新型冠狀病毒與實(shí)時(shí)熒光RT－PCR核酸檢測(cè)＊

郭曉波，藺 京，來春艷，張養(yǎng)民，龔衛(wèi)鋒，史 敏，楊瑞利

1.西安市中心醫(yī)院血液科（西安710004）；2.西安市中心醫(yī)院控感科（西安710004）；3.西安市中心醫(yī)院輸血科（西安710004）；4.西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院（西安710065）；5.西安長安醫(yī)院檢驗(yàn)科（西安710016）

新型冠狀病毒（世界衛(wèi)生組織已將其命名為“2019 novel Coronavirus，2019－nCoV，即2019新型冠狀病毒”）是以前從未在人體中發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒新毒株［1－4］，目前，已知的冠狀病毒有6種，其中4種在人群中較為常見，致病性較低，一般僅引起類似普通感冒的輕微呼吸道癥狀；另外2種是SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒，可引起嚴(yán)重急性呼吸綜合征和中東呼吸綜合征。此次發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒與SARS和MERS冠狀病毒有很大不同。新型冠狀病毒肺炎臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、乏力、干咳為主要表現(xiàn)，鼻塞、流涕等上呼吸道癥狀少見。約半數(shù)患者多在一周后出現(xiàn)呼吸困難，嚴(yán)重者快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒征休克、難以糾正的代謝性酸中毒和出凝血功能障礙。值得注意的是重癥、危重患者病程中可為中低熱，甚至無明顯發(fā)熱。部分患者起病癥狀輕微，可無發(fā)熱，多在1周后恢復(fù)；多數(shù)患者預(yù)后良好，少數(shù)患者病情危重，甚至死亡［5－7］。本文就新型冠狀病毒的病原學(xué)特點(diǎn)及其與實(shí)時(shí)熒光RT－PCR核酸檢測(cè)間的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 新型冠狀病毒及其病原學(xué)特點(diǎn)

冠狀病毒為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒，屬于巢病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）正冠狀病毒亞科（Orthocoronavirinae）。根據(jù)血清學(xué)和基因組特點(diǎn)冠狀病毒亞科被分為α、β、γ和δ四個(gè)屬。已知感染人的冠狀病毒有6種，包括α屬的229E和NL63、β屬的OC43和HKU1、中東呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒（MERSr－CoV）和嚴(yán)重急性呼吸綜合征相關(guān)冠狀病毒（SARSr－CoV）。此次從武漢市不明原因肺炎患者下呼吸道分離出的冠狀病毒為一種屬于β屬的新型冠狀病毒［8］。冠狀病毒有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，經(jīng)常為多行性，直徑60～140nm。S蛋白位于病毒表面形成棒狀結(jié)構(gòu)，作為病毒的主要抗原蛋白之一，是用于分型的主要基因。N蛋白包裹病毒基因組，可用作診斷抗原。其基因特征與SARS－CoV和MERS－CoV有明顯區(qū)別。目前的研究顯示與蝙蝠SARS樣冠狀病毒（bat－SL－CoVZC45）同源性達(dá)85%以上。體外分離培養(yǎng)時(shí)，2019－nCoV 96h左右即可在人呼吸道上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)，而在Vero E6和Huh－7細(xì)胞系中分離培養(yǎng)需約6d［9］。

對(duì)冠狀病毒理化特性的認(rèn)識(shí)多來自對(duì)SARSCoV和MERS－CoV的研究。病毒對(duì)紫外線和熱敏感，56℃30min、乙醚、75%酒精、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒，氯已定不能有效滅活病毒［10］。

2 新型冠狀病毒實(shí)時(shí)熒光RT－PCR核酸檢測(cè)

按照最新指南，利用熒光RT－PCR檢測(cè)新型冠狀病毒核酸陽性仍然是確診的金標(biāo)準(zhǔn)。新型冠狀病毒實(shí)時(shí)熒光RT－PCR核酸檢測(cè)基本原理，是根據(jù)病毒的核酸序列設(shè)計(jì)特異性的引物用于擴(kuò)增對(duì)應(yīng)的核酸片段，同時(shí)高度特異性的Taq Man探針可與對(duì)應(yīng)的核酸片段進(jìn)行結(jié)合，并在Taq酶外切酶活性作用下發(fā)生水解，產(chǎn)生熒光信號(hào)，根據(jù)熒光信號(hào)與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)之間的關(guān)系可得到實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線。標(biāo)本處理前必須進(jìn)行56℃30min病毒滅活預(yù)處理，方可進(jìn)行后續(xù)處理。樣本選擇原則，盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道樣本（上呼吸道樣本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深咳痰液、呼吸道抽取物、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等）。輕癥病例優(yōu)先采集咽拭子和痰液，重癥病例優(yōu)先采集肺泡灌洗液。所有標(biāo)本應(yīng)放在大小適合的帶外螺旋蓋的、有墊圈的、耐冷凍的樣本采集管理，擰緊。容器外注明樣本標(biāo)號(hào)、種類、姓名及采集日期。將密閉后的標(biāo)本放入大小合適的塑料袋內(nèi)密封。標(biāo)本采集后，按相關(guān)要求立即送往實(shí)驗(yàn)室。若氣溫高時(shí)，需放入冰塊降溫。樣本抵達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè)，24h內(nèi)能檢測(cè)的標(biāo)本可置于4℃暫時(shí)保存，24h內(nèi)無法檢測(cè)的樣本則應(yīng)置于－70℃或以下保存。如無－70℃保存條件，則于－20℃冰箱暫存，標(biāo)本避免反復(fù)凍融。目前各大商業(yè)公司試劑盒中以2019－nCoV的RdRP基因（位于ORF1ab讀碼框）、E基因和N基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)2019－nCoV核酸的檢測(cè)［11］。在質(zhì)控品正常的情況下，2019－nCoV的RdRP、E、N基因結(jié)果判斷見表1，2019－nCoV核酸檢測(cè)陰、陽性結(jié)果判斷見表2。

表1 2019－nCoV的RdRP、E、N基因結(jié)果判斷

表2 2019－nCoV的陰、陽性結(jié)果判斷

3 新型冠狀病毒肺炎診斷

新型冠狀病毒性肺炎的診斷依據(jù)目前主要為流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、胸部影像學(xué)。流行病學(xué)史是發(fā)病2周內(nèi)有武漢市旅游史或居住史；或發(fā)病前14d內(nèi)曾經(jīng)接觸過來自武漢的發(fā)熱伴有呼吸道癥狀的患者；或有聚集性發(fā)??；或與新型冠狀病毒感染者有接觸史。新型冠狀病毒感染者是指病原學(xué)核酸檢測(cè)陽性者。胸部影像學(xué)的特點(diǎn)是早期呈現(xiàn)多發(fā)小斑片影及間質(zhì)改變，以肺外帶明顯。進(jìn)而發(fā)展為雙肺多發(fā)磨玻璃影、浸潤影，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肺實(shí)變，胸腔積液少見［12］。臨床表現(xiàn)是發(fā)熱和（或）呼吸道癥狀；或具有肺炎影像學(xué)特征；或發(fā)病早期白細(xì)胞總數(shù)正常或降低，或淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少。實(shí)驗(yàn)室檢查是發(fā)病早期外周血白細(xì)胞總數(shù)正?；驕p低，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，部分患者出現(xiàn)肝酶、LDH、肌酶和肌紅蛋白增高。部分危重者可見肌鈣蛋白增高。多數(shù)患者C反應(yīng)蛋白和血沉升高，降鈣素原正常。嚴(yán)重者D－二聚體升高、外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行性減少［13］。凡符合疑似病例標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等標(biāo)本行實(shí)時(shí)熒光RT－PCR檢測(cè)新型冠狀病毒核酸陽性；或病毒基因測(cè)序，與已知的新型冠狀病毒高度同源，便可確診為新型冠狀病毒感染。因此，對(duì)發(fā)熱病人或者疑似新型冠狀病毒感染的患者進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT－PCR核酸檢測(cè)，可以早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療或盡早與其他病毒感染者進(jìn)行鑒別診斷。

4 小 結(jié)

新型冠狀病毒（2019－nCoV）在中國武漢發(fā)現(xiàn)，傳播迅速，目前已在多個(gè)國家出現(xiàn)確診病例。核酸PCR檢測(cè)是肺炎病原學(xué)檢測(cè)方法之一，實(shí)時(shí)熒光RT－PCR核酸檢測(cè)方法，靈敏度高，特異性強(qiáng)，可以快速準(zhǔn)確的對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行檢測(cè)，為臨床早發(fā)現(xiàn)，早診斷、早治療提供重要依據(jù)。