優(yōu)選非釀酒酵母胞外酶增香釀造干白葡萄酒效果

尹 薦，陶永勝,2，孫瑋璇，陳思雨

優(yōu)選非釀酒酵母胞外酶增香釀造干白葡萄酒效果

尹 薦1，陶永勝1,2※，孫瑋璇1，陳思雨1

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，楊凌 712100；2. 陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，楊凌 712100）

為了研究非釀酒酵母胞外酶促進(jìn)葡萄酒發(fā)酵產(chǎn)香的效果，該文在愛格麗葡萄汁酒精發(fā)酵12 h后，分別添加優(yōu)選膠紅酵母（，RM）胞外酶液，優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母（，PF）胞外酶液和商業(yè)糖苷酶制劑（almond-glucosidase，AG）（10 mU/mL），以不添加酶制劑的釀酒酵母純發(fā)酵為對(duì)照，發(fā)酵過程中每24 h取樣，采用HS-SPME-GC/MS（headspace solid-phase microextraction-gas chromatography/mass spectrometry）監(jiān)測(cè)揮發(fā)性成分的生成變化。葡萄酒含糖量低于2 g/L時(shí)終止發(fā)酵，低溫滿罐密封儲(chǔ)存，次年4月，進(jìn)行葡萄酒香氣儀器和感官量化分析。胞外酶液共測(cè)得6種風(fēng)味酶活性，其中RM酶液中的-D-葡萄糖苷酶、-L-鼠李糖苷酶、-D-木糖苷酶活性均顯著（<0.05）高于PF中的，而-L-阿拉伯糖苷酶和酯酶在PF酶液中活性更高（<0.05）。發(fā)酵過程中，胞外酶處理顯著促進(jìn)了（<0.05）品種香氣和發(fā)酵香氣物質(zhì)的生成，其中RM酶液顯著提高了萜烯類物質(zhì)和苯乙基類化合物含量，其作用效果分別比商業(yè)酶處理高41.7%和31.8%，PF酶液顯著促進(jìn)了發(fā)酵香氣化合物的生成，尤其是脂肪酸乙酯含量約為對(duì)照的2倍。酒樣感官分析結(jié)果顯示，兩株酵母的胞外酶處理表現(xiàn)出各自增香釀造的優(yōu)勢(shì)，其中RM酶液促進(jìn)溫帶酸果類香氣的效果突出，PF酶液顯著提升了柑橘類香氣。研究結(jié)果為酵母風(fēng)味酶應(yīng)用于葡萄酒的增香釀造提供了理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

酶；發(fā)酵；葡萄酒；非釀酒酵母；胞外酶；增香；香氣成分

0 引 言

香氣是葡萄酒主要的風(fēng)味特征，也是影響葡萄酒感官質(zhì)量的重要因素[1]。葡萄果實(shí)自身前體物質(zhì)水解形成的品種香氣物質(zhì)，使葡萄酒具有獨(dú)特的風(fēng)味典型性。另一方面，酵母在釀酒過程中的代謝活動(dòng)產(chǎn)生發(fā)酵香氣成分對(duì)葡萄酒香氣質(zhì)量也有重要影響。因此，研究?jī)?yōu)選菌種發(fā)酵或者酶處理技術(shù)調(diào)控主要香氣物質(zhì)的生成，對(duì)于葡萄酒產(chǎn)業(yè)釀造技術(shù)革新具有重要意義。近年來，有研究采用不同的方法來提高葡萄酒的香氣質(zhì)量，如冷浸漬[2-4]，酶制劑處理[5]，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵[6-7]等。其中混菌發(fā)酵改善葡萄酒香氣質(zhì)量的研究成為本領(lǐng)域最近的熱點(diǎn)。研究表明，不同非釀酒酵母菌株[8]、接種比例[9]和發(fā)酵策略[10]均能夠?qū)ζ咸丫葡銡饣衔锷稍斐刹煌挠绊?，但是較高的非釀酒酵母接種量常常產(chǎn)生一些不良的次級(jí)代謝產(chǎn)物，破壞葡萄酒的風(fēng)味質(zhì)量[8]。研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選非釀酒酵母菌株的增香作用主要體現(xiàn)在它們分泌的風(fēng)味酶上，如-D-葡萄糖苷酶（-D-glucosidase）、-L-阿拉伯糖苷酶（-L-arabinosidase）、-D-半乳糖糖苷酶（-D-galactosidase）等[11-12]。很多研究報(bào)道，非釀酒酵母胞外酶可水解葡萄果實(shí)中的風(fēng)味前體物質(zhì)并顯著改善葡萄酒風(fēng)味特性和香氣典型性[12-15]。但目前國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域?qū)τ诎l(fā)酵過程中酵母胞外酶處理引起的香氣物質(zhì)生成規(guī)律的研究較少，優(yōu)選非釀酒酵母胞外酶促進(jìn)葡萄酒典型香氣生成的化學(xué)機(jī)制尚不清楚。本試驗(yàn)以弱香型釀酒葡萄品種愛格麗為試材，在發(fā)酵過程中添加兩株優(yōu)選非釀酒酵母胞外酶液，并以商業(yè)杏仁-D-葡萄糖苷酶制劑為對(duì)照，研究發(fā)酵過程中重要香氣物質(zhì)的生成變化規(guī)律，以期進(jìn)一步探究?jī)?yōu)選非釀酒酵母胞外酶處理促進(jìn)干白葡萄酒典型香氣生成的化學(xué)機(jī)制。研究結(jié)果以期為應(yīng)用風(fēng)味酶增香釀造葡萄酒的工藝革新提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 葡萄原料

愛格麗（Ecolly）：白色歐亞種釀酒葡萄，由西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院選育[16]。釀酒原料于2018年8月采自陜西楊凌官村葡萄基地，約260 kg，含糖量177 g/L，酸度4.2 g/L（以酒石酸計(jì)）。

1.2 酵母菌株

釀酒酵母（）：Actiflore F33活性干酵母，購于法國Laffort公司。

發(fā)酵畢赤酵母（，PF，Z9Y-3）與膠紅酵母（，RM，BEI29）：本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)選，根據(jù)該菌株在WL鑒別培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和顯微細(xì)胞形態(tài)以及經(jīng)26S rRNA D1/D2區(qū)域序列鑒定，確認(rèn)其分別為發(fā)酵畢赤酵母和膠紅酵母（序列相似度99%）。

1.3 化學(xué)試劑

分析純化學(xué)試劑：酵母浸粉、蛋白胨、吐溫80、瓊脂、無水乙醇等主要購于四川西隴化工有限公司和天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。對(duì)硝基苯基--D-葡萄糖苷（NPG）、對(duì)硝基苯基--L-阿拉伯糖苷（NPA）、對(duì)硝基苯基--L-鼠李糖苷（NPR）、對(duì)硝基苯基--D-木糖苷（NPX）、對(duì)硝基苯基-D-半乳糖糖苷（NPG）購于Sigma-Aldrich公司。PEG20000透析袋（截流分子量：8000～14000 Da）購于北京Biotopped公司。0.45m水系微孔濾膜購于天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

GC色譜純化學(xué)試劑（純度≥97%）：二氯甲烷、戊烷、甲醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸苯乙酯、水楊酸甲酯、異丁醇、1-己醇、異戊醇、異戊酸、辛酸、癸酸、苯甲醇、苯乙醇、苯甲醛、大馬酮、香茅醇等香氣物質(zhì)標(biāo)品購于Sigma-Aldrich公司。

酒樣的糖苷提取分離使用固相萃取小柱Sep-pek C18購于美國Waters公司。

杏仁-葡萄糖苷酶制劑（20～40 U/mg），購于上海源葉生物科技有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 優(yōu)選菌株胞外酶液的制備

酵母胞外酶液的制備方法參考Hu等[14]。將優(yōu)選菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中（20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖，3 g/L NH4NO3，4 g/L KH2PO4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，10 mL/L吐溫80和10 mg/L酵母浸粉），于28℃恒溫培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)72 h。然后以10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于28 ℃、150 r/min條件下擴(kuò)增培養(yǎng)72 h。隨后，將發(fā)酵液低溫離心（4 ℃，8 000 r/min，15 min）取上清液，經(jīng)0.45m膜過濾后用PEG20000透析袋濃縮備用。

1.4.2 優(yōu)選菌株胞外酶活力測(cè)定

采用pNPG法，參照Fia等[17]方法適當(dāng)修改。取750L 0.1 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH值5.0）、200L酶液和250L濃度為1 mmol/L的對(duì)應(yīng)糖苷（對(duì)硝基苯基--D-葡萄糖苷、對(duì)硝基苯基--L-阿拉伯糖苷、對(duì)硝基苯基--L-鼠李糖苷、對(duì)硝基苯基--D-半乳糖苷、對(duì)硝基苯基--D-木糖苷）于小試管中混勻，在40℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，加入1 mL濃度為1 mol/L碳酸鈉溶液終止反應(yīng)。酯酶活性的測(cè)定參考Pérez-Martín等[18]方法。將200L酶液、80L 25 mmol/L的對(duì)硝基苯基丁酸鹽與1.72 mL 0.1 mol/L檸檬酸/磷酸鹽緩沖液混勻，37℃反應(yīng)60 min，加入0.2 mL 0.5 mol/L NaOH終止反應(yīng)。于400 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，每樣重復(fù)3次。最終酶活力值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（=17.696+0.0057，2=0.9997）計(jì)算得出。酶活單位（U）定義為：40℃條件下每分鐘內(nèi)催化生成1mol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。

1.4.3 香氣糖苷提取

香氣糖苷浸提制備方法參考文獻(xiàn)Rodríguez等[19]，略有改動(dòng)。取100 mL酒樣，40℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇及易揮發(fā)性物質(zhì)，純水定容至100 mL，添加10 g/L聚乙烯基吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone, PVPP）震蕩搖勻20 min，除去色素等酚類物質(zhì)，再于4℃，10 000 r/min條件下離心20 min。所得上清液用0.45m水系微孔濾膜過濾。糖苷純化及水解方法參照Yang等[20]，依次用二氯甲烷、甲醇、超純水進(jìn)行C18固相萃取小柱活化，取定量糖苷提取液，自然重力上樣。糖苷洗脫：首先用超純水過柱，去除糖、色素、高極性雜質(zhì)物質(zhì)；再用二氯甲烷/戊烷（1∶2）過柱，洗脫游離態(tài)香氣成分；最后用甲醇/乙酸乙酯（1∶9）過柱，洗脫糖苷物質(zhì)。糖苷洗脫后液氮吹干，獲得糖苷樣品。糖苷水解：將所得糖苷樣品溶于10 mL pH值5.0的檸檬酸-磷酸緩沖溶液，加入5 U/mL杏仁-葡萄糖苷酶，于40℃恒溫水浴中酶解16 h后進(jìn)行頂空固相微萃取吸附。

1.4.4 葡萄酒釀造試驗(yàn)

愛格麗葡萄除梗、破碎后裝入20 L玻璃罐中，4 ℃下低溫浸漬24 h后壓榨取汁，添加50 mg/L的SO2，而后添加1 g/L的膨潤土下膠澄清，24 h后澄清汁接種4×106cells/mL釀酒酵母啟動(dòng)發(fā)酵，12 h后分別添加10 mU/mL（以-D-葡萄糖苷酶為標(biāo)準(zhǔn)）酵母胞外酶液和商業(yè)酶制劑[13]，混合均勻。實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)密度和溫度，控制發(fā)酵溫度16～20 ℃，每隔24 h采樣進(jìn)行香氣成分分析，在發(fā)酵旺盛期添加蔗糖使最終酒精度達(dá)到11%±0.5%，添加酒石酸調(diào)整酸度到6.0 g/L，當(dāng)還原糖含量低于2 g/L時(shí)，終止發(fā)酵，并將葡萄酒轉(zhuǎn)入干凈衛(wèi)生的玻璃罐中4℃滿罐密封貯藏。貯藏期間對(duì)葡萄酒進(jìn)行3次轉(zhuǎn)罐澄清并調(diào)整游離SO2濃度防止酒樣氧化。次年4月對(duì)葡萄酒樣品的香氣成分進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，并進(jìn)行香氣特征的感官評(píng)價(jià)。試驗(yàn)以不添加酶制劑的釀酒酵母純發(fā)酵為空白對(duì)照（CK），以添加膠紅酵母（RM）胞外酶、發(fā)酵畢赤酵母（PF）胞外酶和杏仁-D-葡萄糖苷酶制劑（AG）為處理組，每個(gè)處理重復(fù)2次。

1.4.5 GC-MS分析

葡萄酒香氣物質(zhì)采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）吸附，使用DVB/CAR/PDMS萃取纖維（50/30m涂層厚度，2 cm可伸縮長(zhǎng)度）及SPME 57330-U聯(lián)用手柄（美國Supelco公司）。15 mL頂空瓶中加入8 mL酒樣或香氣糖苷水解溶液，2.0 g NaCl，2-辛醇（內(nèi)標(biāo)，400g/L）和攪拌子，在40℃水浴中平衡15 min后，萃取纖維在40℃下攪拌吸附30 min，而后取出插入GC進(jìn)樣口，230℃解析5 min取出。每個(gè)酒樣重復(fù)2次。

GC-MS分析條件：島津GC/MS-QP2020，柱型號(hào)為DB-WAXETR（60 m×0.25 mm i.d.，涂層厚度0.25m，美國Agilent公司）。不分流進(jìn)樣，載氣為高純氦氣（99.999%），流速1.5 mL/min。柱升溫程序：40℃保持5 min，然后以2 ℃/min上升到130℃，再以5 ℃/min上升到220℃，保持10 min。進(jìn)樣口溫度230℃，連接桿溫度220℃，離子源溫度200℃，電子源電壓70 eV，質(zhì)譜為電離轟擊（EI）模式，全掃描質(zhì)譜范圍35～350 amu，掃描頻率0.2 s/次。

定性定量方法：采用標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間對(duì)比、Wiley 275.L譜庫查詢和文獻(xiàn)保留指數(shù)比對(duì)法進(jìn)行化合物定性。采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，2-辛醇為內(nèi)標(biāo)，具體定量方法參考Tao等[21]的方法。

1.4.6 感官分析

參照Tao等[22]的方法進(jìn)行，品嘗小組由20名葡萄酒專業(yè)的學(xué)生（10男，10女）組成，感官分析前對(duì)品嘗小組進(jìn)行為期一個(gè)月的葡萄酒標(biāo)準(zhǔn)香氣物質(zhì)聞香培訓(xùn)，直至小組成員對(duì)每個(gè)香氣特征正確辨別的誤差小于整體誤差的5%。感官分析試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，要求品評(píng)員用標(biāo)準(zhǔn)香氣特征中的3～4個(gè)特征詞匯來描述葡萄酒的香氣特征，并用“五點(diǎn)標(biāo)度法”量化（1為弱；2為較弱；3為中等；4為較強(qiáng)；5為強(qiáng)）。香氣特征的量化強(qiáng)度值（MF，%）為該特征詞匯的使用頻率（，%）和強(qiáng)度平均值（，%）的幾何平均數(shù)，用如下公式計(jì)算：

1.4.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理主要應(yīng)用單因素方差分析（one-way analysis of variance，One-way ANOVA）、多重比較分析（multiple comparison analysis，MCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）的方法，使用SPSS 20.0（美國SPSS公司）進(jìn)行分析，分別用于評(píng)價(jià)試驗(yàn)的重復(fù)性，不同處理間的差異性以及供試酒樣中香氣成分變化規(guī)律，常規(guī)圖表的繪制采用Office 2013、Origin 9.5（美國OriginLab公司）進(jìn)行，數(shù)據(jù)的基本統(tǒng)計(jì)分析采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 非釀酒酵母胞外酶活性分析

RM和PF胞外酶液中測(cè)得風(fēng)味酶活性如表1所示，共測(cè)出6種酶活，同一風(fēng)味酶活性在不同菌株之間存在差異。RM胞外酶的-D-葡萄糖苷酶活性（41.81 mU/mL）、-L-鼠李糖苷酶活性（18.79 mU/mL）、-D-木糖苷酶活性（15.19 mU/mL）均顯著高于PF的（<0.05），而PF胞外酶的-L-阿拉伯糖苷酶活性（15.98 mU/mL）和酯酶活性（61.17 mU/mL）顯著高于RM的（<0.05）。

表1 膠紅酵母和發(fā)酵畢赤酵母胞外酶液中的糖苷酶和酯酶活性

注：表中同一行數(shù)據(jù)后的不同字母表示處理間差異性顯著（檢驗(yàn)，< 0.05）

Note: Data followed by different letters in a row are significantly different (< 0.05) bytest

2.2 香氣成分分析

2.2.1 發(fā)酵過程中關(guān)鍵香氣成分的生成規(guī)律分析

圖1所示為重要的葡萄酒品種香氣物質(zhì)（C6化合物和萜烯類物質(zhì)）的發(fā)酵生成規(guī)律。由圖可知，風(fēng)味酶處理促進(jìn)了品種香氣物質(zhì)的發(fā)酵生成，對(duì)應(yīng)的結(jié)合態(tài)化合物含量隨著其游離態(tài)的增加而減少，這表明了結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)在發(fā)酵過程中的水解與游離態(tài)香氣化合物的生成有直接關(guān)聯(lián)。值得注意的是，RM酶處理促進(jìn)游離態(tài)萜烯類物質(zhì)的生成效果顯著優(yōu)于其他處理（<0.05）。由于萜烯類物質(zhì)是葡萄酒花香和甜果香的重要貢獻(xiàn)者，所以非釀酒酵母胞外酶處理具有明確的增香功能。

圖1 主要品種香氣化合物的生成規(guī)律

發(fā)酵香氣成分的變化規(guī)律如圖2所示。釀造過程中，高級(jí)醇含量整體上呈持續(xù)上升趨勢(shì)，即隨著發(fā)酵的進(jìn)行，高級(jí)醇含量逐漸升高，發(fā)酵末期和儲(chǔ)藏期含量趨于穩(wěn)定。但不同于其他3組，PF酶液處理的酒樣在貯藏階段高級(jí)醇含量有所降低，這可能是由于高級(jí)醇參與酯類物質(zhì)生成導(dǎo)致的。苯乙基類化合物含量在發(fā)酵過程中持續(xù)升高，且第1～4天為該化合物的高速增長(zhǎng)期，不同處理酒樣間苯乙基類化合物變化趨勢(shì)相近。此外，脂肪酸含量變化趨勢(shì)為發(fā)酵中期濃度達(dá)到最大值，隨后持續(xù)降低直至次年4月。值得注意的是，相對(duì)于其他酒樣而言，添加PF胞外酶的酒樣中脂肪酸含量在發(fā)酵過程中變化更加激烈。對(duì)酯類物質(zhì)的變化規(guī)律分析表明，乙酸酯含量最高，約為脂肪酸乙酯和其他酯類總量的3～4倍。在RM、AG和CK酒樣中，乙酸酯變化趨勢(shì)是先逐漸增加達(dá)到峰值基本保持穩(wěn)定，而在PF酒樣中則呈現(xiàn)出持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，即便在貯藏階段，仍有小幅度乙酸酯類的累積。脂肪酸乙酯在發(fā)酵啟動(dòng)后的6～7 d達(dá)到峰值，隨后其含量具有小幅度下降。另外，供試酒樣中，其他酯類化合物呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，這主要是由于乳酸乙酯和丁二酸二乙酯的生成在陳釀時(shí)期仍然較活躍。

圖2 酒樣中主要發(fā)酵香氣化合物的生成規(guī)律

2.2.2 不同處理酒樣中的香氣成分分析

供試酒樣貯藏180 d后對(duì)香氣成分進(jìn)行定性定量分析，共檢測(cè)出54種香氣成分。其中，品種香氣成分11種，包括C6化合物2種，萜烯類化合物5種，C13去甲類異戊二烯3種和酚酸酯1種；發(fā)酵香氣成分43種，包括高級(jí)醇8種，乙酸酯5種，脂肪酸乙酯10種，其他酯類8種，脂肪酸7種和苯乙基類化合物5種。共有16種揮發(fā)性成分的含量超過其嗅覺閾值，即氣味活性值（OAV, odor activity value）大于1，13種OAV在0.1～1之間。OAV大于0.1的潛在氣味活性成分及其含量如表2所示。

分析可見，與對(duì)照組相比RM胞外酶液處理有促進(jìn)愛格麗葡萄酒品種香氣成分釋放的作用。從品種香氣化合物總含量變化上來看，RM酶處理對(duì)品種香氣物質(zhì)總量的提升效果顯著。具體而言，RM酶液對(duì)C13去甲類異戊二烯含量有顯著提升作用。此外，盡管非釀酒酵母胞外酶和商業(yè)杏仁-D-葡萄糖苷酶處理均能促進(jìn)萜烯類物質(zhì)的釋放，但RM酶處理的酒樣中萜烯類化合物含量顯著高于其他3組，其作用效果比商業(yè)酶處理組高41.7%，這一增量主要?dú)w功于RM酒樣中具有含量較高的橙花醇氧化物（40g/L）。另一方面，非釀酒酵母胞外酶對(duì)發(fā)酵香氣成分的生成也有顯著影響。由表2可知，非釀酒酵母胞外酶處理均可提升酒中高級(jí)醇含量，這一作用是商業(yè)杏仁-D-葡萄糖苷酶不能替代的，其中RM胞外酶對(duì)高級(jí)醇含量的提升作用顯著（<0.05）。本試驗(yàn)共檢測(cè)出游離態(tài)苯乙基類化合物5種，含量約占發(fā)酵香氣總量的1/3，是發(fā)酵產(chǎn)物中含量?jī)H次于高級(jí)醇的一類香氣物質(zhì)。其中，RM胞外酶處理酒樣中的苯乙基類化合物含量顯著（<0.05）高于其他3組，與商業(yè)酶處理組相比，其作用效果高31.8%。此外，在貯藏180 d后，PF胞外酶液處理的酒樣中脂肪酸含量高于對(duì)照組，但低于AG處理。值得注意的是，不同于RM胞外酶促進(jìn)品種香氣及其他發(fā)酵香氣產(chǎn)生方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)，PF胞外酶在促進(jìn)乙酸酯類和脂肪酸乙酯類生成方面有突出貢獻(xiàn)，尤其是對(duì)于乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯等的含量有顯著（<0.05）的提升作用。

2.3 葡萄酒香氣特征與氣味成分的關(guān)聯(lián)分析

圖3所示是感官分析得出的供試酒樣中5種典型的香氣特征。與對(duì)照相比，非釀酒酵母胞外酶處理顯著（<0.05）提升了愛格麗干白葡萄酒中的柑橘、溫帶酸果和花香特征。其中，PF酶處理酒樣中柑橘類香氣（MF=68.98%）強(qiáng)于RM酶處理，而RM酒樣中溫帶酸果類香氣（59.74%）顯著高于PF酒樣的。此外，盡管酶處理也提升了熱帶水果的香氣強(qiáng)度，但處理間差異不顯著；酶處理具有降低供試酒樣生青類香氣的作用。

表2 酒樣中的潛在氣味活性物質(zhì)

注：CK：對(duì)照；PF：發(fā)酵畢赤酵母胞外酶處理；RM：膠紅酵母胞外酶處理；AG：商業(yè)杏仁-D-葡萄糖苷酶制劑處理；表中同一行數(shù)據(jù)后的不同字母表示處理間差異性顯著（Duncan檢驗(yàn)，< 0.05）；OAV（氣味活性值）=香氣化合物濃度/該香氣化合物氣味閾值；ND：沒有檢測(cè)到；香氣閾值參考文獻(xiàn)：A（Peng等）[4]；B（Guth等）[23]；C（Simpson等）[24]；D（Maavse等）[25]；E（Tao等）[22]；F（Crandles等）[26]；G（Wang等）[12]

Note: CK: control group; PF: treated with extracellular enzyme from; RM: treated with extracellular enzyme from; AG: treated with commercial glycosidase; Data followed by different letters in a row are significantly different (< 0.05) by Duncan test; OAV (odor activity value) equals the ratio of the aroma compound concentration to its odor threshold; ND: Not detected; Odor threshold reference：A (Peng et al.)[4]; B (Guth et al.)[23]; C (Simpson et al.)[24]; D (Maavse et al.)[25]; E (Tao et al.)[22]; F (Crandles et al.)[26]; G (Wang et al.)[12]

注：*表示處理間差異性顯著（Duncan檢驗(yàn)，P < 0.05）。

通過主成分分析揭示供試酒樣香氣特征與香氣成分之間的關(guān)聯(lián)，分析結(jié)果見圖4。由圖可見，前兩個(gè)主成分分別占數(shù)據(jù)總體方差的47.74%和30.50%，萜烯類、C13去甲類異戊二烯、苯乙基類化合物、高級(jí)醇、乙酸酯、脂肪酸乙酯、柑橘類、溫帶酸果和RM酶處理酒樣主要分布于第一象限，而C6化合物、脂肪酸、花香、熱帶水果特征分布在第四象限，PF與AG酶處理酒樣分別處于第二主成分的正、負(fù)兩端，而CK酒樣在第一主成分的負(fù)向端。分析可得，PF酶處理有利于高級(jí)醇、乙酸酯、脂肪酸乙酯，柑橘類香氣特征增加，而RM酶處理對(duì)酚酸酯、C13去甲類異戊二烯、苯乙基類、萜烯類化合物的生成促進(jìn)作用最大，酒樣的溫帶酸果、熱帶水果、花香特征最好。

圖4 前兩個(gè)主成分上葡萄酒香氣指標(biāo)的載荷及酒樣的分布

3 討 論

來源于葡萄中的品種香氣成分對(duì)葡萄酒典型香氣特征的表現(xiàn)具有重要的影響，它們常常以結(jié)合態(tài)前體物質(zhì)的形式存在。發(fā)酵過程中，酵母菌生長(zhǎng)代謝活動(dòng)產(chǎn)生的糖苷酶是水解釋放游離態(tài)香氣苷元反應(yīng)的主要催化劑[27]。Lopez等[28]研究表明，畢赤酵母屬具有較高的D-葡萄糖苷酶和D-木糖苷酶活性，并能在釀造過程中有效增加萜烯類香氣的含量。本研究供試非釀酒酵母菌株是根據(jù)產(chǎn)D-葡萄糖苷酶的活性篩選的發(fā)酵畢赤酵母和膠紅酵母，其胞外酶中共測(cè)有5種風(fēng)味糖苷酶活性，其中D-葡萄糖苷酶和D-半乳糖苷酶活性較高。研究發(fā)現(xiàn)，糖苷酶的活性受到還原糖含量的影響，較高的糖含量對(duì)糖苷酶活力具有抑制作用[29]。在本研究中，品種香氣的含量變化差異主要表現(xiàn)在啟動(dòng)發(fā)酵后的第2天，這可能是由于非釀酒酵母胞外酶也受到還原糖含量的影響，其水解作用在還原糖含量降低時(shí)得以發(fā)揮。在非釀酒酵母胞外酶的作用下，葡萄果實(shí)中的結(jié)合態(tài)品種香氣前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為C6化合物、萜烯類、C13-去甲類異戊二烯類、酚酸酯類等多種游離態(tài)品種香氣成分。其中，C6化合物與葡萄酒生青類香氣有關(guān)，主要來源于長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸和香氣糖苷前體物質(zhì)的降解[30]。Wang等[12]在膠紅酵母和釀酒酵母混菌發(fā)酵的愛格麗葡萄酒中檢出的C6化合物含量占品種香氣物質(zhì)總量的一半以上，并發(fā)現(xiàn)適當(dāng)比例的膠紅酵母在混合發(fā)酵中能提升葡萄酒中C6化合物的含量，這與本研究采用其胞外酶處理的結(jié)果一致。萜烯類化合物，如里那醇（linalool）、-萜品醇（-terpineol）等對(duì)呈現(xiàn)葡萄酒花香、甜果香有積極作用[30]。Cabaroglu等[5]發(fā)現(xiàn)添加外源糖苷酶能夠促進(jìn)萜烯類香氣糖苷的水解并釋放更多香氣活性成分，與先前研究結(jié)果相同，本研究中非釀酒酵母胞外酶液顯著促進(jìn)了游離態(tài)萜烯類香氣成分的生成，尤其是RM酶處理。

除此之外，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性成分也對(duì)葡萄酒的香氣表現(xiàn)具有重要的調(diào)整作用。有研究表明，高級(jí)醇含量受發(fā)酵條件、成分和葡萄品種等因素的影響[30]，過高含量的高級(jí)醇會(huì)降低酒中的新鮮水果香氣，使未陳釀的紅葡萄酒中表現(xiàn)出蔬菜和青椒味[31-32]，從而導(dǎo)致酒的香氣質(zhì)量下降。本研究中，高級(jí)醇是所有發(fā)酵香氣物質(zhì)中含量最多的香氣物質(zhì)，約占發(fā)酵香氣總含量的55%，酶處理酒樣中高級(jí)醇雖有升高，但總體含量未對(duì)香氣質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響，葡萄酒具有優(yōu)雅的醇香和花香。酵母細(xì)胞通過Ehrlich代謝途徑分解氨基酸，產(chǎn)生高級(jí)醇[33]。本試驗(yàn)中PF和RM酶液分別對(duì)異丁醇和異戊醇的含量提升最多，可能與供試非釀酒酵母菌株的胞外酶促進(jìn)了酵母對(duì)纈氨酸和亮氨酸的分解代謝能力有關(guān)。脂肪酸參與酯類物質(zhì)生成的動(dòng)態(tài)平衡反應(yīng)，它是合成酯類風(fēng)味化合物不可或缺的前體物質(zhì)[34]，其含量對(duì)于新鮮水果香氣特征的感知至關(guān)重要[31]。本研究中，脂肪酸在酒精發(fā)酵過程中整體變化趨勢(shì)是先增高后減少，其變化幅度在RM酶和PF酶處理的酒樣更加劇烈，推測(cè)這可能是胞外酶處理促進(jìn)了酵母脂肪酸的代謝生成，過多的脂肪酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化生成脂肪酸乙酯造成的。前人研究報(bào)道了辛酸通過促進(jìn)EHT1和EEB1基因表達(dá)進(jìn)而提高酯酶活性[35]，但酯酶活性對(duì)脂肪酸含量的影響尚待進(jìn)一步研究。Renault等[36]報(bào)道了葡萄酒中的果香復(fù)雜性與非釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酯類物質(zhì)密切相關(guān)。非釀酒酵母在參與葡萄酒釀造過程中也產(chǎn)生酯酶[37]，其中酯酶活性與維持酯類合成和水解平衡的酯類化合物含量密切相關(guān)[38]。Ma等[39]分析比較了發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母的酯酶活力，結(jié)果表明發(fā)酵畢赤酵母比釀酒酵母具有更強(qiáng)的酯酶活性。本研究酵母胞外酶的酶活分析結(jié)果印證了先前的研究結(jié)果，PF酶處理對(duì)于提高乙酸酯和脂肪酸乙酯含量具有明顯的優(yōu)勢(shì)，這可能與發(fā)酵畢赤酵母胞外酶中酯酶活性顯著高于膠紅酵母胞外酶中的酯酶活性有關(guān)。隨著釀酒工藝技術(shù)的發(fā)展和市場(chǎng)對(duì)果香型葡萄酒產(chǎn)品的需求增加，優(yōu)選非釀酒酵母越來越受到研究人員和釀酒師的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)選非釀酒酵母與釀酒酵母的混合發(fā)酵可以有效增加葡萄酒中的酯類物質(zhì)含量，從而增加葡萄酒的果香特征。但非釀酒酵母參與的混菌發(fā)酵增香的同時(shí)，也具有產(chǎn)生雜味的風(fēng)險(xiǎn)[8,40]。本研究應(yīng)用非釀酒酵母胞外酶液進(jìn)行葡萄酒的增香釀造，有效避免了非釀酒酵母過多的生物代謝產(chǎn)生的負(fù)面風(fēng)味，探索了其促進(jìn)葡萄酒香氣生成的化學(xué)機(jī)制。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)在非釀酒酵母參與的葡萄酒混菌發(fā)酵具有明顯的增香釀造效果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究了非釀酒酵母胞外酶處理對(duì)干白葡萄酒中香氣成分生成的調(diào)控機(jī)制。膠紅酵母和發(fā)酵畢赤酵母的胞外酶液中均可檢測(cè)到-D-葡萄糖苷酶、-L-阿拉伯糖苷酶、-L-鼠李糖苷酶、-D-半乳糖苷酶、-D-木糖苷酶和酯酶，酶活在不同菌株之間存在差異。胞外酶處理顯著提升了葡萄酒的香氣質(zhì)量，尤其是花香特征和溫帶酸果類香氣。其中發(fā)酵畢赤酵母胞外酶對(duì)大多數(shù)發(fā)酵香氣化合物的生成有積極影響，而膠紅酵母胞外酶能顯著（<0.05）促進(jìn)高級(jí)醇、苯乙基類化合物、乙酸酯、脂肪酸乙酯生成，兩株非釀酒酵母胞外酶均能提升品種香氣成分（游離態(tài)C6化合物、萜烯類物質(zhì)）的含量。總的來看，釀造過程中添加非釀酒酵母胞外酶能夠改善干白葡萄酒香氣，所釀酒具有較好的果香和花香。本研究結(jié)果可以為優(yōu)選非釀酒酵母胞外酶應(yīng)用于葡萄酒增香釀造提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

[1]Sánche E, Alonso R, González M A, et al. Characterisation of free and glycosidically bound aroma compounds of La Mancha Verdejo white wines[J]. Food Chemistry, 2015, 173: 1195－1202.

[2]Palomo E S, Gonzalez-Vinas M A, Perezcoello M S, et al. Aroma potential of Albillo wines and effect of skin-contact treatment[J]. Food Chemistry, 2007, 103(2): 631－640.

[3]Parenti A, Spugnoli P, Gori C, et al. Effects of cold maceration on red wine quality from Tuscan Sangiovese grape[J]. European Food Research and Technology, 2004, 218(4); 360－366.

[4]Peng C T, Wen Y, Tao Y S, et al. Modulating the formation ofwine aroma by prefermentative freezing process[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(7): 1542－1553.

[5]Cabaroglu T, Selli S, Canbas A. Wine flavor enhancement through the use of exogenous fungal glycosidases[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2003, 33: 581－587.

[6]王倩倩，覃杰，馬得草，等. 優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵增香釀造愛格麗干白葡萄酒[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，51(11)：2178－2192. Wang Qianqian, Qin Jie, Ma Decao, et al. Aroma enhancement of Ecolly dry white wine by co-inoculation of selectedand[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2018, 51(11): 2178－2192. (in Chinese with English abstract)

[7]Loira I, Morata A, Suarezlepe J A, et al. Use ofandstrains in mixed and sequential fermentations to improve red wine sensory quality[J]. Food Research International, 2015, 76: 325－333.

[8]Comitini F, Gobbi M, Ciani M, et al. Selected non-wine yeasts in controlled multistarter fermentations with[J]. Food Microbiology, 2011, 28(5): 873－882.

[9]Medina K, Boido E, Carrau F, et al. Increased ?avour diversity of Chardonnay wines by spontaneous fermentation and co-fermentation with[J]. Food Chemistry, 2013, 141(3): 2513－2521.

[10]Hu K, Jin G J, Tao Y S, et al. Wine aroma response to different participation of selectedin mixed fermentation with[J]. Food Research International, 2018, 108: 119－127.

[11]Jolly N P, Varela C, Pretorius I S. Not your ordinary yeast: Non-yeasts in wine production uncovered[J]. Fems Yeast Research, 2014, 14(2): 215－237.

[12]Wang X C, Li A H, Tao Y S, et al. Evaluation of aroma enhancement for “Ecolly” dry white wines by mixed inoculation of selectedand[J]. Food Chemistry, 2017, 228: 550－559.

[13]Hu K, Qin Y, Tao Y S, et al. Potential of glycosidase from non-isolates for enhancement of wine aroma[J]. Journal of Food Science, 2016, 814: 935－943.

[14]Hu K, Zhu X L, Tao Y S, et al. A novel extracellular glycosidase activity from: Its application potential in wine aroma enhancement[J]. Letters in Applied Microbiology, 2016. 62(2): 169－176.

[15]朱曉琳. 糖苷酶處理葡萄酒釀造過程中香氣物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2017. Zhu Xiaolin. Evolution of Aroma Compounds During Winemaking Process Through the Treatment With Glycosidases[D]. Yangling：Northwest A&F University, 2017. (in Chinese with English abstract)

[16]李華，張振文，王華，等. 葡萄新品種：愛格麗[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2000(1)：75. Li Hua, Zhang Zhenwen, Wang Hua, et al. A new grape variety-Ecolly[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2000(1): 75. (in Chinese with English abstract)

[17]Fia G, Canuti V, Rosi I. Evaluation of potential side activities of commercial enzyme preparations used in winemaking[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2014, 49(8): 1902－1911.

[18]Pérez-Martín F, Sese?a S, Izquierdo P M, et al. Esterase activity of lactic acid bacteria isolated from malolactic fermentation of red wines[J]. International Journal of Food Microbiology, 2013, 163(2), 153–158

[19]Rodríguez J J, Cabrera H M, Pérez J P, et al. Bound aroma compounds of gual and listán blanco grape varieties and their influence in the elaborated wines[J]. Food Chemistry, 2011, 127(3): 1153－62.

[20]Yang Y, Jin G J, Tao Y S, et al. Chemical profiles and aroma contribution of terpene compounds in Meili (L.) grape and wine[J]. Food Chemistry, 2019, 284: 155－161.

[21]Tao Y S, Li H, Wang H. Volatile compounds of young Cabernet Sauvignon red wine from Changli County (China) [J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2008, 21(8): 689－694.

[22]Tao Y S, Liu Y Q, Li H. Sensory characters of Cabernet Sauvignon dry red wine from Changli County (China)[J]. Food Chemistry, 2009, 114(2): 565－569.

[23]Guth H. Quantitation and sensory studies of character impact odorants of different white wine varieties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45(8): 3027－3032.

[24]Simpson R, Mille G. Aroma composition of aged Riesling wine[J]. Vitis, 1983, 22(1): 51－63.

[25]Maarse H. Volatile compounds in foods and beverages[M].Oxfordshire: Taylor and Francis, 2017.

[26]Crandles M, Reynolds A G, Khairallah R, et al. The effect of yeast strain on odor active compounds in Riesling and Vidal blanc icewines[J]. LWT - Food Science and Technology, 2015, 64(1): 243－258.

[27]Hernández L F, Espinosa J C, Fernández-González M, et al. Betaglucosidase activity in awine strain[J]. International Journal of Food Microbiology, 2003, 80(2): 171－176.

[28]Lopez M C, Mateo J J, Maicas S. Screening of-glucosidase and-xylosidase activities in four non-yeast isolates[J]. Journal of Food Science, 2015, 80(8): 1696－1704.

[29]Madrigal T, Maicas S, Tolosa J J M. Glucose and ethanol tolerant enzymes produced byisolates from enological ecosystems[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2013, 64: 126－133.

[30]Moreno-Arribas M V,Polo M C. Wine Chemistry and Biochemistry[M]New York: Springer Science Business Media, 2009.

[31]San-Juan F, Ferreira V, Cacho J, et al. Quality and aromatic sensory descriptors (mainly fresh and dry fruit character) of Spanish red wines can be predicted from their aroma-active chemical composition[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59: 7916－7924.

[32]Cameleyre M, Lytra G, Tempere S, et al. Olfactory impact of higher alcohols on red wine fruity ester aroma expression in model solution[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(44): 9777－9788.

[33]Anthony L R, Paul K B, Peter S S, et al. Origins of grape and wine aroma. part 1. chemical components and viticultural impacts[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2014, 65: 1－24.

[34]Perestrelo R, Fernandes A, Albuquerque F F, et al. Analytical characterization of the aroma ofred wine: Identification of the main odorants compounds[J]. Analytical Chimistry Acta, 2006, 563(2): 154－164.

[35]Saerens S M G, Delvaux F, Verstrepen K J, et al. Parameters affecting ethyl ester production byduring fermentation[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74: 454－461.

[36]Renault P, Coulon J, De R G, et al. Increase of fruity aroma during mixedwine fermentation is linked to specific esters enhancement[J]. International Journal of Food Microbiology, 2015, 207: 40－48.

[37]Ba?der S, ?z?elik F. Effects of non-yeasts on wine aroma[J]. GIDA - Journal of Food, 2009, 34(4): 239－244.

[38]Sumby K M, Grbin P, Jiranek V. Microbial modulation of aromatic esters in wine: Current knowledge and future prospects[J]. Food Chemistry, 2010, 121(1): 1－16.

[39]Ma D C, Yan X, Wang Q Q, et al. Performance of selectedand its excellular enzyme in co-inoculation withfor wine aroma enhancement[J]. LWT-Food Science and Technology, 2017, 86: 361－370.

[40]Mateo J, Maicas S. Application of non-saccharomyces yeasts to wine-making process[J]. Fermentation, 2016, 2(3): 14－26.

Effect of aroma enhancement for dry white wine by selected non-extracellular enzymes

Yin Jian1, Tao Yongsheng1,2※, Sun Weixuan1, Chen Siyu1

(1.,,712100,; 2.,712100,)

Aroma compounds are mainly produced during brewing, which is involved various yeast flavor enzymes. The potential application of yeast flavoring enzyme in brewing was evaluated through the study on the aroma enhancement of dry white wine treated by extracellular enzymes from two non-strains. Ecolly grape is a kind of white variety with weak flavor. It was used as wine making material in experiment, and the grape juice was fermented by commercialstrain. After 12 hours, the extracellular enzymes from selected(PF) and(RM) strains were added (10 mU/mL), as well as the commercial almond-glucosidase (AG). The pure fermentation ofwithout enzyme treatment was used as the control. During the fermentation, the juice was sampled every 24 h to detect sugar content and aroma compounds. Volatile compounds were extracted by headspace solid-phase microextraction (HS-SPME), and then were desorbed and detected by gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS). Grape juice alcohol fermentation was completed when the residue sugar was less than 2 g/L, and the clear wine was racked to a clean bottle and stored at low temperature. In April of the next year, wine aroma compounds of wine were identified and quantified by HS-SPME-GC-MS, and aroma characteristics were analyzed and quantified by well-trained panelists. Results showed that six flavor enzyme activities were detected in both PF and RM extracellular enzymes. The activities of-D-glucosidase,-L-rhamosidase, and-D-xylosidase in RM enzymes were significantly higher than those in PF enzymes (< 0.05), while the activities of-L-arabinosidase and esterases in PF enzymes were significantly higher than those in RM enzymes (< 0.05). In general, both the treatments of PF and RM extracellular enzymes improved the contents of varietal and fermentative volatiles during fermentation significantly (< 0.05). Compared with AG treatment, the concentration of terpenes and phenylethyls increased by 41.7% and 31.8%, respectively. Furthermore, the production of most fermentative volatiles was promoted by PF enzymes, particularly fatty acid ethyl esters. The content of fatty acids ethyl esters in PF treatment was almost twice as much as that in the control. It is worth to be noted that the effect of aroma enhancement for dry white wine was different between PF and RM enzymes treatments according to sensory analysis results. Two kinds of extracellular enzymes of non-showed their respective advantages in aroma improvement. RM enzymes enhanced temperate sour fruits aroma type, while citrus attribute was strengthened by PF enzymes. In summary, the treatment of two sample non-extracellular enzymes had the clear aroma enhancement effect for dry white wine. The selected PF and RM extracellular enzymes had different flavor enzymes profiles, then their enzymes treatments during wine alcohol fermentation would bring out different improvements of varietal and fermentative aroma compounds. This results led to the different effects of aroma enhancement for dry white wine. This work would give the theoretical and practical guidance to the wine making for aroma enhancement by yeast flavor enzymes.

enzymes; fermentation; wine; non-; extracellular enzyme; aroma enhancement; aroma compound

尹 薦，陶永勝，孫瑋璇，陳思雨. 優(yōu)選非釀酒酵母胞外酶增香釀造干白葡萄酒效果[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2020，36(4)：278－286. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.033 http://www.tcsae.org

Yin Jian, Tao Yongsheng, Sun Weixuan, Chen Siyu. Effect of aroma enhancement for dry white wine by selected non-extracellular enzymes[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(4): 278－286. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.033 http://www.tcsae.org

2019-10-28

2019-12-13

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31771966）；科技部發(fā)展改革專項(xiàng)（106001000000150012）；新疆建設(shè)兵團(tuán)重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃（2019AB025）

尹 薦，主要進(jìn)行葡萄酒、果酒釀造學(xué)研究。Email：yinj983001@163.com

陶永勝，博士，教授，主要進(jìn)行葡萄酒釀造與風(fēng)味化學(xué)研究。Email：taoyongsheng@nwafu.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.04.033

TS262.6

A

1002-6819(2020)-04-0278-09