廣東石豆蘭不同溶劑提取物抗氧化及與總黃酮、總酚含量的關(guān)系

苗永美 簡(jiǎn) 興 汪 雁 徐榮華 錢立生 于慶才

(1安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2安徽科技學(xué)院建筑學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

石豆蘭屬(Bulbophyllum)為蘭科(Orchidaceae)多年生植物，具有發(fā)達(dá)的橫走莖，假鱗莖肉質(zhì)，卵球型，分散著生在橫走莖上，主要分布在廣東、廣西、福建、浙江、江西、貴州、云南等地。石豆蘭全草或假鱗莖均可入藥[1]，在民間有著悠久的藥用和食用歷史，在廣東沿海及香港、澳門地區(qū)常作為偽石斛使用。石豆蘭屬植物具有抗菌、消炎、抗氧化和抗膽堿脂酶活性等作用[2-3]。此外，吳斌等[4]研究證明廣東石豆蘭乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物對(duì)人體腫瘤細(xì)胞(Hela)生長(zhǎng)有殺傷作用；Xu 等[5]研究證實(shí)密花石豆蘭中bulbophythrins A(1)和B (2)對(duì)人體白血病細(xì)胞、肺腺細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。生物體進(jìn)行有氧代謝發(fā)生氧化還原反應(yīng)時(shí)，產(chǎn)生的羥基自由基會(huì)引發(fā)不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷膜結(jié)構(gòu)及功能并引發(fā)各類疾病，超氧離子自由基能損傷蛋白質(zhì)和核酸等生命大分子，導(dǎo)致各種疾病，同時(shí)自由基也是引起機(jī)體衰老的原因之一[6]。

植物是人體外源性抗氧化物質(zhì)的最重要來源，其提取物的抗氧化研究與開發(fā)利用日益受到廣泛重視。目前已研究了王棗子[7]、文冠果[8]、金花葵[9]等植物不同提取物的抗氧化性及其與有效成分的關(guān)系。研究表明，石豆蘭屬植物含有黃酮、酚酸、菲類、聯(lián)芐、苯丙素、甾體和揮發(fā)性等成分[10-11]，與親緣屬石斛屬植物相比，石豆蘭屬植物的研究尚淺，僅在藥用成分分離鑒定、提取物藥理方面開展過少量研究[2-5，12]，對(duì)廣東石豆蘭不同部位極性提取物的抗氧化活性的研究更少。因此，本研究對(duì)廣東石豆蘭甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物的抗氧化活性與總黃酮、總酚含量的相關(guān)性進(jìn)行分析，以期明確廣東石豆蘭抗氧化活性物質(zhì)，為更好地開發(fā)和利用該植物提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石豆蘭鮮樣，采自福建屏南鴛鴦獼猴自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定屬于廣東石豆蘭(B.kwangtungense)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%)、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞98%)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、菲啰嗪均為Sigma 分裝試劑，上海伊卡生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；QE-100 中草藥粉碎機(jī)，浙江屹立工貿(mào)有限公司；85-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；R205B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申順生物科技有限公司；HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市金城國(guó)盛試驗(yàn)儀器廠；ThermoHeraeus Multifuge X1R 冷凍離心機(jī)、T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同溶劑提取物的制備 鱗莖洗凈、切成2 mm 左右的薄片，50℃烘干、粉碎，依次過40 目和60目篩，收集干粉備用。精密稱取3.0 g 干粉，置于100 mL 圓底燒瓶，按1∶20 料液比分別加入70%甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯、丙酮，于70℃回流2次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至約5 mL，室溫?fù)]發(fā)至干，得4種提取物。以無水乙醇為溶劑，配制1 mg·mL-1的樣品原液，4℃密封保存。

1.3.2 總黃酮含量的測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用Al(NO3)3-NaNO2法[13]。分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 0.25 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于不同試管中，蒸餾水補(bǔ)至5 mL，然后加入0.3 mL 5% NaNO3溶液，搖勻，靜置6 min，再加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻、靜置6 min，最后加入2 mL 4% NaOH溶液，蒸餾水補(bǔ)齊至10 mL，充分搖勻，靜置10 min，于510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 總黃酮含量測(cè)定 各樣品原液稀釋10倍，按1.3.2.1的方法測(cè)定吸光度值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總黃酮含量，以每克石豆蘭含有相當(dāng)于蘆丁的毫克數(shù)(mg·g-1)表示。

1.3.3 總酚含量的測(cè)定

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用福林酚法[14]。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 0.05 mg·mL-1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液于不同試管中，蒸餾水補(bǔ)至1 mL，然后加入1.2 mL 7.5% Na2CO3溶液，混勻，靜置2 min，最后加入1.8 mL 0.1 mol·L-1福林酚，混勻，靜置30 min，于765 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 總酚含量測(cè)定 各樣品原液稀釋10倍，按1.3.3.1的方法測(cè)定吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算總酚含量，以每克石豆蘭含有相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)(mg·g-1)表示。

1.3.4 抗氧化活性的測(cè)定 用乙醇配制濃度為1 mg·mL-1的4種提取物母液，稀釋成5個(gè)濃度梯度(100、200、300、400、500 μg·mL-1)，分別編號(hào)1～5。樣品液的總還原力、DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力(分別以相應(yīng)L-抗壞血酸為陽性對(duì)照)和Fe2+螯合能力(以EDTA為陽性對(duì)照)的測(cè)定參考苗永美等[15]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及繪圖采用Microsoft Office Excel 2010軟件，方差分析及多重比較采用SPSS 19.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取物中總黃酮和總酚含量比較

以質(zhì)量濃度(X)對(duì)吸光度值(A)進(jìn)行繪圖、回歸分析，得黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=7.428 6X-0.008 4(R2=0.999 8)，線性范圍為0.025～0.150 mg·mL-1；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=15.63X-0.010 3(R2=0.998 7)，線性范圍為0.01～0.05 mg·mL-1。由表1可知，4種溶劑提取物中總酚含量比總黃酮含量高；乙醇提取物中總黃酮含量顯著高于其他溶劑(P＜0.05)，乙酸乙酯提取物中總黃酮含量最低，而甲醇與丙酮提取物中總黃酮含量差異不顯著。甲醇和乙醇對(duì)總酚提取率較高，顯著高于另外2種提取劑，但甲醇與乙醇提取物中的總酚含量差異不顯著，乙酸乙酯的總酚提取率最低。由此可知，醇提取尤其是乙醇對(duì)2種成分提取效果較好，乙酸乙酯的提取效果較差。

2.2 不同溶劑提取物的抗氧化性分析

2.2.1 總還原力 由圖1可知，4種溶劑提取物均具有一定的還原能力，總還原力隨溶劑提取物濃度的增加而逐漸增大，總還原力介于0.006～0.427之間，各濃度不同溶劑提取物的總還原力均顯著低于陽性對(duì)照。將濃度梯度提取物的還原力擬合得到線性方程，計(jì)算還原力為0.5時(shí)對(duì)應(yīng)的提取物質(zhì)量濃度(A0.5)。L-抗壞血酸的A0.5為174.87 μg·mL-1，甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯提取物的A0.5分別為614.38、578.11、565.75、716.14 μg·mL-1，4種溶劑提取物的總還原力分別為L(zhǎng)-抗壞血酸的28.46%、30.25%、30.91%、24.42%。顯著性分析表明，同一溶劑提取物濃度下，丙酮提取物的總還原力顯著高于其他溶劑，乙酸乙酯提取物的總還原力最弱。

表1 不同溶劑提取物中總黃酮和總酚含量Table1 The content of total flavonoids and total phenols in different solvent extracts /(mg·g-1)

圖1 不同溶劑提取物的總還原力Fig.1 Total reducing power of different solvent extracts

2.2.2 DPPH自由基清除能力 由圖2可知，4種溶劑提取物對(duì)DPPH自由基均有一定的清除能力，清除能力隨著溶劑提取物濃度增加逐漸增強(qiáng)。甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH自由基清除率達(dá)到50%時(shí)所需的效應(yīng)濃度(EC50) 分別為293.25、106.22、285.29和59.98 μg·mL-1，4種溶劑提取物清除DPPH自由基能力分別是L-抗壞血酸的6.41%、17.70%、6.59%、31.55%。顯著性分析表明，同一溶劑提取物濃度下4種溶劑對(duì)DPPH自由基清除能力相互之間差異顯著，據(jù)EC50乙酸乙酯提取物的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，而甲醇提取物最弱。

圖2 不同溶劑提取物的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH free radical scavenging rate of different solvent extracts

圖3 不同溶劑提取物的羥基自由基清除率Fig.3 Hydroxy free radical scavenging rate of different solvent extracts

2.2.3 羥自由基清除能力 由圖3可知，4種溶劑提取物對(duì)羥基自由基均有一定的清除能力，除100 μg·mL-1甲醇提取物的羥基自由基清除力顯著高于同濃度的L-抗壞血酸外，其他濃度溶劑提取物組的羥基自由基清除能力均顯著低于L-抗壞血酸。4種溶劑提取物的羥基自由基提高清除率均隨著溶劑提取物濃度增加其增幅較小，線性方程的斜率反應(yīng)了羥基自由基清除率的變化幅度，斜率越大變化幅度越大，4種溶劑提取物濃度在100～500 μg·mL-1范圍內(nèi)羥基自由基清除力曲線斜率分別為0.025、0.019、0.025、0.033、0.095，而L-抗壞血酸的斜率為0.179。甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯提取物對(duì)羥基自由基的EC50分別為1 185.24、2 031.79、2 129.52和1 511.24 μg·mL-1，羥基自由清除率分別為L(zhǎng)-抗壞血酸的23.67%、13.81%、13.17%和18.56%。顯著性分析表明，同一溶劑提取物濃度下4種溶劑提取物的羥基自由基清除能力相互之間差異顯著，甲醇提取物的清除能力最強(qiáng)，丙酮提取物最弱。

2.2.4 超氧陰離子清除能力 由圖4可知，4種溶劑提取物對(duì)超氧陰離子均有一定的清除作用。甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯對(duì)超氧陰離子的EC50分別為477.37、490.90、221.38、991.71 μg·mL-1，其超氧陰離子清除能力分別是L-抗壞血酸的35.65%、34.67%、76.88%、17.16%。顯著性分析表明，同一溶劑提取物濃度下丙酮提取物的超氧陰離子清除能力最強(qiáng)，顯著高于其他3種提取劑，乙酸乙酯提取物最弱。

圖4 不同溶劑提取物的超氧陰離子清除率Fig.4 Superoxide anion scavenging rate of different solvent extracts

2.2.5 Fe2+的螯合能力 由圖5可知，4種溶劑提取物對(duì)Fe2+的螯合能力均隨溶劑提取物濃度的增加而逐漸加強(qiáng)，但均顯著低于1/10 濃度EDTA的螯合率。甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯提取物對(duì)Fe2+的螯合率達(dá)到50%時(shí)(EC50)濃度分別為270.31、363.31、321.68和886.24 μg·mL-1，得出4種溶劑提物物對(duì)Fe2+的螯合能力分別是EDTA的1.26%、0.94%、1.06%、0.38%。顯著性分析表明，當(dāng)溶劑提取物濃度介于200～500 μg·mL-1之間，4種溶劑對(duì)Fe2+的螯合力相互之間差異顯著，甲醇提取物對(duì)Fe2+的螯合能力最強(qiáng)，顯著高于其他溶劑，乙酸乙酯提取物最弱。

2.2.6 不同溶劑抗氧化活性比較 4種溶劑提取物的抗氧化能力占陽性對(duì)照的百分比見表2。綜合5個(gè)抗氧化指標(biāo)，4種溶劑提取物的抗氧化活性從大到小依次為丙酮＞乙醇＞甲醇＞乙酸乙酯

2.3 不同溶劑提取物中總黃酮、總酚含量與抗氧化性的相關(guān)性分析

設(shè)定甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯提取物的還原力為0.5時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為A0.5，DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子清除率和Fe2+的螯合率為50%時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度分別為EC501、EC502、EC503、EC504，將4種溶劑提取物的A0.5、EC501～4 與其總黃酮、總酚含量進(jìn)行相關(guān)性分析。由表3可知，總黃酮含量與總還原力、超氧陰離子清除率、Fe2+螯合率3個(gè)抗氧化指標(biāo)均呈正相關(guān)，與總還原力呈顯著相關(guān)；除DPPH自由基清除率外，其他4個(gè)抗氧化指標(biāo)與總酚含量呈正相關(guān)，但不顯著。上述結(jié)果表明，總黃酮和總酚均參與了抗氧化體系，總黃酮的抗氧化性更強(qiáng)?？傔€原力、超氧陰離子清除率與Fe2+的螯合率之間呈正相關(guān)關(guān)系，但均不顯著。

圖5 不同溶劑提取物對(duì)Fe2+的螯合率Fig.5 Fe2+ Chelating rate of different solvent extracts

表2 不同溶劑提取物的抗氧化能力占陽性對(duì)照的百分比Table2 Antioxidant percentage of different solvent extracts in positive control /%

表3 相關(guān)性分析結(jié)果Table3 Results of correlation analysis

3 討論

不同生物體產(chǎn)生自由基的種類和機(jī)理不同，因此，需要不同的抗氧化劑[16]。藥用植物成分種類多，極性不同，溶解性存在差異，需要多種提取溶劑進(jìn)行分級(jí)提取。本研究選用甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯4種常用溶劑作為廣東石豆蘭抗氧化物的提取劑，提取物均為混合物，成分復(fù)雜，難以用單一抗氧化指標(biāo)評(píng)價(jià)，故采用5種抗氧化評(píng)價(jià)體系[7，17-19]，盡可能全面、客觀地評(píng)價(jià)不同溶劑提取物的抗氧化性。

黃酮類和酚類化合物易溶于極性強(qiáng)的有機(jī)溶劑，不易溶于水[20]。本研究所用的4種有機(jī)溶劑極性大小順序?yàn)榧状迹疽掖迹颈疽宜嵋阴?，結(jié)果表明，4種溶劑對(duì)總黃酮和總酚提取效果不同，乙醇提取總黃酮的效果最好，甲醇對(duì)總酚的提取效果最好，而乙酸乙酯不利于2種成分的提取，這符合相似相容原理，如左龍亞等[21]用幾種溶劑提取檸檬果皮多酚時(shí)發(fā)現(xiàn)，甲醇作為提取劑時(shí)提取率最高，而乙酸乙酯提取多酚的效果差；而李現(xiàn)日等[9]研究表明，乙酸乙酯對(duì)金花葵花乙醇提取物中的黃酮萃取效果最好，說明金花葵花黃酮在乙酸乙酯中的溶解性大于乙醇。這可能是因?yàn)椴煌参飪?nèi)黃酮結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其溶解性不同。

不同植物體內(nèi)抗氧化成分不同，即存在不同的抗氧化體系。白芨醇提物的有效抗氧化活性(清除羥基自由基和DPPH自由基的能力，F(xiàn)e3+的還原力)成分主要集中在乙酸乙酯和氯仿萃取出來的中等極性物質(zhì)[22]。金線蓮乙醇總提取物依次經(jīng)石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取得不同極性部位對(duì)DPPH自由基、ABTS 自由基和羥基自由基都有不同程度的清除能力，其中乙酸乙酯部位的清除能力最強(qiáng)[23]。許海棠等[24]通過清除DPPH自由基、羥基自由基和ABTS 自由基的能力及還原力評(píng)價(jià)了青天葵氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和乙醇4種提取物的抗氧化性，得出乙酸乙酯提取物抗氧化性最強(qiáng)，乙醇提取物最弱。本研究結(jié)果表明，廣東石豆蘭4種溶劑提取物都具有一定的抗氧化活性，并呈一定的量效關(guān)系；不同提取物抗氧化途徑不同，甲醇提取物在清除羥基自由基和螯合Fe2+方面效果好；丙酮提取物具有很強(qiáng)的總還原力和清除超氧陰離子自由基能力；乙酸乙酯提取物清除DPPH自由基能力最強(qiáng)。本研究還分析了廣東石豆蘭提取物抗氧化大小與總黃酮、總酚含量的相關(guān)性，結(jié)果表明，總黃酮、總酚含量與總還原力相關(guān)性最大，尤其總黃酮含量與還原力的相關(guān)性達(dá)顯著水平。此外，2種成分均參與了清除超氧陰離子自由基、螯合Fe2+的兩條抗氧化途徑；總酚含量與清除羥基自由基的能力呈正相關(guān)，說明黃酮和酚是廣東石豆蘭中重要的抗氧化物質(zhì)，尤其是黃酮的抗氧化效果更好。潘瑤等[25]比較了葡萄、芒果、草莓乙醇提取物抗氧化活性成分與其抗氧化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)葡萄提取物中總酚和總黃酮含量最高，其抗氧化性也最強(qiáng)，說明黃酮和酚是多數(shù)植物中重要的抗氧化物質(zhì)。這可能與黃酮和酚結(jié)構(gòu)中得鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu)，使得黃酮和酚具有較強(qiáng)的捕捉自由基的能力，從而具有抗氧化活性有關(guān)?？寡趸钚詮?qiáng)弱與其含量、種類、結(jié)構(gòu)有關(guān)[26]，且不同植物中黃酮和酚所占的抗氧化地位不同，因此得到不同的研究結(jié)果。如張露等[27]對(duì)香榧5個(gè)部位醇提物的抗氧化性與總酚、總黃酮和縮合單寧含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)香榧中總酚含量與DPPH自由基、ABTS 自由基清除能力的相關(guān)性大。大果榕果實(shí)中多酚對(duì)DPPH自由基、ABTS 自由基和羥基自由基具有顯著的清除活性，并呈質(zhì)量濃度依賴性[28]；萌發(fā)青稞中多酚含量與抗氧化性呈顯著正相關(guān)，是抗氧化性的主要貢獻(xiàn)者[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，有些抗氧化指標(biāo)如DPPH自由基的清除能力與黃酮、酚含量呈負(fù)相關(guān)，根據(jù)5個(gè)指標(biāo)平均抗氧化能力得出，丙酮提取物的抗氧化活性最強(qiáng)，乙酸乙酯提取物的最弱，而丙酮提取物中黃酮和酚含量并非最高，以上結(jié)果均說明提取物中可能還存在其他抗氧化物質(zhì)，可以清除DPPH自由基，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

廣東石豆蘭體內(nèi)含有豐富的抗氧化物質(zhì)，并具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其體內(nèi)的黃酮、酚具有一定的抗氧化能力，但2種物質(zhì)參與的抗氧體系不同，即便同類物質(zhì)其抗氧化能力和方式也與已報(bào)道的研究結(jié)論不同，說明黃酮、酚存在結(jié)構(gòu)多樣性，且因不同植物存在較大差異，開展不用植物體內(nèi)的黃酮、酚等抗氧化物質(zhì)的提取、生理活性分析、結(jié)構(gòu)鑒定等研究具有重要意義。4種有機(jī)溶劑提取物抗氧化能力與總黃酮、總酚含量的相關(guān)性分析說明，除了黃酮和酚以外，還有其他重要的抗氧化物質(zhì)，主要存在于丙酮提取物中，后續(xù)可開展抗氧化物質(zhì)純品的分離鑒定及其他抗氧化體系的研究。綜上，廣東石豆蘭鱗莖可作為一種天然抗氧化物質(zhì)來源進(jìn)行開發(fā)利用。