力，進而探究咪唑并[1,2-a]吡啶化合物的抗氧化構效關系。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JH40型全自動熔點儀；UV1101型紫外可見分光光度計；Bruker Avance AMX-400 MHz型核磁共振儀(CDCl3或DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；Agilent1290-micrOTOF Q II型高效液相色-質聯(lián)用儀。

2-氨基吡啶，天津希恩思生化科技有限公司；異氰基乙酸乙酯，天津光復精細化學品有限公司；苯甲醛、水楊醛、3-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲醛、2,4-二羥基苯甲醛、3,4-二羥基苯甲醛，北京化工廠；2-硫代巴比妥酸(TBA)，國藥集團化學試劑有限公司；還原型谷胱甘肽(GSH)、四氯氫醌(TCHQ)，上海源葉生物科技有限公司；三氯乙酸(TCA)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，上海達瑞精細化學品有限公司；脫氧核糖核酸鈉鹽(DNA)，Acros Organics公司；2,2′-偶氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽自由基(ABTS+·)、二苯苦味酰肼自由基(DPPH)、2,6-二叔丁基-(3,5-二叔丁基-4-氧代-2,5-環(huán)己二烯)-對-甲苯氧自由基(galvinoxyl)，美國Sigma-Aldrich公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 1a～1f的合成通法

將2-氨基吡啶0.09 g(1.0 mmol)、芳香醛(1.0 mmol)、異氰基乙酸乙酯0.14 g(1.2 mmol)和LaCl30.03 g(1.0 mmol)加入25 mL圓底燒瓶中，攪拌下于80 ℃(浴溫)反應2 h(TLC檢測)。冷卻至室溫,經硅膠柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯)/V(石油醚)=1/3]純化得1a～1f。

2-{(2-苯基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)氨基}乙酸乙酯(1a)：黃色油狀液體，產率97%;1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:8.22(d,J=6.8 Hz,1H),8.04(d,J=7.2 Hz,2H),7.54(d,J=8.8 Hz,1H),7.44(t,J=8.0 Hz,2H),7.32(d,J=7.6 Hz,1H),7.13(t,J=8.0 Hz,1H),6.78(t,J=6.8 Hz,1H),4.19(dd,J=7.2 Hz,14.4 Hz,2H),3.80(d,J=4.8 Hz,2H),3.76(d,J=5.2 Hz,1H),1.24(t,J=7.2 Hz,3H);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:171.8,141.6,135.9,134.1,128.6,127.4,126.9,126.6,124.8,124.1,122.8,117.4,111.7,101.6,61.3,49.4,14.1;HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C17H17N3O2{[M+H]+}296.1399,found 296.1421。

2-【{2-(2-羥基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基}氨基】乙酸乙酯(1b)：黃色固體，產率94%,m.p.50～52 ℃;1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ:8.32(d,J=6.8 Hz,1H),7.97(d,J=8.0 Hz,1H),7.46(d,J=8.8 Hz,1H),7.17～7.23(m,2H),7.01(d,J=8.0 Hz,1H),6.84～6.89(m,2H),4.19(dd,J=7.2 Hz,14.0 Hz,2H),3.81(d,J=4.8 Hz,2H),3.77(d,J=4.4 Hz,1H),1.24(t,J=7.2 Hz,3H);13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ:171.6,157.3,139.0,134.7,128.9,125.9,124.8,123.4,122.6,118.7,117.2,116.7,115.9,112.1,61.1,48.8,13.9;HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C17H17N3O3{[M+H]+}312.134 8,found 312.137 0。

2-【{2-(3-羥基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基}氨基】乙酸乙酯(1c)：淡黃色固體，產率94%,m.p.85～87 ℃;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:9.38(s,1H),8.47(d,J=6.8 Hz,1H),7.55～7.57(m,2H),7.44(d,J=8.8 Hz,1H),7.23 (t,J=8.0 Hz,1H),7.14～7.19(m,1H),6.88(td,J=1.2 Hz,J=7.2 Hz,1H),6.69～6.71(m,1H),5.36(t,J=6.0 Hz,1H),4.00(dd,J=7.2 Hz,14.0 Hz,2H),3.80(d,J=6.4 Hz,2H),1.08(t,J=7.2 Hz,3H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:172.2,158.0,140.7,136.1,133.7,129.8,126.7,124.4,124.2,117.8,116.9,114.6,114.0,111.4,60.8,49.3,14.3;HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C17H17N3O3{[M+H]+}312.1348,found 312.1361。

2-【{2-(4-羥基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基}氨基】乙酸乙酯(1d)：黃色固體,產率96%,m.p.222～224 ℃;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:9.47(s,1H),8.42(d,J=6.8 Hz,1H),7.93(d,J=8.8 Hz,2H),7.41(d,J=9.2 Hz,1H),7.11～7.15(m,1H),6.82～6.87(m,3H),5.24(t,J=6.0 Hz,1H),3.99(dd,J=7.2 Hz,14.0 Hz,2H),3.76(d,J=6.4 Hz,2H),1.08(t,J=7.2 Hz,3H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:172.2,157.1,140.7,134.5,128.3,125.9,125.3,124.2,123.9,116.7,115.7,111.2,60.7,49.2,14.4;HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C17H17N3O3{[M+H]+}312.1348;found 312.1371。

2-【{2-(2,4-二羥基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基}氨基】乙酸乙酯(1e)：黃色固體，產率89%,m.p.97～99 ℃;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:12.91(s,1H),9.47(s,1H),8.53(d,J=6.8 Hz,1H),7.97(d,J=8.4 Hz,1H),7.53(d,J=9.2 Hz,1H),7.28(t,J=8.0 Hz,1H),7.01(t,J=6.8 Hz,1H),6.35(dd,J=2.8 Hz,8.8 Hz,1H),6.29(d,J=2.8 Hz,1H),5.37(t,J=6.0 Hz,1H),4.02(dd,J=6.8 Hz,14.0 Hz,2H),3.80(d,J=6.0 Hz,2H),1.09(t,J=6.8 Hz,3H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:171.6,158.2,138.4,133.5,127.5,124.8,123.7,123.6,115.3,111.8,108.7,106.8,103.1,60.3,48.5,13.9;HR-MS(ESI)m/z:Calcd for C17H17N3O4{[M+H]+}328.129 7,found 328.132 1。

2-【{2-(3,4-二羥基苯基)咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基}氨基】乙酸乙酯(1f)：黃色固體，產率92%,m.p.169～171 ℃;1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ:8.93(s,2H),8.43(d,J=6.8 Hz,1H),7.55(d,J=2.0 Hz,1H),7.38～7.41(m,2H),7.10～7.14(m,1H),6.85(td,J=1.2 Hz,J=7.2 Hz,1H),6.78(d,J=8.4 Hz,1H),5.22(t,J=6.0 Hz,1H),4.00(dd,J=7.2 Hz,14.0 Hz,2H),3.77(d,J=6.0 Hz,2H),1.08(t,J=7.2 Hz,3H);13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ:171.8,145.2,144.7,140.0,133.9,125.8,124.9,123.7,123.3,117.9,116.1,115.6,114.2,110.6,60.3,48.7,13.9;HR-MS (ESI)m/z:Calcd for C17H17N3O4{[M+H]+}328.1297,found 328.1323。

Chart 1

1.3 抗氧化性能測試

參考文獻方法測試化合物抑制HO·引發(fā)的氧化反應體系效果[22]與抑制GS·引發(fā)的氧化反應體系效果[23]。

1.4 捕獲自由基性能測試

ABTS+·為N-(Chart1)中心自由基，可測試酚羥基還原自由基的能力。DPPH·也是一個N-中心自由基，可檢測抗氧化劑將自身的氫原子給予N-中心自由基的能力和抗氧化劑中單電子給予N-中心自由基的能力。galvinoxyl自由基是一個O-中心自由基，可用于檢測抗氧化劑將氫原子或電子給予O-中心自由基的能力。參考文獻[24-26]方法，測定了ABTS+·濃度、DPPH·濃度和galvinoxyl濃度隨時間的變化曲線。

1.5 數據統(tǒng)計與分析

采用Origin 8.0軟件對數據進行ANOVA方差分析，顯著性檢驗方法為Duncan多重檢驗，顯著水平為0.05。

2 結果與討論

2.1 合成

以化合物1a的合成為例，探討了反應條件對化合物1a產率的影響，結果見表1。由表1可以看出，在無溶劑條件下，以LaCl3為催化劑，80 ℃加熱反應2 h，是合成目標化合物的較佳方法，化合物1a的產率為97%，高于文獻[21]方法產率。

表1 反應條件對1a產率的影響Table 1 The influences of reaction conditions on yield of 1a

2.2 抑制自由基引發(fā)的DNA氧化反應性能

在自由基引發(fā)的DNA氧化反應體系中，自由基可以氧化DNA生成小分子羰基化合物——硫代巴比妥酸活性物質(TBARS)[27]。TBARS可以與硫代巴比妥酸(TBA)在酸性(三氯乙酸)條件下反應生成有色物質，最大吸光波長為535 nm[28]。因此，通過檢測DNA氧化反應過程中產生TBARS的量，可以很方便地監(jiān)測DNA氧化反應的程度。加入待測化合物后，通過檢測DNA氧化反應過程中產生TBARS量的變化即可評估化合物的抗氧化性能[29]。

圖1 1a～1f抑制HO·引發(fā)的DNA氧化反應性能Figure 1 The activities ladder diagram of 1a～1f in inhibiting HO·induced oxidation of DNA

圖 2 1a～1f抑制GS·引發(fā)的DNA氧化反應性能Figure 2 The activities ladder diagram of 1a～1f in inhibiting GS·induced oxidation of DNA

(1) 抑制HO·引發(fā)的DNA氧化反應體系

由圖1可見，6個化合物的TBARS百分數均低于空白組(100%)，表明6個化合物均具備抑制HO·引發(fā)DNA氧化反應的能力。初步構效分析表明，在化合物1a苯環(huán)上引入推電子基團(OH)得到化合物1b、1c和1d，其TBARS百分數分別為45.5%、56.8%和51.6%，均遠低于化合物1a的TBARS百分數(72.1%)，說明OH有利于咪唑并[1,2-a]吡啶化合物保護DNA免受HO·引發(fā)的氧化損傷[30]。同時，化合物1b、1c和1d的TBARS百分數遵循“間位>對位>鄰位”(OH位置)的順序，說明OH處于鄰位時最有利于提高化合物活性。在單羥基咪唑并[1,2-a]吡啶化合物中繼續(xù)引入一個OH后，所得化合物1e和1f的TBARS百分數進一步降低，達到了32.2%和39.4%，說明咪唑并[1,2-a]吡啶化合物抑制HO·引發(fā)DNA氧化反應的性能隨羥基數目增加而增強。其中，雙羥基化合物1e的TBARS百分數明顯小于化合物1f的TBARS百分數，說明兩個OH處在鄰、對位時更有利于咪唑并[1,2-a]吡啶抑制HO·引發(fā)的DNA氧化反應，主要原因是由于化合物1f中的兩個處在相鄰的位置，形成分子內氫鍵，使得羥基上的氫原子與另一個羥基中的氧原子之間產生相互作用，不易被HO·奪取，使該化合物的抗氧化性能有所下降[31]。

(2) 抑制GS·引發(fā)的DNA氧化反應體系

由圖2可見，6個化合物的TBARS百分數均低于空白組(100%)，表明目標化合物也具備抑制GS·引發(fā)DNA氧化反應的能力。初步構效分析表明，化合物1a的TBARS百分數為81.3%，而含羥基咪唑并[1,2-a]吡啶化合物1b～1f的TBARS百分數均明顯低于化合物1a的81.3%，且都在65%以下，說明酚羥基作為傳統(tǒng)抗氧化基團，也能夠有效提高咪唑并[1,2-a]吡啶化合物抑制GS·引發(fā)的DNA氧化反應能力。其中，單羥基化合物1b的TBARS百分數(56.6%)小于單羥基化合物1c和1d的TBARS百分數(64.1%和58.6%)，說明羥基處于鄰位最有利于提高化合物抑制GS·引發(fā)的DNA氧化反應性能，與HO·引發(fā)的DNA氧化反應實驗結果相同。雙羥基化合物1e和1f的TBARS百分數分別為34.8%和42.3%，遠小于單羥基化合物的TBARS百分數，說明OH之間存在協(xié)同作用，能夠進一步提高咪唑并[1,2-a]吡啶化合物的抗氧化作用?；衔?e的TBARS百分數最小，說明兩個OH處在鄰、對位時咪唑并[1,2-a]吡啶具有更強的抑制GS·引發(fā)的DNA氧化反應活性，與其抑制HO·引發(fā)DNA的氧化反應結果類似。

t/s圖3 1a～1f捕獲ABTS+·性能Figure 3 The activities of 1a～1f on trapping ABTS+·

2.3 捕獲自由基性能分析

(1) 捕獲ABTS+·結果分析[32]

以ABTS+·濃度為縱坐標，反應時間為橫坐標，作濃度隨時間的衰減曲線，如圖3所示。由圖3可見，空白實驗中，隨著反應時間的增長，ABTS+·濃度始終不變，當加入濃度為10 mol/L的化合物1a～1f后，ABTS+·濃度隨反應時間的增長逐漸減小，說明6個咪唑并[1,2-a]吡啶化合物均能夠提供電子與ABTS+·孤對電子配對，從而展現(xiàn)捕獲ABTS+·的能力。其中，化合物1a分子中無特征抗氧化官能團，卻能夠捕獲ABTS+·，其原因可能是化合物分子中的仲胺可以給出氫原子，從而淬滅ABTS+·，并生成N-中心自由基，生成的N-中心自由基可以通過共振式分散N-中心自由基(Scheme 2)，從而穩(wěn)定自由基單電子，發(fā)揮了相當于羥基的抗氧化性能。在加入單羥基化合物1b、1c和1d體系中，ABTS+·濃度隨時間的衰減曲線低于含有化合物1a的體系，在加入雙羥基化合物1e和1f體系中，ABTS+·濃度隨時間的衰減曲線進一步降低，說明羥基是有效的抗氧化官能團，能夠有效地提高咪唑并[1,2-a]吡啶化合物捕獲ABTS+·的能力，且隨羥基數目的增加，化合物捕獲ABTS+·的能力不斷增強。另外，對比發(fā)現(xiàn)，在加入單羥基化合物1b體系中，ABTS+·濃度隨時間的衰減曲線低于單羥基化合物1c和1d的體系，說明化合物1b具有更強的捕獲ABTS+·的能力，即羥基處于鄰位更有利于化合物與ABTS+·孤對電子配對。在加入雙羥基化合物1e體系中，ABTS+·濃度隨時間的衰減曲線低于雙羥基化合物1f的體系，說明化合物1e具有更強的捕獲ABTS+·的能力，所得結論與抑制自由基引發(fā)的DNA氧化反應體系分析結果一致，即兩個羥基處在鄰、對位時咪唑并[1,2-a]吡啶具有更強地捕獲ABTS+·的能力。

Scheme 2

(2) 捕獲DPPH·結果分析

以DPPH·濃度為縱坐標，反應時間為橫坐標，作濃度隨時間的衰減曲線(圖略)。由圖分析可知，加入濃度為20mol/L的化合物1a～1f后，DPPH·濃度隨反應時間的增長逐漸降低，說明6個咪唑并[1,2-a]吡啶化合物也能夠提供電子與DPPH·孤對電子配對，展現(xiàn)捕獲DPPH·的能力。其中，在加入羥基化合物1b～1f體系中，DPPH·濃度隨時間的衰減曲線明顯低于含有化合物1a的體系，且在加入雙羥基化合物1e和1f體系中，DPPH·濃度隨時間的衰減曲線還低于單羥基化合物1b、1c和1d體系，說明羥基是有效的抗氧化官能團，能夠有效地提高咪唑并[1,2-a]吡啶化合物捕獲DPPH·的能力，且隨羥基數目的增加，化合物捕獲DPPH·的能力不斷增強，所得結論與捕獲ABTS+·結果一致，說明咪唑并[1,2-a]吡啶化合物分子中酚羥基也可以給出H原子與DPPH·孤對電子配對，從而提高化合物捕獲DPPH·的能力。另外，與捕獲ABTS+·反應結果不同的是在加入單羥基化合物1d體系中，DPPH·濃度隨時間的衰減曲線低于單羥基化合物1b和1c的體系，說明化合物1d具有更強的捕獲DPPH·的能力，即羥基處于對位最有利于化合物淬滅DPPH·。在加入雙羥基化合物1e體系中，DPPH·濃度隨時間的衰減曲線低于雙羥基化合物1f的體系，是6個化合物中最低的，說明化合物1e具有更強的捕獲DPPH·的能力，即兩個酚羥基處于鄰、對位時更有利于咪唑并[1,2-a]吡啶淬滅DPPH·，與捕獲ABTS+·結果一致。此外，文獻[33]報道了7個羥基咪唑并[1,2-a]吡啶化合物捕獲DPPH·百分數分別為85%、57%、38%、89%、86%、90%和78%，采用相同方法求得的咪唑并[1,2-a]吡啶化合物1a～1f捕獲DPPH·百分數分別為84.2%、91.1%、91.9%、93.4%、96.7%和95.3%。

(3) 捕獲galvinoxyl結果分析

以galvinoxyl濃度為縱坐標，反應時間為橫坐標，作濃度隨時間的衰減曲線(圖略)。由圖可知，加入濃度為200mol/L的化合物1b～1f后，galvinoxyl自由基濃度隨反應時間的增長逐漸降低，說明只有連有羥基的咪唑并[1,2-a]吡啶化合物才能捕獲galvinoxyl自由基，而無羥基化合物1a則不能提供電子與galvinoxyl自由基的孤對電子配對，不具有淬滅galvinoxyl自由基的能力，即在與galvinoxyl反應中，羥基是一個必需的官能團，仲胺基團在此不能發(fā)揮類似的作用。在加入單羥基化合物1b、1c和1d體系中，化合物1d對應的galvinoxyl自由基濃度隨反應時間變化降低最快，說明化合物1d具有更強的捕獲galvinoxyl自由基的能力，即羥基處于對位最有利于化合物淬滅galvinoxyl自由基，與捕獲DPPH·結果一致。在加入雙羥基化合物1e和1f體系中，galvinoxyl自由基濃度隨時間的衰減曲線低于單羥基化合物1b、1c和1d體系。其中，在加入化合物1e體系中，galvinoxyl自由基濃度隨時間的衰減曲線低于化合物1f的體系，也是6個化合物中最低的，說明隨羥基數目的增加，化合物捕獲galvinoxyl自由基的能力不斷增強，且兩個酚羥基處在鄰、對位時更有利于咪唑并[1,2-a]吡啶淬滅galvinoxyl，與抑制自由基引發(fā)的DNA氧化反應及捕獲其它自由基結果一致，是由于兩個酚羥基處在鄰位形成分子內氫鍵降低了淬滅galvinoxyl的活性。

在無溶劑條件下，經Groebke-Blackburn-Bienaymé三組分反應高效制備了6個咪唑并[1,2-a]吡啶化合物(1a～1f)，采用抑制HO·和GS·自由基引發(fā)的DNA氧化反應研究了化合物的抗氧化活性，并通過淬滅ABTS+·、DPPH·和galvinoxyl自由基實驗考察了目標化合物還原自由基的能力。結果表明，6種目標化合物不僅能夠很好地抑制HO·和GS·引發(fā)的DNA氧化反應，也能夠很好地捕獲ABTS+·和DPPH·兩種自由基，且含有羥基的咪唑并[1,2-a]吡啶化合物還能夠捕獲galvinoxyl自由基，是一類潛在的抗氧化劑。其中，化合物1e抗氧化活性最好，其抑制HO·和GS·引發(fā)的DNA氧化反應TBARS百分數分別為32.2%和34.8%。